竇 勇 姜智飛 張文慧 高金偉 姜 淼 史謝堯 周文禮

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院, 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300384)

AHLs 對(duì)小球藻PS Ⅱ光化學(xué)活性與光合作用關(guān)鍵酶的影響

竇 勇 姜智飛 張文慧 高金偉 姜 淼 史謝堯 周文禮

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院, 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300384)

采用批次培養(yǎng)的方法，研究了100、200和300 nmol/LC10-HSL(N-癸酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯)對(duì)普通海水小球藻(Chlorella vulgaris)PSⅡ光化學(xué)活性與光合作用關(guān)鍵酶的影響。結(jié)果顯示：在C10-HSL作用下，小球藻生長(zhǎng)受到促進(jìn)，細(xì)胞密度顯著升高，而且存在著隨C10-HSL濃度上升促進(jìn)作用增強(qiáng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系；小球藻PSⅡ光化學(xué)活性指標(biāo)——最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率Yeild及表觀光合電子傳遞效率ETR明顯提高，而且C10-HSL對(duì)Yeild的作用強(qiáng)于對(duì)Fv/Fm的影響；小球藻光合作用關(guān)鍵限速酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco、磷酸丙糖異構(gòu)酶TPI、焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶PFP、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶FDA活性均不同程度上升，表明小球藻光合固碳及合成糖類的能力有所增強(qiáng)。

AHLs; 海水普通小球藻; 光化學(xué)活性; 光合作用關(guān)鍵酶

小球藻(Chlorella)是綠藻門(mén)的單細(xì)胞微藻, 細(xì)胞內(nèi)氨基酸、維生素、糖蛋白等含量豐富, 它在水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物能源生產(chǎn)和功能型保健食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。另外小球藻對(duì)高鹽和高濃度抗生素有較強(qiáng)的耐受性, 而且可以利用外源營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng), 具備良好的培養(yǎng)特性, 因此被看做一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的資源生物[1,2]。

藻際環(huán)境中常存在著大量共棲細(xì)菌, 這些細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)不斷分泌一系列次級(jí)代謝產(chǎn)物, 這些物質(zhì)積累超過(guò)閾值濃度后會(huì)被細(xì)菌感知進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞密度依賴的基因表達(dá), 促使細(xì)菌產(chǎn)生獨(dú)特而多樣的生物學(xué)功能, 這一現(xiàn)象稱為細(xì)菌的群感效應(yīng)(Quorum sensing, QS), 而介導(dǎo)群感效應(yīng)的細(xì)菌代謝產(chǎn)物稱為群感信號(hào)物質(zhì)[3], 研究證實(shí)微生物的生物發(fā)光、聚集生長(zhǎng)、胞外多糖的合成與分泌、生物膜的形成都受到群感信號(hào)分子的調(diào)控[4—7]。群感信號(hào)分子主要分為三類, 其中N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類化合物(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)是革蘭氏陰性菌群感系統(tǒng)中最常見(jiàn)的信號(hào)物質(zhì), AHLs家族成員眾多, 其共同點(diǎn)是分子上都含有一個(gè)高絲氨酸內(nèi)酯環(huán), 不同的AHLs分子含有不同的?；ф溓揖哂胁煌纳锘钚訹8], 而目前的研究多集中于N-己酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C6-HSL)、N-酮己酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(OHHL)、N-辛酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C8-HSL)、N-癸酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C10-HSL)這幾種分子上[9—14]。

近年來(lái)的研究表明群感信號(hào)分子不僅能對(duì)細(xì)菌自身的生物學(xué)功能進(jìn)行反饋調(diào)節(jié), 而且可以介導(dǎo)藻類-微生物的種間相互作用, 徐魯燕等[15]發(fā)現(xiàn)某些海洋細(xì)菌產(chǎn)生的C6-HSL和C8-HSL顯著抑制了東海原甲藻、赤潮異彎藻生長(zhǎng), 畢相東等[16]指出藻際異養(yǎng)菌產(chǎn)生的C6-HSL會(huì)誘導(dǎo)小球藻抗氧化酶系統(tǒng)應(yīng)激表達(dá), 而另有學(xué)者[17,18]證實(shí)微藻能通過(guò)降解AHLs分子或合成AHLs類似物來(lái)干擾共棲細(xì)菌的胞間通訊。以往的工作多集中于AHLs對(duì)藻類脅迫的負(fù)面影響, 對(duì)微藻生長(zhǎng)的刺激與對(duì)光合生理的作用至今鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期發(fā)現(xiàn)藻際共棲細(xì)菌Pesudomonas sp.產(chǎn)生的微量C10-HSL可以促進(jìn)海水普通小球藻Chlorella vulgaris生長(zhǎng), 本研究結(jié)合前期工作, 考察了C10-HSL對(duì)C. vulgaris細(xì)胞密度、PSⅡ光化學(xué)活性及光合作用關(guān)鍵酶的影響, 探討了AHLs促進(jìn)C. vulgaris生長(zhǎng)及影響其光合速率的可能機(jī)制, 旨在為優(yōu)化藻-菌共生系統(tǒng)提供理論依據(jù),同時(shí)也為小球藻的集約化健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用小球藻由中國(guó)海洋大學(xué)生態(tài)學(xué)研究室提供, 采用f/2培養(yǎng)液培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度(23±1)℃, 光暗比12h：12h, 光強(qiáng)為60 μmol/(m2·s)。培養(yǎng)期間每天搖瓶6次, 防止微藻細(xì)胞附壁下沉。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻細(xì)胞進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

