李 賽，陽(yáng)學(xué)風(fēng)，胡 甜，張楚紅，呂 秀，賀 莎，嚴(yán)漢興，譚貽兮，陳榮如，文美玲，李金成，左建宏

（1. 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，衡陽(yáng) 421000；2. 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，衡陽(yáng) 421000；3. 邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)部，邵陽(yáng) 422000）

循環(huán)microRNA-1268在肺癌血漿中檢測(cè)分析及臨床意義

李 賽1，2，陽(yáng)學(xué)風(fēng)1，胡 甜1，2，張楚紅1，呂 秀1，賀 莎1，嚴(yán)漢興1，譚貽兮1，陳榮如1，文美玲1，李金成3，左建宏1，2

（1. 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，衡陽(yáng) 421000；2. 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，衡陽(yáng) 421000；3. 邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)部，邵陽(yáng) 422000）

目的： 探討循環(huán)microRNA-1268（miRNA-1268）在肺癌血漿中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性及其在肺癌診斷及預(yù)后判斷中的意義。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miRNA-1268在39例肺癌患者和作為對(duì)照組的39例正常人血漿中的相對(duì)表達(dá)量，并評(píng)估其臨床意義。結(jié)果：肺癌血漿中miRNA-1268的表達(dá)水平明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血漿循環(huán)miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）為0.680，95%CI為0.562-0.799，取臨界值0.054時(shí)，血漿miRNA-1268表達(dá)診斷肺癌的靈敏度為74.4%，特異度為59.0%；miRNA-1268的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期相關(guān)，而與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分型、CEA水平無(wú)相關(guān)性；Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示肺癌血漿中miR-1268高表達(dá)者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：循環(huán)miRNA-1268在肺癌血漿中表達(dá)上調(diào)，對(duì)肺癌有一定的臨床診斷及預(yù)后判斷意義，可作為診斷肺癌和判斷預(yù)后的一個(gè)新的標(biāo)志物。

肺癌；循環(huán)microRNA-1268；診斷；預(yù)后；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

肺癌是全世界癌癥死亡率的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年肺癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)159萬(wàn)人［1］，并且肺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。大多數(shù)患者在出現(xiàn)癥狀后或得到確診時(shí)，已屬疾病晚期，不具備手術(shù)治療的指證，雖然放化療和靶向藥物為患者提供了一線生機(jī)，但肺癌的5年生存率仍然很低：數(shù)據(jù)表明，腫瘤分期為IA期的非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率為80%，而IV期患者只有10%［2］；經(jīng)過(guò)治療的局限期小細(xì)胞肺癌患者的中位生存期約為18～24個(gè)月，而經(jīng)過(guò)治療的廣泛期小細(xì)胞肺癌的中位生存期約為6～12個(gè)月，未經(jīng)治療的廣泛期小細(xì)胞肺癌的中位生存期僅有2～4個(gè)月［3］。傳統(tǒng)的檢查方法如胸片和痰找脫落細(xì)胞，這些方法敏感性和特異性低，限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值；近年來(lái)發(fā)現(xiàn)低劑量螺旋CT對(duì)肺癌的診斷更敏感，但診斷肺癌的特異性只有61%［4］；作為診斷肺癌金標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)是一種侵入性的手術(shù)，給病人帶來(lái)相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，我們急需一種早期、有效、無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)肺癌的方法，而microRNAs被認(rèn)為是一種潛在的作為肺癌診斷的標(biāo)志物。

