何嵐　王柳懿　朱琪　喬家運(yùn)　王文杰

摘 要：利用分光光度法和活菌計數(shù)法對大腸桿菌O78和枯草芽孢桿菌CGMCC 1.504的生長曲線進(jìn)行測定，并根據(jù)兩種方法在細(xì)菌對數(shù)生長期的線性關(guān)系，篩選相關(guān)系數(shù)最大的吸光度。結(jié)果表明：大腸桿菌O78培養(yǎng)中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數(shù)生長期，12～20 h為穩(wěn)定期，20 h以后進(jìn)入衰亡期?？莶菅挎邨U菌CGM培養(yǎng)中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數(shù)生長期，12～18 h為穩(wěn)定期，18 h以后進(jìn)入衰亡期。在兩種細(xì)菌的對數(shù)生長期，分光光度計測出不同吸光度下的OD值和活菌計數(shù)法測得的細(xì)菌數(shù)都表現(xiàn)出一定的線性關(guān)系，且在吸光度為630 nm時，O78和CGM的OD值和活菌數(shù)相關(guān)系數(shù)最大（R2O78 = 0.991 2，R2CGM = 0.990 4），相關(guān)程度最高。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；大腸桿菌；生長曲線；分光光度法；活菌計數(shù)法

中圖分類號：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.004

Abstract： Escherichia coli O78 and Bacillus subtilis CGMCC 1.504 growth curves were determined by spectrophotometric method and viable count method，using the linear relationship of two methods in logarithmic growth period of bacteria to select the absorbance maximum of the correlation coefficient. The results showed that 0～2 h was in the lag phase； 2～12 h was in logarithmic growth phase in the cultivation of Escherichia coli O78； 12～20 h was stable， after 20 h O78 entered into decline phase. In the cultivation of Bacillus subtilis CGM， 0～2 h was in the lag phase； 2～12 h was in logarithmic growth phase； 12～18 h was stable， after 18 h CGM entered into decline phase. In logarithmic growth phase of two germs， the number of bacteria was measured by OD value in different absorbance and the number of live bacteria measured by viable counting method showed a linear relationship. Besides， in absorbance of 630 nm， the OD value of O78 and CGM were related to the highest degree with live bacteria， and the correlation coefficient maintained maximum （R2O78 = 0.991 2， R2CGM = 0.990 4）.

Key words： Bacillus subtilis； Escherichia coli； growth curve； spectrophotometry； viable counting method

禽致病性大腸桿菌（Escherichia coli）O78在禽類腸道中廣泛存在，易引起雞及其它禽類的腸道炎癥及腸外疾病，如心包炎、氣囊炎、肝周炎等，甚至引起敗血癥而導(dǎo)致急性死亡[1-2]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）CMCC1.504是飼料中常添加的益生菌，在動物體內(nèi)可產(chǎn)生各類酶，如α-淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶等[2]，利用枯草芽孢桿菌制備發(fā)酵飼料，可將飼料中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸、小肽和多肽類等物質(zhì)?？莶菅挎邨U菌中蛋白酶、淀粉酶的活性很高，可以促進(jìn)動物機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而促進(jìn)生長發(fā)育，提高飼料利用率?？莶菅挎邨U菌的芽孢體易保存，能耐受極酸或高溫環(huán)境，可在適宜的條件下將粗纖維、非蛋白氮和寡糖等不易消化吸收的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)的菌體蛋白，因此，在生產(chǎn)實踐中常用作飼料發(fā)酵菌種[3-5]。

本試驗利用分光光度法和活菌計數(shù)法分別測定大腸桿菌O78和枯草芽孢桿菌CGMCC 1.504的生長性能，得到在不同吸光度下培養(yǎng)液的OD值和活細(xì)菌數(shù)，繪制二者的生長曲線，并對根據(jù)兩種測定方法所繪制的生長曲線進(jìn)行比較分析。此外，利用兩種計數(shù)方法繪制出線性回歸方程，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)確定最佳吸光度，從而可以更深入地了解兩種細(xì)菌的生長繁殖規(guī)律和生理特性，這對根據(jù)不同需要有效地利用和控制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌種：大腸桿菌O78和枯草芽孢桿菌CGMCC1.504（以下簡稱CGM）由天津市畜牧獸醫(yī)研究所微生物實驗室保藏。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL（加固體瓊脂粉20 g），調(diào)pH值7.0，121 ℃下高壓滅菌15 min，備用。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：取麥康凱52 g，加熱溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃下高壓滅菌15 min，備用。

肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃下高壓滅菌15 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 O78和CGM 種子液的培養(yǎng) 將保存于斜面的大腸桿菌O78接一菌環(huán)到肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r·min-1，培養(yǎng)16～18 h，置于冰箱4 ℃保存，備用。

將保存于斜面的枯草芽孢桿菌CGM接一菌環(huán)到液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r·min-1，培養(yǎng)16 ～18 h，置于冰箱4 ℃保存，備用。

