姚玉靜,陳嘉輝,尹文穎

(1.廣東食品藥品職業(yè)學院,廣東廣州 510520; 2.華南理工大學食品與工程學院,廣東廣州 510640)

固形物濃度對高鹽稀態(tài)醬油滋味物質(zhì)的影響

姚玉靜1,陳嘉輝2,尹文穎2

(1.廣東食品藥品職業(yè)學院,廣東廣州 510520; 2.華南理工大學食品與工程學院,廣東廣州 510640)

為了考察不同固形物濃度發(fā)酵(30%、33%、37%、41%)對高鹽稀態(tài)醬油滋味物質(zhì)的影響,研究了不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油氨基酸態(tài)氮、總氮、還原糖、總酸、游離氨基酸組成和肽分子量分布等滋味物質(zhì)的變化對醬油呈味特性的影響。結(jié)果表明,發(fā)酵固形物濃度越高,醬油鹽含量越低,保留的中性蛋白酶活力、氨基酸態(tài)氮、總氮、還原糖及總酸含量越高。對比不同固形物濃度發(fā)酵醬油的關(guān)鍵滋味物質(zhì)發(fā)現(xiàn),醬油肽分子量分布主要集中于1～5 ku(50%左右)和小于1 ku(30%～40%),1～5 ku肽段所占比例隨發(fā)酵固形物濃度的增大而提高,且具有呈味作用的游離氨基酸在高固形物濃度下得到提高。感官評價表明,37%固形物濃度下發(fā)酵的醬油鮮味、酸味最為突出,苦味最弱。整體上,提高固形物濃度使醬油的滋味更加濃郁。

醬油,固形物濃度,理化性質(zhì),肽分子量分布,氨基酸組成,滋味

醬油起源于我國,是大豆發(fā)酵制品中最重要的食品之一,主要是以大豆或豆粕等植物蛋白質(zhì)為原料,輔以面粉、小麥粉等淀粉質(zhì)原料,在曲霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶等酶系作用下,并經(jīng)乳酸菌、酵母等微生物的長期發(fā)酵,分解利用原料中的蛋白質(zhì)、淀粉、油脂等大分子物質(zhì),生成氨基酸、小分子肽、有機酸、還原糖、游離脂肪酸等小分子物質(zhì),并具有特有的色澤、香氣、滋味、體態(tài)的調(diào)味產(chǎn)品[1]。根據(jù)其生產(chǎn)方式的不同,主要分為低鹽固態(tài)和高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油。其中高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝是指在成曲中加入較多的鹽水(18%～20%),一般為成曲的2～2.5倍,使醬料成流動狀態(tài)發(fā)酵,具有高鹽、稀醪、低溫、周期長、品質(zhì)好的特點,其品質(zhì)與發(fā)酵濃度密切相關(guān)。發(fā)酵濃度會影響發(fā)酵過程中微生物的生長代謝、酶活力的變化及美拉德反應[2],從而影響醬油中各項理化指標的變化及游離氨基酸組成和肽分子量分布,并導致醬油的滋味差異。研究表明隨著固形物濃度增加,鹽水濃度降低,醬油的總氮、氨基酸態(tài)氮和總酸含量上升[3]。

滋味是衡量醬油質(zhì)量的重要指標,近年來國內(nèi)外對醬油風味的研究主要集中在醬油的香氣成分上[5],但研究固形物濃度對高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中滋味物質(zhì)形成的動態(tài)變化鮮見報道。本文以豆粕和面粉為原料發(fā)酵醬油,通過監(jiān)測醬油在不同固形物濃度下的鹽含量、中性蛋白酶活力、氨基酸態(tài)氮、總氮、還原糖、總酸、游離氨基酸組成和肽分子量分布規(guī)律,并結(jié)合感官評價,探討不同固形物濃度發(fā)酵對高鹽稀態(tài)醬油滋味物質(zhì)釋放的影響,為醬油發(fā)酵的代謝調(diào)控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滬釀3.042米曲霉曲精(Aspergillus oryzae) 石家莊市鼎鑫釀造食品科學研究所;面粉、豆粕、食鹽 市售;標準肽樣品:Conalbumin(75000 u)、Oralbumin(43000 u)、Cytochrome c(12384 u)、Aprotinin(6512 u)、Vitamin B12(1355 u)、Glutathione(307 u) 購于Sigma公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