小分子核糖核酸（microRNAs）是一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為19～22個(gè)核苷酸［5、6］，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用［7、8］。許多研究表明，microRNAs （miRNAs）不僅參與正常的生物過(guò)程，如分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，還在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用，包括肺癌［9-12］。MiRNAs不容易被核糖核酸酶降解，可以在血液中保持穩(wěn)定［13、14］，2008年Mitchell［15］and Chen［16］首先報(bào)道了血漿和血清中含有大量的穩(wěn)定的miRNAs。此外，miRNAs取樣方便、無(wú)創(chuàng)，而且可連續(xù)監(jiān)測(cè)，這些特征更加突出miRNAs的作為腫瘤診斷標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái)有很多關(guān)于循環(huán)miRNA作為腫瘤診斷標(biāo)志物的文獻(xiàn)報(bào)道，但是迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于循環(huán)miRNA-1268在肺癌中表達(dá)的報(bào)道，本研究通過(guò)檢測(cè)肺癌患者血漿中miRNA-1268的表達(dá)水平變化，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性及其在肺癌診斷及預(yù)后判斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集 2014年7月～2015年9月在湖南省衡陽(yáng)市南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院住院治療的肺癌患者血漿樣本及正常人血漿樣本分別39例。肺癌血漿樣本中男31例，女8例；組織病理類型為腺癌14例、鱗癌25例。根據(jù)2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，I-II期12例，III-IV期27例。收集患者及正常人外周血3ml，在4°C條件下離心5分鐘，轉(zhuǎn)速3500r/min，取上清液后立即轉(zhuǎn)入-80°C 冰箱保存，整個(gè)收集及保存過(guò)程均按照無(wú)酶原則操作。

1.2 方法 總血漿RNA提取通過(guò)miRNeasy Plasma試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）提取，操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；然后使用miScript II RT試劑盒（Qiagen公司提供）逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，接著采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增（該步驟使用miScript SYBR Green PCR試劑，由Qiagen 公司提供）。每個(gè)樣本real time PCR進(jìn)行3次。采用cel-miR-39作為內(nèi)參，miRNA-1268在肺癌血漿中的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔCt方法計(jì)算，其中ΔΔCt＝ΔCt（miR-1268-內(nèi)參）（肺癌組）－ΔCt（miR-1268-內(nèi)參）（正常組），并以2-ΔCt形式表示，其中ΔCt＝Ct（miR-1268）-Ct（cel-miR-39）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作圖采用Graph PadPrism v5.0軟件；數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，所有分析均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。通過(guò)ROC曲線（SPSS軟件）計(jì)算曲線下面積、臨界值和靈敏度、特異度，并評(píng)價(jià)血漿miRNA-1268對(duì)于肺癌診斷的價(jià)值。生存分析采用Kaplan-Meier分析，組間比較采用Log-rank 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA-1268在肺癌血漿中的表達(dá)。 在肺癌患者血漿中miRNA-1268相對(duì)當(dāng)于內(nèi)參的表達(dá)量為：0.22±0.33；而正常人血漿中miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量為：0.09±0.12，肺癌患者血漿中miRNA-1268的表達(dá)水平明顯高于正常人（P=0.025）（圖1）。肺癌血漿中有28例（71.8%）miRNA-1268表達(dá)上調(diào)（圖2）。

圖1 miRNA-1268在肺癌血漿中的表達(dá)量，以2-ΔCt表示，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

圖2 肺癌組miRNA-1268上調(diào)倍數(shù)（相對(duì)于正常組），以log2形式表示

2.2 miRNA-1268的表達(dá)水平與肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

血漿miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量與肺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。MiRNA-1268的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期相關(guān)（P＜0.05）：與I-II期肺癌相比較，III-IV期肺癌血漿中miRNA-1268的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）；而miRNA-1268 的表達(dá)水平與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、CEA水平、腫瘤組織分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。

2.3 血漿miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線分析

對(duì)血漿miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用SPSS軟件做ROC曲線分析，如圖C所示，血漿循環(huán)miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）為0.680，95%CI為0.562-0.799（P＜0.01），取臨界值0.054時(shí)，血漿miRNA-1268表達(dá)診斷肺癌的靈敏度為74.4%，但特異度較低，為59.0%。

表1 肺癌血漿miR-1268高表達(dá)與臨床病理特征間關(guān)系（± s）

表1 肺癌血漿miR-1268高表達(dá)與臨床病理特征間關(guān)系（± s）

?

