劉長(zhǎng)芳,吳翠嬌,李慧,張靜

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，＊青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266000)

自然殺傷性T淋巴細(xì)胞數(shù)量分布變化與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

劉長(zhǎng)芳,吳翠嬌,李慧＊,張靜＊

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，＊青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266000)

目的探討自然殺傷性T細(xì)胞的數(shù)量分布變化與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。方法采用鼠抗人CD3、CD56單克隆抗體雙重免疫法，正常肝臟組織及不同分期肝癌組織中自然殺傷T淋巴細(xì)胞的數(shù)量及分布情況，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析自然殺傷性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量分布變化與肝癌細(xì)胞遷移的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS20.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)。結(jié)果各分期肝癌組織中自然殺傷性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與正常肝組織內(nèi)自然殺傷性T細(xì)胞的數(shù)量比較，P＜0.0005,肝癌Ⅰa期-Ⅱa期與Ⅱb期-Ⅲb期的自然殺傷性T細(xì)胞數(shù)量比較，P＜0.005。結(jié)論肝癌組織中自然殺傷性T細(xì)胞的數(shù)量依賴于組織被癌細(xì)胞侵襲的程度不同而分布不同，肝臟的微環(huán)境影響自然殺傷性T細(xì)胞的分化，自然殺傷性T細(xì)胞數(shù)量與肝癌轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。

肝癌;自然殺傷性T細(xì)胞;免疫組化

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)2012年全球約有78.2萬例肝癌新發(fā)病例，其中83%發(fā)生在發(fā)展中國家，中國占50%[1]，發(fā)病率為28.17/105，占所有惡性腫瘤的第4位(10.04%)，而死亡率為26.04/105，占所有癌癥死亡的第2位[2]。肝癌起病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法,確診后缺乏有效的治療方法，肝癌患者的高復(fù)發(fā)率和低生存率，仍是臨床研究的重點(diǎn)內(nèi)容。肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機(jī)制非常復(fù)雜，細(xì)胞免疫在抗腫瘤過程中具有特殊重要的地位，在細(xì)胞免疫中已知的效應(yīng)細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、自然殺傷細(xì)胞（NK）及巨噬細(xì)胞。自然殺傷性T淋巴細(xì)胞（NKT細(xì)胞）因同時(shí)具有NK細(xì)胞和T細(xì)胞部分表型及功能的細(xì)胞亞群，越來越受到重視。NKT細(xì)胞在先天性免疫和獲得性免疫之間起到橋梁的作用[3]，這些細(xì)胞可以同時(shí)識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體CD1分子[4-6]，活化后迅速分泌大量細(xì)胞因子，直接或間接參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[7]，從而使機(jī)體處于某些疾病的康復(fù)或發(fā)展?fàn)顟B(tài)。另外，很多研究認(rèn)為NKT細(xì)胞的數(shù)量和功能變化與動(dòng)物和人類的疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。肝臟是含自然殺傷性T淋巴細(xì)胞最多的器官，約占肝臟T淋巴總數(shù)的20%～30%，并在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，NKT細(xì)胞可以通過產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和直接殺傷作用促進(jìn)肝臟的損傷，另外NKT細(xì)胞可以通過抑制肝星狀細(xì)胞的激活來抑制肝纖維化，還可以通過增強(qiáng)肝臟的炎癥和損傷促進(jìn)肝纖維化，通過激活NKT細(xì)胞可以抑制肝臟再生，在肝癌中NKT細(xì)胞在控制腫瘤的進(jìn)展中既能發(fā)揮抗腫瘤作用也能產(chǎn)生促瘤效應(yīng)[8]。NKT細(xì)胞的這種雙向免疫調(diào)節(jié)作用越來越引起學(xué)術(shù)界的興趣，為此、我們對(duì)不同分期的肝癌中NKT細(xì)胞數(shù)量及分布變化?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及來源收集我院肝膽外科、普外科正常肝組織15例，根據(jù)全國肝癌協(xié)會(huì)會(huì)議擬定的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期18例，其中Ⅰa期10例，Ⅰb期8例;Ⅱ期21例，其中Ⅱa期10例，Ⅱb期11例；Ⅲ期25例，其中Ⅲa 13例，Ⅲb期12例。