UV-2100型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;KDN-102F型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;A300全自動氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司;高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵工藝 將豆粕置于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃蒸煮20 min,之后以干重80%的水充分潤濕豆粕,并于125 ℃蒸煮18 min,冷卻至40 ℃左右并將豆粕與面粉(豆粕∶面粉=4∶1)、曲精(曲精∶原料=0.4‰)混合均勻,30 ℃制曲48 h;將成曲與17%的鹽水分別按照1∶1.1、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5混合均勻,對應的固形物含量分別為41%、37%、33%、30%,各樣品分別標記為SS1.1、SS1.5、SS2.0、SS2.5,置于10 L塑料桶中,采用高鹽稀態(tài)醬油釀造方法(GB18186-2000)發(fā)酵60 d,定期攪拌。

1.2.2 取樣與貯存 將醬醪在8000 r/min冷凍離心20 min,并過濾后即得所需樣品,存放在-20 ℃冰箱待測。

1.2.3 鹽含量測定 參照GB18186-2000,采用硝酸銀滴定法。

1.2.4 蛋白酶活力的測定 參照SBT 10317-1999,1個酶活力單位(U)定義為1 g干重大曲中蛋白酶在pH 7.0,40 ℃條件下,1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 g 酪氨酸。

1.2.5 總氮的測定 參照GB 18186-2000,采用凱氏定氮法。

1.2.6 氨基酸態(tài)氮的測定 參照GB 18186-2000,采用甲醛滴定法。

1.2.7 還原糖測定 參考GB/T 5009.7-2008,采用堿性酒石酸銅溶液測定。

1.2.8 總酸的測定 參考總酸測定法原理,使用自動電位滴定儀進行測定。

1.2.9 水溶性分子肽的分子量分布 采用凝膠色譜法測定肽分子量分布。色譜條件如下:Waters 600高效液相色譜儀,TSK gel G2000SWXL分析柱,洗脫液為0.04 mol/L磷酸緩沖液,流速1 mL/min,檢測波長214 nm。相對分子質(zhì)量的對數(shù)值與洗脫體積擬合直線方程為y=-0.1547x+5.6431(R2=0.9957),其中,y為標準肽分子量的對數(shù);x為洗脫體積。

1.2.10 游離氨基酸含量的測定 氨基酸檢測條件:4 mL樣品與1 mL 15%的磺基水楊酸溶液混合均勻后于4 ℃下反應1 h,10000 r/min離心15 min,過濾,并用0.22 μm濾膜處理。用液相離子交換柱(TS263,membraPure)分離氨基酸,以茚三酮顯色,流速60 μL/min,脯氨酸在440 μm波長處檢測,其余檢測波長均為570 nm。各氨基酸濃度采用外標法計算。

1.2.11 感官評價分析 感官評價小組由6名20～25歲女性和7名25～30歲男性組成,感官評價使用定量描述分析(QDA)方法[6]。將各樣品的鹽含量調(diào)至相等后稀釋五倍與以下溶液比較打分。咸味:0.7%氯化鈉溶液;鮮味:0.35%谷氨酸鈉溶液;甜味:1%蔗糖溶液;酸味:0.08%檸檬酸溶液;苦味:0.5% L-異亮氨酸溶液。實驗在(23±2) ℃的感官評定室進行,0～9分制(無感覺-閾值感覺-微弱-中等-強烈),結(jié)果用雷達圖表示。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理 實驗結(jié)果為兩桶發(fā)酵樣的平均值,使用SPSS 16.0和Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油鹽含量的變化

由圖1可知,不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油的鹽含量不斷下降。發(fā)酵1 d時,各樣品的鹽含量由高到低依次是SS2.5>SS2.0>SS1.5>SS1.1,且差異顯著(p<0.05)。發(fā)酵前10 d各樣品鹽含量快速下降且有顯著性差異(p<0.05),發(fā)酵10～30 d鹽含量緩慢下降。這可能是由于在發(fā)酵前期,蛋白酶、淀粉酶等酶活性高,迅速將原料中大分子不溶物分解為氨基酸、小分子肽等可溶物,降低了食鹽在醬醪中的比例。

圖1 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油鹽含量的變化Fig.1 Changes of salt content in soy sauce under different solid concentrations fermentation

