刁 刻，吳 瓊，邱業(yè)先

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

一株苯胺降解菌的篩選及其降解效率研究

刁 刻，吳 瓊，邱業(yè)先*

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

從活性污泥中篩選出一株可高效降解苯胺的細(xì)菌，通過掃描電鏡觀察、PCR法擴(kuò)增16S rDNA測序和比對、生理生化實驗鑒定其種屬。結(jié)果顯示，所篩選的菌株DK為代爾夫特菌屬（Delftia sp.）。通過正交試驗探索其最優(yōu)生長條件為：溫度30℃，pH=8，搖床轉(zhuǎn)速250 min-1，苯胺濃度0 mg·L-1。菌株DK對苯胺降解效率隨著接種量增加而提高，隨著苯胺濃度的增加而減小。菌株DK在含有1 000 mg·L-1苯胺的自來水中3 d后的降解率達(dá)到87.4%。為菌株DK的開發(fā)應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。

苯胺；降解；代爾夫特菌屬；16S rDNA

苯胺屬于芳香胺類化合物，我國苯胺年生產(chǎn)能力達(dá)到兩百萬噸，廣泛應(yīng)用于印染等化工領(lǐng)域。值得注意的是，苯胺已對人類和環(huán)境造成嚴(yán)重危害，被美國EPA列為優(yōu)先控制的129種污染物之一[1]。因此，環(huán)境中苯胺降解得到越來越多的關(guān)注。微生物降解法因其具有成本較低、無二次污染等優(yōu)點，成為降解苯胺研究的熱點和重點。目前，國內(nèi)外苯胺降解研究主要集中在高效降解菌篩選和其降解性能等方面[2-4]。筆者從污水處理廠（主要為有機物降解）的活性污泥中篩選到1株以苯胺為唯一碳、氮源生長的細(xì)菌，并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定和降解性能研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

活性污泥取自蘇州某污水處理廠曝氣池中；DNA提取試劑盒購自于上海（生工）生物工程公司；Taq酶購自北京康為世紀(jì)生物公司；16S rDNA通用引物由上海（生工）生物工程公司合成；其他所用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器

9700型PCR購自美國AB公司；5417R冷凍離心機購自美國Eppondorf公司；DKY恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床購自上海杜科；水浴鍋、GNP9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏；SW-CJ-2FD超凈工作臺購自上海博訊實業(yè)；TU1810紫外/分光光度計購自北京普析；ATB1525半自動細(xì)菌檢定儀購自法國梅里埃集團(tuán)公司；Philip XL20掃描電子顯微鏡購自荷蘭飛利浦公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[5]

富集培養(yǎng)基（w/v）：葡萄糖0.1%，蛋白胨0.05%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.05%，調(diào)pH值至7.0；無機鹽培養(yǎng)基（w/v）:磷酸二氫鈉0.05%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.01%，調(diào)pH值至7.0。以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種的馴化和篩選

取1 mL活性污泥加入苯胺富集培養(yǎng)基（苯胺濃度500 mg·L-1），搖床培養(yǎng)（30℃、160 min-1），12 h后待培養(yǎng)基渾濁，接種到含600 mg·L-1苯胺的富集培養(yǎng)基，連續(xù)多次轉(zhuǎn)接，直至接種到含1 000 mg·L-1苯胺的富集培養(yǎng)基中。隨后，轉(zhuǎn)接到含1 000 mg·L-1苯胺的無機鹽培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)3 d，并在含1 000 mg·L-1苯胺的無機鹽培養(yǎng)基，重復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次，確保菌株對苯胺的耐受性不變。最后，將所得菌液涂平板，劃線分離純化菌種，挑選單菌落純化培養(yǎng)，并測定每個培養(yǎng)試管中的苯胺降解率，選擇出降解率最高的一組，所篩選得到的菌株編號為DK。

1.2.2 菌株DK的生長條件測定

以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)計菌株DK生長條件的正交試驗。通過正交試驗設(shè)計，測定菌株DK培養(yǎng)液2 d后的OD600來探究溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、苯胺的含量以考察這四個因素對菌株DK生長的影響。水平條件設(shè)計因素位級表見表1，正交實驗表見表2。