1.2 材料

1.2.1 試驗(yàn)材料小鼠抗人CD3單抗(即用型CST公司生產(chǎn))；小鼠抗人CD56單抗體(即用型CST公司生產(chǎn))；羊抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(即用型CST公司生產(chǎn));3%過氧化氫溶液;pH7.2-7.4的PBS磷酸鹽緩沖液；pH9.0的EDTA（乙二胺四乙酸鈉）抗原修復(fù)液；AEC顯色系統(tǒng)(solarbio公司)，使用時(shí)按說明書配制；水溶性封片劑；免疫組織化學(xué)專用濕盒;免疫組織化學(xué)專用抗原修復(fù)架及修復(fù)盒。

1.2.2 方法所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定石蠟包埋，連續(xù)4μm切片，脫蠟、水化，EDTA緩沖液抗原修復(fù)、PBS緩沖液漂洗，切片滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗，避光孵育10～15分鐘，采用小鼠抗人CD3單克隆抗體、小鼠抗人CD56單克隆抗體聯(lián)合雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記，以AEC顯色系統(tǒng)顯色，顯色充分后入雙蒸水阻斷顯色反應(yīng)，用蘇木精復(fù)染2～3分鐘后封片。然后分別計(jì)數(shù)在正常肝臟組織、不同分期肝癌組織中NKT細(xì)胞的數(shù)量及分布情況，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各組數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS20.0軟件所獲數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組形態(tài)學(xué)結(jié)果實(shí)驗(yàn)中能同時(shí)表達(dá)CD3、CD56抗原分子的淋巴細(xì)胞為陽性NKT細(xì)胞，典型NKT細(xì)胞形態(tài)特征為棕褐色的細(xì)胞膜周圍附著鮮紅色的顆粒狀沉積，正常組肝組織，Ⅰa-Ⅱa期、Ⅱb-Ⅲb期NKT細(xì)胞染色結(jié)果見圖1、圖2、圖3。肝癌隨病程進(jìn)展肝臟內(nèi)環(huán)境變化NKT細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，箭頭指示為NKT細(xì)胞。e、f晚期肝癌NKT細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步下降，視野內(nèi)NKT數(shù)量很少。

圖1：正常組肝組織

圖1：箭頭所指為NKT細(xì)胞（×200）

圖3：不同期肝癌鏡下表現(xiàn)

2.2 不同分期肝癌中NKT細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系見表1。

表1 不同分期肝癌中NKT細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系

表1 不同分期肝癌中NKT細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系

正常肝組織組與肝癌Ⅰa-Ⅱa組NKT細(xì)胞比較，t= 6.2141,P＜0.0005;正常肝組織組與肝癌Ⅱb-Ⅲb組NKT細(xì)胞比較，t=5.9873,P＜0.0005;Ⅰa-Ⅱa組與Ⅱb-Ⅲb組NKT細(xì)胞比較，t=2.7733，P＜0.0005。