2.2 不同固形物濃度發(fā)酵過程中蛋白酶活力的變化

如圖2所示,樣品中性蛋白酶活力從高到低依次為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,發(fā)酵過程中各樣品蛋白酶活力均先快速下降后緩慢下降。發(fā)酵1 d時,樣品中性蛋白酶活力下降顯著(p<0.05),且各樣品降幅有較大差異。發(fā)酵10～60 d時,蛋白酶活力緩慢下降。

圖2 不同固形物濃度發(fā)酵過程中蛋白酶活力的變化Fig.2 Changes of protease activity in sauce mash under different solid concentrations fermentation

醬油發(fā)酵過程中蛋白酶活力與鹽含量有關(guān)。Su等[7]的研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶活力在18%鹽溶液中4 h后僅能保存3%。由圖2可知,發(fā)酵固形物濃度越大,鹽含量越低,越有利于中性蛋白酶活力的保存。

2.3 不同固形物發(fā)酵過程中醬油總氮的變化

由圖3可知,樣品中總氮含量由高到低依次為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,且有顯著性差異(p<0.05),發(fā)酵液的固形物濃度越高,發(fā)酵液中總氮含量也越高。發(fā)酵過程中,各樣品總氮含量則呈先快速增長后緩慢增長。發(fā)酵1 d時,較高固形物濃度的SS1.1總氮含量達到1.587 g/100 mL,是傳統(tǒng)固形物濃度發(fā)酵SS2.5的2.08倍。這可能是由于SS1.1加入的鹽水較少,導致SS1.1的醬液更濃稠。

圖3 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油總氮的變化Fig.3 Changes of total nitrogen in soy sauce under different solid concentrations fermentation

2.4 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油氨基酸態(tài)氮的變化

如圖4所示,樣品中氨基酸態(tài)氮的變化規(guī)律與總氮一致,均為先快速增長后緩慢增長,這一規(guī)律在Chen等[8]的研究中已有相似報道。整體上,各樣品中氨基酸態(tài)氮含量由高到低依次為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,且有顯著性差異(p<0.05)。發(fā)酵1 d時,SS1.1的氨基酸態(tài)氮含量達到0.664 g/100 mL,是SS2.5的2.2倍。發(fā)酵后50 d各樣品之間的氨基酸態(tài)氮增長速率差異不大,表明固形物濃度對醬油發(fā)酵中后期氨基酸態(tài)氮的增長速率無明顯影響。

圖4 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油氨基酸態(tài)氮的變化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen in soy sauce under different solid concentrations fermentation

2.5 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油還原糖的變化

如圖5所示,樣品中還原糖含量由高到低依次為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,且有顯著差異(p<0.05),表明提高固形物濃度發(fā)酵有利于大曲中糖類物質(zhì)的溶出。發(fā)酵過程中各樣品還原糖含量均先增加后降低且增加速率較下降速率大。發(fā)酵1 d時,固形物濃度最高的SS1.1還原糖含量達到4.16 g/100 mL,是傳統(tǒng)固形物發(fā)酵SS2.5的2.3倍。發(fā)酵30～60 d,各樣品還原糖下降速率為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,表明發(fā)酵固形物濃度越大,后期還原糖降低越快。還原糖含量下降與微生物代謝及美拉德反應有關(guān)。一般而言,醬油中氨基酸和還原糖濃度越大,美拉德反應越快,消耗還原糖的速率也越快。

圖5 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油還原糖的變化Fig.5 Changes of reducing sugar in soy sauce under different solid concentrations fermentation

2.6 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油總酸的變化

由圖6可知,樣品中總酸含量由高到低依次為 SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,且有顯著性差異(p<0.05),表明提高固形物濃度對醬油中總酸的生成有促進作用。發(fā)酵過程中各樣品總酸含量均先迅速增加后緩慢上升。這可能與乳酸菌、酵母菌以及其他耐鹽微生物發(fā)酵產(chǎn)酸有關(guān)。

表1 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油的肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of soy sauce under different solid concentrations fermentation

此外,美拉德反應產(chǎn)物也對發(fā)酵液的總酸有貢獻。發(fā)酵1 d時,SS1.1總酸含量即達到1.05 g/100 mL,是傳統(tǒng)固形物濃度發(fā)酵SS2.5的2倍。發(fā)酵前10 d總酸快速增長,這一規(guī)律與氨基酸態(tài)氮變化規(guī)律相似,表明發(fā)酵前期總酸成分可能主要是氨基酸。