表1 正交實驗因素位級表

表1 正交實驗表

1.2.3 菌種DK的觀察及鑒定

菌落的觀察以及細(xì)菌鑒定儀鑒定：在無機鹽培養(yǎng)基中，菌株DK培養(yǎng)60 h后，取100 μL菌液均勻涂于固體培養(yǎng)基 （苯胺含量為1 000 mg·L-1），放入恒溫培養(yǎng)箱中，待菌落長出，觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落用于革蘭氏鑒定和半自動細(xì)菌檢定儀進(jìn)行生理生化鑒定。

掃描電鏡的觀察：接種菌液到新的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)得到新鮮的菌液。第一步，取一定量的培養(yǎng)液于8 000 rpm離心機離心4 min，棄上清液，并加入固定液2.5%的戊二醛。第二步，固定，脫水。在固定液戊二醛中浸泡4 h左右，并用磷酸緩沖液沖洗3次，脫水用乙醇梯度分別為30%、50%、75%、85%、95%的乙醇脫水。每個梯度乙醇脫水一次。最后用無水乙醇脫水2次。每次脫水時間大約在20 min。完成后再用乙酸異戊酯置換2次，每次20 min。之后樣品送到蘇大掃描電鏡實驗室進(jìn)行電鏡觀察。

16S rDNA序列的測定：收集菌體，提取染色體總DNA作為擴(kuò)增模板。16S rDNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)所用的引物兩端序列分別是27F和1492R，5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和5’-GGTTACCTTGTTCGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系 （25 μL）為10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，此步驟共進(jìn)行 30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，純化回收，由上海生工測序部測序。

1.2.4 苯胺含量的測定

苯胺含量測定采用國標(biāo)法GB/T11889-1989[6]，按下式計算結(jié)果

降解率（%）=（對照樣品苯胺含量-所測樣品苯胺含量）/對照樣品苯胺含量×100%

1.2.5 接種量、苯胺濃度對菌株DK降解率的影響

以無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長60 h的菌液為接種液，按照0.5%、1%、2%、4%不同接種量接入到苯胺濃度為1 000 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基；以1%接種量分別接入苯胺濃度依次為300、500、700、900、1 100 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基。測定苯胺降解率。

1.2.6 不同水體環(huán)境中苯胺降解率變化

以1%的接種量轉(zhuǎn)接菌株DK至超純水、自來水、湖水中，水樣中苯胺含量均為1 000 mg·L-1，測定3 d后苯胺的降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株DK的篩選和鑒定

經(jīng)過富集培養(yǎng)、無機鹽培養(yǎng)基馴化篩選、涂平板分離、降解率測定篩選以及劃線分離純化，得到高效降解苯胺的純化菌種，命名為DK。該菌的菌落較小，圓形中間有凸起，邊緣較為整齊，表面顏色為淡黃色。革蘭氏鏡檢為陰性。

菌株DK掃描電鏡照片圖（如圖1所示），圖中顯示出菌株DK的立體形態(tài)，外形大多呈桿狀。長度在3 μm左右，寬度小于0.5 μm。菌與菌之間已發(fā)生交聯(lián)。

生理生化鑒定結(jié)果（見表3）顯示與細(xì)菌檢定儀收錄的細(xì)菌庫中代爾夫特食酸菌 （Delftia acidovorans）相似性達(dá)到85.9%，可以認(rèn)定DK屬于代爾夫特菌屬（Delftia sp.）。

圖1 菌株DK的SEM掃描電鏡照片

表3 生理生化反應(yīng)結(jié)果

通過16s rDNA序列在NCBI blast的對比鑒定，發(fā)現(xiàn)其16S rDNA序列與多個代爾夫特菌屬細(xì)菌相似度達(dá)到99%以上。 用MEGA 4構(gòu)建分子進(jìn)化樹，采用Neighbor Joining法建樹，用Bootstrap進(jìn)行檢驗，并重復(fù)1 000次。則確定菌種DK屬于代爾夫特菌屬（Delftia sp.）。測定16S rDNA序列（序列在GenBank的登錄號為R30W4Z22014）以及基于16S rDNA序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖2所示）結(jié)果如下：

圖2 基于16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株DK的最佳生長條件

設(shè)計正交實驗研究溫度、培養(yǎng)基pH值、搖床轉(zhuǎn)速和苯胺濃度對菌株DK的生長的影響，得出菌株DK在LB培養(yǎng)基中生長的最優(yōu)條件。結(jié)果見表4。其中，溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速和苯胺濃度4個影響因素的極差R分別為：0.197、1.520、0.213、0.189。由此得出4個影響因素對菌株DK生長的影響大小依次為：pH值＞搖床轉(zhuǎn)速＞溫度＞苯胺濃度。