1.2.2 O78和CGM不同生長時間培養(yǎng)液的收集 試驗分為A、B兩組，每組按照培養(yǎng)時間的不同分別取14個時間點(diǎn)。具體分組方法如下：取30個150 mL已滅菌的錐形瓶，其中A組15瓶裝入20 mL液體LB培養(yǎng)基，B組15瓶裝入20 mL肉湯培養(yǎng)基，從兩組中各取一瓶標(biāo)注為KA和KB，作為空白對照。將A組14個錐形瓶裝入CGM培養(yǎng)液0.32 mL（接種量1.6%）[6]，B組14個錐形瓶裝入O78培養(yǎng)液0.2 mL（接種量1%），震蕩搖勻后，分別標(biāo)記為0，1，2，3，4，6，8，10，12，14，16， 18，20， 24。將標(biāo)有KA、KB和0的錐形瓶取出，立即放入4 ℃冰箱，保存?zhèn)溆谩⑵溆嘁呀尤肱囵B(yǎng)液的26個錐形瓶于37 ℃，150 r·min-1震蕩培養(yǎng)，相應(yīng)時間后取出錐形瓶，放入4 ℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 O78和CGM不同生長時間培養(yǎng)液OD值的測定 以無菌的液體培養(yǎng)基KA、KB作空白對照，在600 nm波長下，用光程1 cm的比色皿通過比濁法測定O78和CGM不同生長時間培養(yǎng)液的OD值。分別于培養(yǎng)的0，1，2，3，4， 6，8，10，12， 14，16，18，20，24 h時取出3 mL菌液，分別測定450，490，570，600，630，650 nm吸光度下的OD值，每個時間點(diǎn)重復(fù)測定3次取其平均值。

1.2.4 活菌總數(shù)計數(shù) 采用平板計數(shù)法，將菌液逐級稀釋，分別稀釋至10-5，10-6，10-7，10-8，10-9混勻，取400 L涂平板，37 ℃，培養(yǎng)24～36 h，選取菌落數(shù)30～300為有效計數(shù)平皿，進(jìn)行計數(shù)。依照下式計算出O78和CGM各生長時間的細(xì)胞密度（cfu·mL-1）：

CFU=（C÷V）×M

式中：C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂平板時所用稀釋液的體積，M代表稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 O78和CGM不同吸光度下培養(yǎng)液的OD值和活菌數(shù)

O78和CGM不同吸光度下培養(yǎng)液的OD值和活菌數(shù)見表1、表2。

2.2 O78不同吸光度培養(yǎng)液的OD值培養(yǎng)時間的關(guān)系

以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，作O78的生長曲線，結(jié)果如圖1。

2.3 CGM不同吸光度培養(yǎng)液的OD值培養(yǎng)時間的關(guān)系

以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，作CGM的生長曲線，結(jié)果如圖2。

2.4 O78和CGM的活菌數(shù)和時間的關(guān)系

以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)為縱坐標(biāo)，作O78和CGM的生長曲線，結(jié)果如圖3。

2.5 不同吸光度O78和CGM在對數(shù)生長期的OD值與活菌數(shù)的函數(shù)關(guān)系

以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪出不同吸光度下兩者間的回歸曲線。 O78不同吸光度下的回歸方程見圖4，CGM不同吸光度下的回歸方程見圖5。結(jié)果表明，在吸光度為630 nm時，O78和CGM的OD值和活菌數(shù)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性（R2O78 = 0.991 2，R2CGM =0.990 4），相關(guān)系數(shù)最大。

3 結(jié)論與討論

生長曲線是描述生物生長繁殖變化的曲線[7]。以細(xì)菌的培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、以其數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長曲線。細(xì)菌生長曲線的繪制方法有很多，有血細(xì)胞計數(shù)法、活菌計數(shù)法、稱重法、分光光度法等。其中應(yīng)用最廣泛的主要有分光光度法和活菌計數(shù)法兩種。分光光度法是通過一定的吸光度測定菌液的OD值，測得的菌液中包含的是總菌數(shù)，該方法操作簡便，耗時較短?；罹嫈?shù)法得出的是菌液中的活菌數(shù)，其結(jié)果較分光光度法要準(zhǔn)確得多，但操作復(fù)雜且耗時、耗力。因此，將兩種方法結(jié)合起來，在使試驗方法變得更簡便的同時也能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，就顯得尤為關(guān)鍵。

在嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件的前提下，可通過測定培養(yǎng)液的OD值來推算對數(shù)生長期的活菌數(shù)，代替活菌計數(shù)法。在生產(chǎn)實踐中也可以將細(xì)菌OD值作為判斷細(xì)菌是否進(jìn)入對數(shù)生長期的依據(jù)[8]。利用分光光度法和活菌計數(shù)法測定細(xì)菌的生長曲線，在停滯期和對數(shù)期測定的結(jié)果基本一致[8-9]。對于某些細(xì)菌而言，這兩種計數(shù)方法繪制的生長曲線有很好的相關(guān)性[10-12]。分光光度法測定的是細(xì)菌總數(shù)，而活菌計數(shù)法測定的是活菌數(shù)。因此，進(jìn)入穩(wěn)定期后兩種方法的測定結(jié)果顯著不同[13]。