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3 討論

肝臟是一個(gè)獨(dú)特的免疫器官，肝臟的慢性炎癥和相關(guān)的再生愈合反應(yīng)與肝纖維化、肝硬化、肝癌息息相關(guān)[9]，NKT細(xì)胞在肝臟的傾向性分布說明NKT細(xì)胞在肝臟免疫調(diào)節(jié)中具有極其重要的作用。自然殺傷性T淋巴細(xì)胞根據(jù)TCR表達(dá)的穩(wěn)定性分為三型，Ⅰ型NKT細(xì)胞TCR Vα鏈高度穩(wěn)定，其表型小鼠為Va14，人的為Vα24和Jα18，同時(shí)表達(dá)Vβ鏈。Ⅱ型和Ⅲ型缺乏恒定的TCR，具有多樣性。Ⅰ型NKT細(xì)胞在腫瘤免疫過程中既發(fā)揮免疫保護(hù)的作用也具有免疫抑制的功能，Ⅰ型NKT細(xì)胞在腫瘤免疫過程中的雙向調(diào)節(jié)作用，可能與Ⅰ型NKT細(xì)胞即表達(dá)Thl型細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-2，發(fā)揮免疫保護(hù)作用，也可以表達(dá)ThⅡ型細(xì)胞因子如IL-13、IL-14在腫瘤免疫中發(fā)揮抑制作用，因此，不同組織中的NKT細(xì)胞，由于所處的細(xì)胞微環(huán)境不同，導(dǎo)致占主導(dǎo)地位的細(xì)胞類型也不同，分泌的細(xì)胞因子也不同，從而表現(xiàn)出不同的免疫效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型NKT細(xì)胞之間不僅具有相反的作用還能發(fā)揮相互調(diào)節(jié)的作用[10]。由自糖脂或溶血磷脂介導(dǎo)的II型NKT細(xì)胞的活化過程揭示了Ⅰ型與Ⅱ型NKT細(xì)胞交叉調(diào)節(jié)的主要機(jī)制。在硫苷脂的作用下，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞，而非傳統(tǒng)的樹突狀細(xì)胞的CD1d表達(dá)明顯上調(diào)，導(dǎo)致了硫酯反應(yīng)II型NKT細(xì)胞的活化和IL-12及MIP-2的分泌，從而致使I型NKT細(xì)胞被招募到肝臟[11]。一般來說，NKT細(xì)胞在腫瘤免疫中扮演重要得雙重角色，他們能夠通過效應(yīng)CD4/CD8+細(xì)胞激活來促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)，還可以通過招募促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)抑制或調(diào)解T細(xì)胞耐受或產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子，隨后導(dǎo)致腫瘤抗原CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)張[12]。抑制細(xì)胞因子爆發(fā)和抑制中性粒細(xì)胞招募到肝臟的作用導(dǎo)致了硫脂介導(dǎo)的II型NKT細(xì)胞的活化。在此活化作用下，無反應(yīng)性I型NKT細(xì)胞和IL-10分泌型漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞能夠抑制適應(yīng)性免疫[13]。隨著研究的深入NKT細(xì)胞選擇分化和成熟過程及其調(diào)控研究有了很大的進(jìn)展。肝臟微環(huán)境中Wnt信號(hào)通路激活可引起NKT細(xì)胞失能[14]。這些特點(diǎn)也說明NKT細(xì)胞以雙刃劍的方式調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。在腫瘤患者體內(nèi)擴(kuò)增NKT細(xì)胞研究表明患者體內(nèi)應(yīng)用α-Galcer后NKT數(shù)目明顯增加，從而起到抗腫瘤的作用[15,16],但αGalcer短時(shí)間內(nèi)可觀察到大量Thl型(如IL-2、TNF-α和IFN-γ等)和Th2型(如IL-4、IL-5和IL-10等)細(xì)胞因子的釋放，并且NKT細(xì)胞表面CD69等成熟分子標(biāo)志物上調(diào)。但在細(xì)胞因子釋放高峰之后，再次給予aGalCer的刺激，NKT細(xì)胞將毫無反應(yīng)，不能再分泌細(xì)胞因子，處于失活狀態(tài)，即“失能”。研究證實(shí)，β-ManCer能激活NKT細(xì)胞并且不會(huì)導(dǎo)致其失能，即使重復(fù)使用仍可刺激NKT細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng),不會(huì)引起NKT細(xì)胞內(nèi)PD-1因子上調(diào)[17]，這有別于aGalCer。因此，β-ManCer可以代替aGalCer成為NKT細(xì)胞更好的激動(dòng)劑。這為過繼細(xì)胞免疫治療提供了新的思路。M singh[18]等研究認(rèn)為NKT活化劑α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺可以增強(qiáng)Listeria乳腺癌疫苗的功效，且無毒副作用。發(fā)現(xiàn)刺激NKT細(xì)胞可以提高部分肝切除術(shù)后的肝再生[19]。在應(yīng)用iKNT細(xì)胞治療晚期黑色素瘤的I期臨床試驗(yàn)中指出通過自體體外擴(kuò)增iNKT細(xì)胞治療晚期黑色素瘤是安全有效的[20]。隨著研究的深入，NKT細(xì)胞的臨床應(yīng)用越來廣泛。