圖6 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油總酸的變化Fig.6 Changes of total acid in soy sauce under different solid concentrations fermentation

2.7 不同固形物濃度發(fā)酵過程中醬油的肽分子量分布的變化

如表1所示,整個發(fā)酵過程中,大于10 ku肽段含量最少且所占比例不斷下降。同一發(fā)酵階段,大于10 ku肽段所占比例由大到小依次為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,與小于1 ku肽段恰好相反。表明在高固形物濃度發(fā)酵下,大分子量的肽段更易被保留。Hardt[2]認為這可能與高固形物濃度發(fā)酵中較高的粘度有關(guān)。高固形物濃度發(fā)酵的樣品粘度更高,這會限制酶和底物的移動范圍,并阻礙酶解產(chǎn)物從反應位點上的轉(zhuǎn)移,從而導致酶始終攻擊蛋白分子的外部,產(chǎn)生更多較長的肽段。5～10 ku肽段所占比例整體上變化不大,各樣品中所占比例的波動均在1%左右。

整體上肽分子量主要集中于1～5 ku肽段,所占比例在50%左右。當發(fā)酵固形物濃度為41%和37%時,1～5 ku肽段所占比例逐漸增大,從51%左右分別增長至55.51%和54.87%。當發(fā)酵固形物濃度為33%和30%時,1～5 ku肽段所占比例逐漸減小,從53%左右分別降至52.81%和50.41%,這同樣可能與粘度差異有關(guān)[2,9]。

Masashi[10]等研究表明1～5 ku肽的美拉德產(chǎn)物具有良好的風味增強效果。研究表明,醬油在經(jīng)過巴氏殺菌后,其味道改善較大[11],推測可能是1～5 ku肽的作用。Lioe的研究表明小于1 ku肽段是日本和印尼醬油中咸味鮮味的貢獻者[12],可見提高蛋白酶活力有利于通過增加小分子肽含量提升醬油風味和原料利用率。

2.8 不同固形物濃度發(fā)酵的醬油中游離氨基酸的組成

表2 不同固形物濃度發(fā)酵60 d后醬油的游離氨基酸組成Table 2 Free amino acids compositions of soy sauces with different solid concentrations after 60 days of fermentation

依據(jù)Schoenberger[13]和尹文穎[14]對氨基酸呈味的描述及呈味特性的分類,將游離氨基酸分為呈無味、鮮味、甜味、苦味及甜苦味這五類。由表2可知,各樣品中游離氨基酸含量由大到小依次為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,與圖4所示醬油氨基酸態(tài)氮的變化規(guī)律一致。其中發(fā)酵固形物濃度最高的醬油SS1.1其游離氨基酸的含量為132.75 mg/mL,比SS2.5、SS2.0和SS1.5分別高出68.37%、48.22%和14.84%。游離氨基酸主要是由蛋白酶和外肽酶水解蛋白質(zhì)和肽而產(chǎn)生[15],而整個發(fā)酵過程中,蛋白酶活力由高到低依次為SS1.1>SS1.5>SS2.0>SS2.5,因此發(fā)酵固形物濃度越高的醬油中游離氨基酸含量越高。

醬油的滋味是使用其調(diào)味的重要原因,氨基酸、小分子量的肽與其呈味密切相關(guān)。從表2可以看出,各樣品鮮味氨基酸占游離氨基酸總量的比例無明顯差異,SS1.1和SS1.5均略高于SS2.0和SS2.5。甜味氨基酸占游離氨基酸總量的比例差異明顯,SS1.5的最高,SS1.1次之,均比SS2.0和SS2.5高出1%。苦味氨基酸含量隨發(fā)酵固形物濃度的增大而減小,其中SS1.1最低,SS1.5稍高,SS1.1比SS2.0和SS2.5低了約2%。研究表明印尼和日本醬油的風味主要是由其鮮味成分決定,醬油中分子量小于500 u的成分和分子量較小的游離氨基酸可與鹽共同作用對醬油的風味有重要的作用[13,16]。結(jié)果表明,提高固形物濃度對鮮味氨基酸無顯著影響,卻提高了甜味氨基酸的含量,降低了苦味氨基酸的比例。