生長曲線反映了細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所表現(xiàn)出的生長規(guī)律和繁殖特點(diǎn)。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下生長曲線會有不同，即使是同一種細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同[14]。王升智等[15]研究表明：重組大腸桿菌DH5α的生長經(jīng)歷了遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個時期，符合細(xì)菌生長的規(guī)律；重組大腸桿菌生長至平臺期時提取質(zhì)粒的量最多。熊海燕等[16]采用濁度法測量發(fā)酵液濃度，確定波長為560 nm，以新鮮蘋果汁、柑橘汁為原料，進(jìn)行生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)菌種的生長規(guī)律基本保持同一性。李麗等[17]采用分光光度法測定產(chǎn)氨短桿菌不同生長時間的生長曲線圖，同時利用活菌菌落計數(shù)法繪出生長曲線進(jìn)行進(jìn)一步驗證。結(jié)果表明：產(chǎn)氨短桿菌在適宜生長條件下經(jīng)歷遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個時期，符合細(xì)菌生長的規(guī)律。

本試驗結(jié)果表明，大腸桿菌O78培養(yǎng)中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數(shù)生長期，12～20 h為穩(wěn)定期，20 h以后進(jìn)入衰亡期?？莶菅挎邨U菌CGM培養(yǎng)中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數(shù)生長期，12～18 h為穩(wěn)定期，18 h以后進(jìn)入衰亡期。O78 和CGM培養(yǎng)液在不同吸光度下的OD值和活菌數(shù)在對數(shù)生長期均表現(xiàn)出很好的相關(guān)性，且在吸光度為630 nm時，O78和CGM的OD值和活菌數(shù)相關(guān)系數(shù)最大（R2O78 = 0.991 2，R2CGM =0.990 4 ），相關(guān)程度最高，在此處依據(jù)OD值推測出的活菌數(shù)也更加接近實際活菌數(shù)。

通過分光光度法和活菌計數(shù)法在對數(shù)生長期求得的回歸方程，可以更加準(zhǔn)確地推測出細(xì)菌在對數(shù)生長期的準(zhǔn)確活菌數(shù)，避免了繁重的試驗步驟。

參考文獻(xiàn)：

[1]王少輝，戴建君，陸承平.禽致病性大腸桿菌研究進(jìn)展[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報，2010，24（4）：70-74.

[2]羅玲，艾地云，楊峻，等.湖北省部分地區(qū)鴨致病性大腸桿菌的分離和血清型鑒定[J].中國家禽，2009，31（8）：44-45.

[3]吳暉，卓林霞，解檢清，等.發(fā)酵條件對枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕中的蛋白酶活力的影響[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（10）：973-976.

[4]HONG H A，DUC L H，CUTTING S M.The use of bacterial spore formers as probiotics[J]. FEMS microbiology reviews， 2005，29（4）：813-835.

[5]付小猛，趙述淼，梁運(yùn)祥，等.一株飼用枯草芽孢桿菌CCAM 080032固態(tài)發(fā)酵工藝的研究[J].飼料工業(yè)，2010，31（22）：43-46.

[6]董文豪，史慧玲，郝曉鳴，等.枯草芽胞桿菌發(fā)酵對玉米干酒糟氨基酸組成的影響及發(fā)酵條件研究[J].飼料工業(yè)， 2015， 36（9）：17-21.

[7]王宏偉.生長曲線預(yù)測新模型[J].中州大學(xué)學(xué)報，1994（2）：74-78.

[8]陶令霞，夏鐵騎，?；燮?兩種測定固氮菌NT06菌株生長曲線方法的比較[J].生物學(xué)雜志，2007，24（5）：57-58.

[9]謝三磊，姚東璧，李復(fù)煌，等.副雞禽桿菌A，B，C 三個血清型參考菌株生長曲線的測定和比較[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2014， 35（7）：43-46.

[10]李穎，楊帆，胡付品，等.肺炎鏈球菌適應(yīng)性評價的方法學(xué)探索[J].中國感染與化療雜志，2010，10（3）：194-199.

[11]胡濱，彭彥峰，吳兆亮.D-核糖發(fā)酵液中生長曲線的吸光測定及細(xì)胞濃度與吸光度函數(shù)關(guān)系[J].河北工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，32（4）：41-44.

[12]黃紅壘，徐建國，蔣秀高，等.鉤端螺旋體對數(shù)生長期的測定[J].中國人獸共患病雜志，2002，18（3）：60-63.

[13]任曉燕，剡根強(qiáng)，周霞.糞腸球菌生長曲線的測定[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2005，24（6）：10-11.

[14]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗[M].3版.北京：高等教育出版社，1999.

[15]王升智，高波，周智慧，等.重組大腸桿菌DH5α生長曲線的測定[J].獸醫(yī)科技，2010（11）：96-98.

[16]熊海燕，李瑩.不同果汁發(fā)酵液中酵母菌生長曲線的測定及pH值的變化[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2009，4（4）：26-27.

[17]李麗，楊澤賢，王素霞，等.產(chǎn)氨短桿菌生長曲線的測定[J].飼料研究，2015（1）：71-73.