圖3 血漿miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線分析

2.4 血漿miRNA-1268的表達(dá)與肺癌患者的預(yù)后關(guān)系

3 9例肺癌患者中有 1 例患者失訪。根據(jù)miRNA-1268的平均表達(dá)水平將所有肺癌 患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。如圖4所示，通過(guò)Kaplan-Meier進(jìn)行分析，miRNA-1268高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存時(shí)間分別為13.09±6.06和19.32±5.25個(gè)月，miRNA-1268高表達(dá)者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 血漿miRNA-1268的表達(dá)與肺癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

肺癌的死亡率居惡性腫瘤之首，5年生存率低，多數(shù)肺癌患者在得到確診時(shí)已屬疾病晚期，因此，尋找一種早期、有效的診斷肺癌的生物標(biāo)志物顯得尤為迫切。MiRNAs是一類長(zhǎng)度約為19-22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生調(diào)控作用。MiRNAs通過(guò)特異性結(jié)合目標(biāo)信使RNA（mRNA）的3’端非翻譯區(qū)（3’-UTR），最終導(dǎo)致mRNA的直接降解或者翻譯抑制。血液中的miRNA可以穩(wěn)定存在，不易被內(nèi)源性RNA酶降解。大量研究表明miRNA的異常表達(dá)與包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤密切相關(guān)，可作為肺癌診斷的有應(yīng)用前景的新型生物標(biāo)志物。

2004年Takamizawa等［17］首次將miRNA的表達(dá)和肺癌聯(lián)系起來(lái)，自此有關(guān)肺癌和miRNA的研究越來(lái)越多，miRNA在肺癌診斷及預(yù)后中的重要作用受到廣泛關(guān)注。Chen［16］等首次發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的血清miRNA表達(dá)譜相對(duì)于健康人的有顯著差異，其中有28個(gè)正常血清miRNA沒(méi)有在非小細(xì)胞肺癌的血清中被檢測(cè)到，此外，有76中血清miRNA在肺癌血清中檢測(cè)到，這暗示血清miRNA可能是診斷非小細(xì)胞肺癌的潛在生物標(biāo)志物。Hu等［18］通過(guò)檢測(cè)152例肺癌血清樣本和75例健康人血清樣本，發(fā)現(xiàn)miRNA-25和miRNA-223在肺癌中的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組顯著上調(diào)，表明血清miRNA-25和miRNA-223可能是非小細(xì)胞肺癌的特異性miRNA。Wei［19］等發(fā)現(xiàn)使用血漿miRNA-21作為診斷非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性和特異性分別為76.2%，70%。此外，Chen等［20］在一項(xiàng)研究中已經(jīng)明確了由10種在非小細(xì)胞肺癌中差異表達(dá)的血清miRNA構(gòu)成的生物標(biāo)志物模型，并且ROC曲線分析表明，這10種miRNA診斷非小細(xì)胞肺癌的敏感性和特異性分別為92.5%和90%。大量研究結(jié)果表明，miRNAs的表達(dá)與肺癌患者的生存期相關(guān)。血清miRNA-21低表達(dá)與肺癌患者的低生存時(shí)間有關(guān)［21-22］。高表達(dá)miRNA-141 和 miRNA-200c的肺癌患者總生存時(shí)間縮短［23］。近幾年來(lái)，關(guān)于循環(huán)miRNAs的研究越來(lái)越多，但關(guān)于循環(huán)miRNA-1268在肺癌中的表達(dá)尚不清楚，本研究通過(guò)檢測(cè)肺癌患者血漿中miRNA-1268的表達(dá)水平變化發(fā)現(xiàn)：在肺癌患者血漿中miRNA-1268的表達(dá)水平明顯高于正常人，說(shuō)明在肺癌中miRNA-1268表達(dá)是上升的，且miRNA-1268高表達(dá)者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miRNA-1268的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期相關(guān)，與I-II期肺癌相比較，III-IV期肺癌血漿中miRNA-1268的表達(dá)水平明顯上調(diào)，這些結(jié)果提示miRNA-1268可能作為一種癌基因參與肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，血漿miRNA-1268可能是肺癌的特異性循環(huán)miRNA，對(duì)肺癌患者的診斷及預(yù)后判斷有重要價(jià)值。本研究還發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA-1268相對(duì)表達(dá)量ROC曲線下面積為0.680，診斷肺癌的靈敏度為74.4%，但特異度較低，為59.0%，該結(jié)果提示血漿miRNA-1268對(duì)肺癌的診斷具有較好的靈敏度。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-1268對(duì)肺癌的診斷及預(yù)后判斷有一定臨床意義，但miRNA-1268調(diào)控肺癌的具體機(jī)制及相關(guān)靶基因尚不明確，仍需我們更加深入研究。