由表4結(jié)果可知，pH值是影響菌株DK生長最重要的因素。pH值為6和8的六個組的菌株生長情況明顯好于其他三個組，OD600值最高達(dá)到2.023，總體來說pH值為8的三組之和要大于其他兩組，最差的是pH值為4的實驗組，OD600值最高只達(dá)到0.169?？梢娋闐K比較適宜生長在中性或者偏弱堿性的環(huán)境中。另一方面，在菌株DK的初始篩選過程中，所用的富集培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基的pH值都為7左右。

表4 正交試驗結(jié)果表

搖床轉(zhuǎn)速是影響菌株DK生長的次要因素，對菌株DK生長的影響較為重要。較高的搖床轉(zhuǎn)速首先可以為微生物生長的體系提供充足的供氧，其次也可以提高微生物對體系中碳源、能源及其他營養(yǎng)元素的接觸率，從而提高對它們的利用率，促進(jìn)微生物的生長，這些可能是搖床轉(zhuǎn)速增加后OD600也有較大增加的原因。另一方面，菌株DK是從曝氣池中的活性污泥中篩選得到的，其中的絕大數(shù)微生物是好氧菌。

溫度影響菌株DK生長的效果又略低于搖床轉(zhuǎn)速。溫度通過影響細(xì)胞酶的活性而影響微生物自身的代謝活動及細(xì)胞中生化反應(yīng)的速率，溫度過低會抑制菌株的生長和酶的活性，溫度過高會使機體自身的蛋白質(zhì)、核酸等重要組成部分受到不可逆的破壞，因此，只有適宜的溫度能加快微生物的生長繁殖速率，增加酶的產(chǎn)量，提高酶的活性，進(jìn)而增強微生物降解能力。從正交實驗結(jié)果來看，菌株DK在30℃條件下的生長情況要好于25℃和35℃條件下的生長情況。

苯胺濃度影響效果在四者之中最小，但從表4中可以看出苯胺濃度增大，菌株DK的生長量降低。苯胺作為環(huán)境中一種有毒物質(zhì)，對一般的微生物生長都有較大抑制作用。但筆者篩選得到的菌株DK可把苯胺作為唯一碳源、氮源來進(jìn)行降解利用，所以苯胺對其抑制作用很小。

綜上所述，分析每個因素在LB培養(yǎng)基生長狀況的影響，并結(jié)合實際情況可以確定菌株最優(yōu)生長條件為溫度30℃，pH=8，搖床轉(zhuǎn)速250 min-1，苯胺濃度0 mg·L-1。

2.3 接種量、苯胺濃度和水體環(huán)境對菌株DK降解率的影響

2.3.1 接種量對菌株DK降解率的影響

在0.5%、1%、2%、4%不同接種量的條件下，測定無機鹽培養(yǎng)基中苯胺（濃度為1 000 mg·L-1）不同時間段的降解率，結(jié)果顯示隨著接種量的增加，完全降解苯胺所需時間減少（如圖3所示）。但是從實際情況出發(fā)1%的接種量滿足降解效率要求，且可以降低成本。

圖3 不同接種量對苯胺降解率的影響

2.3.2 苯胺濃度對菌株DK降解率的影響

分別在苯胺濃度為 300、500、700、900、1 100 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基下，以1%菌液接種量接入培養(yǎng)基中，測定不同時段的降解率，結(jié)果（圖4）顯示低濃度苯胺條件下菌株DK對苯胺降解較快，高濃度時降解較慢。說明苯胺不僅是該菌株的碳、氮源，高濃度苯胺也會抑制菌株的生長，從而使降解率變低。

2.3.3 不同水體環(huán)境對菌株DK降解率的影響

在超純水、自來水和湖水等的水體中菌株DK對苯胺的降解率分別為10.1%、87.4%和57.4%。這一結(jié)果說明，在自來水中的降解效果最好，超純水中降解效果最差（如圖5所示）。自來水含有一定的離子濃度，且所含的其他雜質(zhì)和雜菌也較少，從而有利于菌株的生長，這可能是菌株DK在自來水中降解率較高的原因。

圖4 不同的苯胺底物濃度對降解率的影響

圖5 不同水體環(huán)境中的苯胺降解情況

3 結(jié)語

（1）取自污水處理廠曝氣池的活性污泥樣品，經(jīng)過富集培養(yǎng)、無機鹽培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)篩選，涂平板分離，再經(jīng)降解率測定篩選以及劃線分離純化，得到降解苯胺達(dá)87.4%的高效降解苯胺的菌株，命名為DK。