2.9 不同醬油滋味感官分析

由圖7可知,不同固形物濃度發(fā)酵醬油的風味有明顯差異,其中SS2.5整體上味道都比較淡;SS2.0有較好鮮味,但苦味較強;SS1.1的苦味最大;SS1.5的鮮味和酸味最突出,且苦味最弱。各樣品在甜味和咸味上相近。醬油的呈味特性與氨基酸組成、肽的分子量分布等多種因素有關(guān)。整體上,較高固形物濃度發(fā)酵的醬油SS1.5相對于傳統(tǒng)固形物濃度發(fā)酵的醬油風味更濃郁。

圖7 不同固形物濃度發(fā)酵的醬油滋味感官評定Fig.7 Comparison of sensory evaluation of soy sauces under different solid concentrations fermentation

3 結(jié)論

固形物濃度對醬油鹽含量和蛋白酶活力影響顯著(p<0.05)。整個發(fā)酵過程中,鹽含量和蛋白酶活力不斷降低,且固形物濃度越高,鹽含量越低,醬油的中性蛋白酶活力越高,越有利于原料的分解。各樣品的氨基酸態(tài)氮、總氮、還原糖及總酸含量均在發(fā)酵初期迅速增長,且受固形物濃度影響顯著(p<0.05)。發(fā)酵前期,高固形物濃度促進大曲中各類物質(zhì)的生成和溶出。發(fā)酵后期,高固形物濃度發(fā)酵的醬油中氨基酸態(tài)氮、總氮和總酸含量也更高,而還原糖下降速率卻更快。

不同固形物濃度下發(fā)酵的醬油其肽分子量分布集中于1～5 ku(50%左右)和小于1 ku(30%～40%)。同一發(fā)酵階段,高固形物濃度下發(fā)酵的醬油其大于10 ku肽段含量高于傳統(tǒng)固形物濃度發(fā)酵醬油,而小于1 ku肽段則相反。整個發(fā)酵過程中,高固形物濃度下,具有重要呈味作用的1～5 ku肽段所占比例增大,與傳統(tǒng)固形物濃度發(fā)酵相反。高固形物濃度促進了游離氨基酸的生產(chǎn)和溶出,對鮮味氨基酸無明顯影響,但增大了甜味氨基酸的含量,降低了苦味氨基酸的比例。

根據(jù)醬油中鹽、還原糖、總酸、小分子肽和呈味氨基酸等滋味物質(zhì)的差異,并結(jié)合感官評價,表明高固形物濃度發(fā)酵下SS1.5的鮮味、酸味最為突出,苦味最弱,相對于傳統(tǒng)固形物(30%)發(fā)酵的醬油風味更加濃郁。

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Effect of solid concentration on the taste of soy sauce with high salt liquid state fermentation

YAO Yu-jing1,CHEN Jia-hui2,YIN Wen-ying2

(1.Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,China; 2.College of Light Industry & Food,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

The effects of different solid concentrations on the taste of soy sauce with high salt liquid state fermentation were systematically analyzed by investigating the neutral protease activity,amino acid nitrogen,total nitrogen,reducing sugar,total acid,amino acids composition,molecular weight distribution and taste characteristic. Results showed that the higher solid concentration led to the lower salt content in soy sauce,which remained higher neutral protease activity,amino acid nitrogen,total nitrogen,reducing sugar and total acid. Compared with the key taste substance of soy sauces fermented under different solid concentrations,molecular weight of different soy sauces were mostly distributed in 1～5 ku(50%)and less than 1 ku(30%～40%). Furthermore,the peptides with 1～5 ku and flavor amino acids also improved under higher solid concentration fermentation. The Quantitative Description Analysis(Qu)showed that the umami and sour taste were strongest in soy sauce under solid concentration of 37%,while the bitterness was the weakness. Thus,soy sauce fermented under high solid concentration efficiently improved the taste.

soy sauce;solid concentration;physicochemical properties;distribution of peptide molecular weight;amino acid composition;tastes

2016-10-01

姚玉靜(1979- )，女，碩士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)、食品檢測,E-mail：yaoyj@gdyzy.edu.cn。

廣東省高等學校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目(Yq2013184)。

TS264.2+1

A

1002-0306(2017)08-0133-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.018