［1］ Cheng TY, Cramb SM, Baade PD, Youlden DR, Nwogu C, Reid ME. The international epidemiology of lung cancer: latest trends, disparities, and tumor characteristics. J Thorac Oncol.2016; 11(10): 1653-71.

［2］ Aberle DR, Adams AM, Berg CD, et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med.2011; 365: 395-409.

［3］ Jun Shen, Jipei Liao, Maria A. Guarnera, HongBin Fang, Ling Cai, Sanford A. Stass, Feng Jiang. Analysis of microRNAs in sputum to improve computed tomography for lung cancer diagnosis. J Thorac Oncol.2014; 9(1): 33-40.

［4］ Demedts IK, Vermaelen KY, van Meerbeeck JP. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J.2010; 35: 202-215.

［5］ Mo D, Gu B, Gong X, Wu L, Wang H, Jiang Y, Zhang B, Zhang M, Zhang Y, Xu J, Pan S. MiR-1290 is a potential prognostic biomarker in non-small cell lung cancer. J Thorac Dis.2015; 7(9): 1570-9.

［6］ Sin TK, Wang F, Meng F, Wong SC, Cho WC, Siu PM, Chan LW, Yung BY. Implications of microRNAs in the treatment of gefitinib-resistant non-small cell lung cancer. Int J Mol Sci.2016; 17(2): 237.

［7］ Lee HY, Han SS, Rhee H, Park JH, Lee JS, Oh YM, et al. Differential expression of microRNAs and their target genes in non-small-cell lung cancer. Mol Med Rep.2015; 11(3): 2034-40.

［8］ Valerio Del Vescovo, Margherita Grasso, Mattia Barbarreschi, Michela A Denti. MicroRNAs as lung cancer biomarkers. World J Clin Oncol.2014; 5(4): 604-620.

［9］ Jennifer F Barger, S Patrick Nana-sinkam. MicroRNA as tools and therapeutics in lung cancer. Respir Med.2015; 109(7): 803-812.

［10］ Shen J, Liao J, Guarnera MA, Fang H, Cai L, Stass SA, Jiang F. Analysis of microRNAs in sputum to improve computed tomography forlung cancer diagnosis. J Thorac Oncol.2014; 9(1): 33-40.

［11］ Rusek AM, Abba M, Eljaszewicz A, Moniuszko M, Niklinski J, Allgayer H. MicroRNA modulators of epigenetic regulation, the tumor microenvironment and the immune system in lung cancer. Mol Cancer.2015; 14: 34.

［12］ Di Leva G, Croce CM. miRNA profiling of cancer. Curr Opin Genet Dev.2013; 23: 3-11.

［13］ Shen J, Hu Q, Schrauder M, Yan L, Wang D, Medico L, Guo Y, Yao S, Zhu Q, Liu B, Qin M, Beckmann MW, Fasching PA, Strick R, Johnson CS, Ambrosone CB, Zhao H, Liu S. Circulating miR-148b and miR-133a as biomarkers for breast cancer detection. Oncotarget.2014; 5(14): 5284-5294.