（2）篩選出來的苯胺降解菌株DK具有菌落小、圓形中間突起、邊緣整齊、表面顏色為淡黃色的培養(yǎng)特征。電鏡觀察顯示該菌呈桿狀，長度3 μm左右，寬度小于0.5 μm，菌間發(fā)生交聯(lián)。

（3）對DK菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定為陰性細(xì)菌。經(jīng)法國梅里埃公司生產(chǎn)的細(xì)菌鑒定儀所做的生理生化鑒定，該菌為代爾夫特菌屬（Delftia sp.）。16S rDNA序列比對鑒定，該菌也為代爾夫特菌屬（Delftia sp.）。查閱國內(nèi)外資料，已有報道分離的苯胺降解菌有 Alcaligenes faecalis、Nocardia sp.、Rhodococcus erythropolis、Hodococcus sp.、Frateuria sp.、Pseudomonas putida、Pseudomonas sp.、Pseudomonas acidovorans、Achromobacter sp.和Acinetobacter sp.等，筆者分離的菌株DK沒有被報道過，屬于新的菌種。與現(xiàn)有報道的苯胺降解菌的苯胺降解率比較，李巖等[7]報道的菌株Ani-4-15和菌株Ani-5-61降解率達(dá)到85%和70%。Shan Dan[8]報道的菌株JH-9降解率達(dá)到74%。Wang Dianzhan等[9]分離出熱帶假絲酵母AN1苯胺降解率達(dá)到93%。謝青等[10]報道的菌株AN-6降解率達(dá)到95%以上。筆者分離的降解菌DK苯胺的降解率達(dá)87.4%，處于中等水平，具有一定的開發(fā)利用價值。

（4）以正交試驗研究了溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速和苯胺濃度對菌株DK生長的影響，結(jié)果表明：DK菌株的最佳生長溫度30℃，最佳生長pH值為8，最佳搖床轉(zhuǎn)速為250 min-1，最佳生長苯胺濃度為0 mg·L-1。對溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速和苯胺濃度四個生長因素試驗結(jié)果極差分析，極差R值分別為0.197、1.520、0.213、0.189。由此得出4個影響因素對菌株DK生長的影響大小依次為：pH值＞搖床轉(zhuǎn)速＞溫度＞苯胺濃度。

（5）研究結(jié)果還揭示，菌株DK對苯胺降解效率隨著接種量的增加而增加，隨著苯胺濃度的增加而減少。DK在超純水、自來水和湖水中的苯胺降解率為10.1%、87.4%和57.4%，說明自來水有益于苯胺的降解。

總之，筆者從活性污泥中分離了一株可有效降解苯胺的菌株，經(jīng)鑒定為代爾夫特菌屬（Delftia sp.），進(jìn)而，研究了該菌的最佳生長條件，揭示了該菌降解苯胺的影響因素，為該菌用于污水處理及土壤修復(fù)打下了一定基礎(chǔ)。

[1]錢易，湯鴻霄，文湘華.水體顆粒物和難降解有機物的性質(zhì)與控制技術(shù)原理（下卷）：難降解有機物[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2000.

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Isolation and effect of an aniline-degrading bacterium named DK

DIAO Ke，WU Qiong，QIU Yexian
（School of Chemistry，Biology and Materials Engineering，SUST，Suzhou 215009，China）

One efficient aniline-degrading bacterium named DK was isolated from activated sludge.DK was observed through the SEM.16S rDNA of DK was amplified using PCR；then species were identified by sequencing and alignment.The optimal growth conditions of DK were measured through orthogonal experiments.The result showed that the screened bacterium DK belonged to Delftia sp..The optimal growth conditions were that the temperature was 30℃；pH was 8；rotation speed was 250 min-1and aniline concentration was 0 mg·L-1.The degradation rate of aniline in tap water was 87.4%in three days by stain DK,and the concentration of aniline in tap water was 1 000 mg·L-1.This study provided a theoretical basis for the large-scale application of DK.

aniline；degradation；Delftia sp.；16S rDNA

責(zé)任編輯：李文杰

X172

：A

：2096－3289（2017）02－0043－06

2015－05－20

江蘇省科技支撐項目（BE201038）

刁 刻（1990-），男，安徽宿州人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境有益微生物研究與利用。*

邱業(yè)先（1954-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：qyx542@163.com。