因此，我們的試驗(yàn)主要探尋在不同分期肝癌中的NKT細(xì)胞數(shù)量分布變化，從間接闡明NKT細(xì)胞與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。正常肝臟組織內(nèi)淋巴細(xì)胞多集中在肝血竇內(nèi)，早期肝癌大量淋巴細(xì)胞隨癌細(xì)胞的擴(kuò)散浸潤至肝組織內(nèi)，隨病程進(jìn)展肝臟內(nèi)環(huán)境變化NKT細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，晚期肝癌NKT細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步下降，視野內(nèi)NKT數(shù)量很少。正常肝組織與各分期肝癌NKT細(xì)胞數(shù)量有明顯差異（P＜0.05），各分期肝癌中Ⅰa期-Ⅱa期與Ⅱb期-Ⅲb期的NKT細(xì)胞數(shù)量有明顯差異（P＜0.05）。因此，我們認(rèn)為肝癌組織中NKT細(xì)胞的數(shù)量依賴于組織被癌細(xì)胞侵襲的程度不同而分布不同，NKT淋巴細(xì)胞數(shù)量與肝癌轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，肝臟的微環(huán)境直接影響NKT淋巴細(xì)胞的分化。

[1]International Agency for Research on Cancer.GLOBOCAN 2012：Estimated cancer incidence,mortality and prevalence worldwide in 2012,2014[EB/OL]. [2014-12-16].http：//golbocan.iarc.fr/Defqult.aspx.

[2]Wanqing Chen PhD MD，Rongshou Zheng MPH，Peter D.Baade,PhD,et al. Cancer Statistics in China,2015[J].CA CANCER J CLIN 2016,66（2）：115-132.

[3]Taniguchi M,Seino K,Nakayama T.The NKT cell system：bridging innate and acquired immunity[J].Nat Immunol,2003,4：1164-1165.

[4]Bendelac A,Savage PB,Teyton L.The biology of NKT cells[J].Annu Rev Immunol,2007,25：297-336.

[5]Godfrey DI,Stankovic S,Baxter AG.Raising the NKT cell family[J].Nat Immunol,2010,11：197-206.

[6]Brigl M,Brenner MB.CD1：antigen presentation and T cell function[J].Annu Rev Immunol,2004,22：817-890.

[7]Bendelac A,Savage P B,Teyton L.The biology of NKT cells[J].Annu Rev Immunol,2007,25：297-336．

[8]Hua wang Shi yin.Natural killer T cells in liver injury,inflammation and cancer [J].Expert Rev.Gastroenterol.Hepatol.2015,9(8)：1-9.

[9]Luedde T,Schwabe RF.NF-kappa B in the liver-linking injury,fibrosis and hepatocellular carcinoma[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2011,8：108-118.

[10]Ambrosino E，Terabe M，Halder RC，et a1．Cross-regulation between type I and type II NKT cells in regulating tumor immunity：a new immunoregulatory axis[J]．J Imunol,2007,179(8)：5126-5136．

[11]Halder RC,Aguilera C,Maricic I,et al.Type II NKT cell-mediated anergy induction in type I NKT cells prevents inflammatory liver disease[J].J Clin Invest,2007,117：2302-2312.

