郭文靜++蔣薇薇++鄭春光++何萬(wàn)里

摘 要：目的：建立穩(wěn)定的分離、純化新生昆明乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。方法：用含EDTA的0.125%胰蛋白酶消化1～2d內(nèi)的新生昆明乳鼠心肌組織，得到的細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)濾、差速貼壁、5-溴尿嘧啶相結(jié)合的方式純化后在含20%胎牛血清DMEM新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)果：14h后心肌細(xì)胞貼壁，呈圓形；48h后呈梭形，規(guī)律性搏動(dòng)。結(jié)論：本研究應(yīng)用的方法可以獲得成活率高、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的新生昆明小鼠心肌細(xì)胞，是一種穩(wěn)定的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法。

關(guān)鍵詞：乳鼠；心肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：R-322 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）06-0206-01

心肌細(xì)胞培養(yǎng)已成為研究心血管疾病發(fā)病機(jī)制的重要手段，穩(wěn)定的心肌細(xì)胞適于各種研究，已有的研究報(bào)道多采用新生大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)[1]，小鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)因分離困難及生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳等原因報(bào)道較少，故本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上[2]摸索新生昆明乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，最終建立了穩(wěn)定的小鼠心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，新生1～2d昆明小鼠乳鼠，雌雄不限。

1.2 新生昆明乳鼠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 取心肌組織

（1）在超凈工作臺(tái)外，將9只1-2日齡的新生昆明乳鼠埋入碎冰15s低溫麻醉；

（2）麻醉乳鼠放置超凈工作臺(tái)，75%的酒精擦拭消毒；

（3）無(wú)菌眼科剪在乳鼠胸腹部略左剪開(kāi)，切口約1cm，暴露心臟，舒張期取心??；

（4）剪下的心肌通過(guò)無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗3次。

1.2.2 消化心肌組織

（1）眼科剪將漂洗過(guò)的組織剪碎至1mm3；

（2）將剪碎小塊置于含轉(zhuǎn)子的無(wú)菌小瓶，加0.125%含EDTA的胰蛋白酶（gibco）約4mL，恒溫磁力攪拌器里37℃低速消化15min；重復(fù)以上操作4次，吸取上清液于含有胎牛血清的無(wú)菌離心管中終止消化，血清和酶溶液之比為1：10；

（3）收集的細(xì)胞懸液1000rpm離心5min；棄上清，37℃水浴過(guò)的含20%胎牛血清（HYCLONE）、80%DMEM/F-12（80%DMEM/F-12）的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

（4）200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。

1.2.3 心肌組織的鋪板、換液

（1）經(jīng)濾過(guò)的細(xì)胞懸液接種于六孔板，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育90min，通過(guò)差速貼壁，初步分離貼壁快的成纖維細(xì)胞和貼壁慢的心肌細(xì)胞；

（2）孵育后的培養(yǎng)液上清（大部分都是心肌細(xì)胞）種入24孔板的三個(gè)孔中，加5-溴尿嘧啶（sigma），終濃度為0.1mmol，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（3）36h后更換新鮮培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果

根據(jù)短時(shí)間多次消化的原則將心肌組織分離成單個(gè)的心肌細(xì)胞，并通過(guò)差速貼壁的物理方法和5-溴尿嘧啶殺成纖維細(xì)胞的化學(xué)方法相結(jié)合純化心肌細(xì)胞，純化后的心肌細(xì)胞鋪板，24h后更換新鮮培養(yǎng)基，36-48h間觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況（圖1）。倒置顯微鏡下觀察未貼壁的心肌細(xì)胞細(xì)胞呈圓形或橢圓形，1-2h后貼壁生長(zhǎng)，逐漸成梭形，多角形。一般數(shù)小時(shí)后即能出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)，培養(yǎng)2-3d可長(zhǎng)成單層并形成細(xì)胞簇，可觀察到培養(yǎng)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)同步搏動(dòng)。

3 討論

高效的心肌細(xì)胞培養(yǎng)是組織工程心血管相關(guān)研究的前提。新生小鼠在3d內(nèi)其心肌細(xì)胞都有增值能力，出生后時(shí)間越短其心肌細(xì)胞分離成活率越高，越易貼壁生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在前人方法學(xué)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，為了獲取更多有活性的心肌細(xì)胞，選擇在磁力攪拌器的幫助下多次短時(shí)間消化心肌組織；并通過(guò)200目濾網(wǎng)過(guò)濾、差速貼壁和5-溴尿嘧啶等方法純化心肌細(xì)胞。通過(guò)本研究可以建立穩(wěn)定的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Piper HM Jacobson SL， Schwartz P Determinants of cardiomyocyte development in long term primary culture[J].J M o l Cardiac.1988 20（9）：825-835.

[2]彭雙清，楊進(jìn)生.鐮刀菌毒素對(duì)心肌細(xì)胞膜電位的影響和硒的保護(hù)效應(yīng)[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2003，37（6）：423-425.