［14］ Falcone G, Felsani A, D’Agnano I. Signaling by exosomal microRNAs in cancer. J Exp Clin Cancer Res.2015; 34(1): 32.

［15］ Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection ［J］. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2008; 105(30): 10513-10518.

［16］ Chen X, Ba Y, Ma L, et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］. Cell Res.2008; 18(10): 997-1006.

［17］ Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, Tomida S, Osada H, Endoh H, Harano T, Yatabe Y, Nagino M, Nimura Y, Mitsudomi T, Takahashi T. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res.2004; 64(11): 3753-6.

［18］ Hu Z, Chen X, Zhao Y, et al. Serum microRNA signatures identified in a genome-wide serum microRNA expression profiling pre-dict survival of non-small-cell lung cancer［J］. J Clin Oncol.2010; 28(10): 1721-1726.

［19］ Wei J, Gao W, Zhu CJ, et al. Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer［J］. Chin J Cancer.2011; 30(6): 407-414.

［20］ Chen X, Hu Z, Wang W, et al. Identification of ten serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as novel noninvasive biomarkers for nonsmall cell lung cancer diagnosis. Int J Cancer.2012; 130(7): 1620-1628.

［21］ Liu XG, Zhu WY, Huang YY, et al. High expression of serum miR-21 and tumor miR-200c associated with poor prognosis in patients with lung cancer. Med Oncol.2012; 29: 618-626.

［22］ Yang M, Shen H, Qiu C, et al. High expression of miR-21 and miR-155 predicts recurrence and unfavourable survival in non-small cell lung cancer. Eur J Cancer.2013; 49: 604-615.

［23］ Tejero R, Navarro A, Campayo M, et al. miR-141 and miR-200c as markers of overall survival in early stage non-small cell lung cancer adenocarcinoma. PLoS One.2014; 9: e101899.

Analysis of circulating microRNA-1268 in plasma of lung cancer and its clinical significance

Li Sai1,2, Yang Xue-feng1, Hu Tian1,2, Zhang Chu-hong1, Lv Xiu1, He Sha1,Yan Han-xing1,Tan Yi-xi1,Chen Rongru1,Wen Mei-ling1, Li Jin-cheng3,Zuo Jian-hong1,2
(1.Affiliated Nanhua Hospital， University of South China, Hengyang 421000,China;2. Department of Medicine, University of South China, Hengyang 421000, China3. Department of Medicine, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China)

Objective To discuss the expression of circulating miRNA-1268 in lung cancer plasma and to analyze its diagnostic and prognostic evaluation value in lung cancer. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detectthe relative expression level of circulating miRNA-1268 in 39 lung cancer patients (cancer group) and 39 healthy people (control group). Results The expression of miRNA-1268 in the cancer group was up-regulated compared with the control group. The area under the ROC curve was 0.680, and the 95%CI was 0.562～0.799, its sensitivity in the diagnosis of lung cancer was 74.4% and its specificity was 59.0% when the relative expression level of circulating miRNA-1268 was 0.054. The expression of miRNA-1268 was related to tumor stage, and no obvious correlation was found between the expression of miRNA-1268 and some pathological characteristics such as gender, age, smoke, CEA, tumor size, lymph node metastasis and tissue typing. Kaplan and Meier analysis results show that there was significant difference between the expression of plasma miR-1268 and overall survival of lung cancer, patients with high expression of miR-1268 showed shorter survival than those with low expression of miR-1268. Conclusion The up-regulated expression of circulating miRNA-1268 has certain value in the diagnosis and prognostic evaluation of lung cancer, and it may be a useful diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer.

lung cancer; circulating microRNA-1268; diagnosis; prognosis; real-time fluorescent quantitative PCR

R734.2

A

1673-016X（2017）02-0016-05

2016-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272960）；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2013WK2010，2014SK2015）；人社部重點(diǎn)項(xiàng)目【2016】176號(hào)和天晴肝病研究基金

李金成，E-mail:hnsyljc63@163.com；左建宏，E-mail:

632138414@qq.com