[12]Bricard G,Cesson V,Devevre E,et al.Enrichment of human CD4+V(alpha)24/ Vbeta11 invariant NKT cells in intrahepatic malignant tumors[J].J Immunol, 2009,182：5140-5151.

[13]Maricic I,Sheng H,Marrero I,et al.Chaturvedi S et al.Inhibition of type I natural killer T cells by retinoids or following sulfatide-mediated activation of type II natural killer T cells attenuates alcoholic liver disease in mice[J].Hepatology,2015,61：1357-1369.

[14]Deng ZB，Zhuang X，Ju S，el a1．Intestinal mucus-derived nanop-article-mediated activation of Wnt／beta-catenin signaling plays arole in induction of liver natural killer T cell anergy in mice[J]．Hepatology,2013,57(3)：1250-1261

[15]Ishikawa A，Motohashi S，Ishikawa E，et a1．A phase I study ofal-pha-Galactosylceramide(KRN7000)-pulsed dendritic cells in patients with advanced and recurrent non-small cell lung cancer[J]．Clin Cancer Res,2005,ll(5)：1910-1917．

[16]Chang D，Osman K，Connolly J，et a1．Sustained expansion of NKTcells and antigen-specific T cells after injection of alpha-galactosyl-ceramide loaded mature dendritic cells in cancer patients[J]．J ExpMed,2005,201(9)：1503-1517．

[17]O’Konek Jj，Kato S，Takao S，et a1．Beta-mannosylceramide acti-vates type I natural killer l cells to induce tumor immunity without inducing long-term functional anergy[J].Clin CancerRes,2013,19(16)：4404-4411．

[18]M Singh,W Quispe-Tintaya,D Chandra,et al.Direct incorporation of the NKT-cell activator α-galactosylceramide into a recombinant Listeria monocytogenes improves breast cancer vaccine efficacy[J].British Journal Of Cancer, 2014,111,194-194.

[19]Ann-Kathrin J rger,Lei Liu,Karin Fehlner,et al.Impact of NKT Cells and LFA-1 on Liver Regeneration under Subseptic Conditions[J].PLoS One.2016, 15;11(12)

[20]Exley MA,Friedlander,Alatrakchi N,et al.Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma：a Phase 1 Clinical Trial[J]. Clin Cancer Res.2017 Feb 13.

Natural Killer T Cells Quantity Distribution Change and the Correlation of Liver Cancer Metastasis

Liu Changfang,Wu Cuijiao,Li Hui?,Zhang Jing?
(Qingdao University,Qingdao 266000,Shandong；*The Affiliated Hospital to Qingdao University, Qingdao 266000,Shandong)

ObjectiveTo study the number of natural killer T cells distribution change and the correlation of liver cancer metastasis.MethodsRat anti CD3,CD56 double monoclonal antibody immune method,normal liver tissue and natural killer T cells in different stages of liver cancer tissue and the number of distribution,using the statistical analysis of the number of natural killer T cells distribution change and the correlation of liver cancer cell migration.SPSS20.0 application software,the data obtained using analysis of variance and t test.ResultsEach stage the number of natural killer T cells in the liver cancer tissue and normal liver tissue,that the number of natural killer T cells in comparison,P＜0.0005. LiverⅠa period-Ⅱa period withⅡb period-Ⅲb compared the number of natural killer T cells,P＜0.005.ConclusionThe number of natural killer T cells in the liver tissue depends on the different degree of organization from the cancer cells and the distribution is different,the liver microenvironment influence natural killer T cell differentiation,number of natural killer T cells associated with liver metastasis.

Liver cancer;Natural killer T cells;Immunohistochemistry

R735.7；R392.33

：A

：1008-4118（2017）01-0004-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2017.01.002

2016-12-03

劉長(zhǎng)芳（1979-）女，漢，現(xiàn)在青島大學(xué)附屬醫(yī)院東院腫瘤化療科工作。研究方向：分子生物學(xué)。

吳翠嬌。wucjzr@163.com。