N-癸酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C10-HSL)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司, 原藥溶于無(wú)水乙醇配制成1 mmol/L的母液, 于4℃保存, 使用時(shí)根據(jù)實(shí)際情況加入無(wú)水乙醇配成總體積相同的工作液, 然后加入到不同的小球藻培養(yǎng)液中, 對(duì)照組(CK)藻液中加入的乙醇體積與各試驗(yàn)組相同。

1.3 實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建和分析指標(biāo)系統(tǒng)

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 將配制好的C10-HSL母液加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的100 mL小球藻培養(yǎng)液中, 使其在培養(yǎng)液中的最終濃度為100、200和300 nmol/L, 對(duì)照組按照1.2設(shè)置。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的0、12h、24h、36h、48h、60h、72h和84h測(cè)定各試驗(yàn)組和對(duì)照組的小球藻生長(zhǎng)指標(biāo)——細(xì)胞密度; PSⅡ光化學(xué)活性——PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Yeild)、表觀光合電子傳遞效率(ETR); 光合作用關(guān)鍵限速酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、焦磷酸: 果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(PFP)、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FDA)。

1.4 測(cè)定方法

小球藻細(xì)胞密度測(cè)定 接種指數(shù)生長(zhǎng)期的微藻至新配制的f/2培養(yǎng)液中, 用移液槍吸取等量藻液于血球計(jì)數(shù)板上, 用Lugol’s碘液固定, 計(jì)數(shù)細(xì)胞密度的變化。

小球藻PSⅡ光化學(xué)活性測(cè)定 使用德國(guó)Walz公司生產(chǎn)的IMAGING-PAM調(diào)制脈沖熒光儀測(cè)定PSⅡ光化學(xué)活性。向比色杯中依次加入3 mL蒸餾水和15 μL藻液, 混勻, 將樣品暗適應(yīng)15min, 讀取Fv/Fm、Yeild和ETR數(shù)值。

小球藻光合作用關(guān)鍵酶活性測(cè)定 每次取樣時(shí)量取各處理組藻液40 mL在4℃下以6000 r/min離心10min, 取沉淀藻泥加入3 mL生理鹽水, 冰浴研磨, 4℃下12000 r/min離心10min, 上清液用于光合作用關(guān)鍵酶活性測(cè)定。將每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol的NADH定義為1個(gè)Rubisco酶活力單位, 將每毫克蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為1個(gè)TPI酶活力單位, 將每毫克蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為1個(gè)PFP和FDA酶活力單位, 4種酶活力單位均為U/mgprot。所有酶活力分析均采用比色法, 吸光度值使用UV-1240紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析, 并采用Duncan多重比較進(jìn)行處理組間差異性比較, 處理組間沒(méi)有相同字母的表示差異顯著(P＜0.05), 有相同字母的表示差異不顯著(P＞0.05)。

2 結(jié)果

2.1 C10-HSL對(duì)小球藻細(xì)胞密度的影響

如圖 1所示, 隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)各試驗(yàn)組小球藻細(xì)胞密度均呈不斷上升的趨勢(shì), 而相較于對(duì)照組C10-HSL對(duì)小球藻生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用, 各實(shí)驗(yàn)組的微藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)顯著差異(P＜0.05), 說(shuō)明存在著隨C10-HSL濃度升高促進(jìn)作用增強(qiáng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)的0—36h內(nèi)小球藻細(xì)胞密度升高較快, 此后增加速率有所降低, 說(shuō)明C10-HSL對(duì)微藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用有隨時(shí)間衰減的特征。在培養(yǎng)期間, 3個(gè)C10-HSL處理組微藻細(xì)胞密度和增加速率均明顯高于對(duì)照組, 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)100、200和300 nmol/L處理組的小球藻細(xì)胞密度已經(jīng)分別達(dá)到426×105、464×105和522×105cells/mL, 較各組起始密度分別提高了1.71、1.95和2.32倍。

圖 1 C10-HSL對(duì)小球藻細(xì)胞密度的影響Fig. 1 The effect of C10-HSL on cell density of Chlorella vulgaris

2.2 C10-HSL對(duì)小球藻PSⅡ光化學(xué)活性的影響

C10-HSL對(duì)小球藻Fv/Fm的影響 Fv/Fm為最大量子產(chǎn)量, 反映了植物PSII潛在最大光合能力,有研究表明環(huán)境條件改變時(shí)微藻Fv/Fm會(huì)發(fā)生顯著變化[19,20]。如圖 2所示, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中各試驗(yàn)組Fv/Fm呈不斷上升的趨勢(shì), 同時(shí)相較于對(duì)照組C10-HSL處理明顯促進(jìn)了小球藻Fv/Fm的提高, 且表現(xiàn)出C10-HSL濃度越高促進(jìn)作用越強(qiáng)的規(guī)律。在實(shí)驗(yàn)期間,對(duì)照組小球藻Fv/Fm變化幅度很小, 表現(xiàn)出微藻自然生長(zhǎng)狀態(tài)下Fv/Fm維持相對(duì)穩(wěn)定的特征。C10-HSL處理組小球藻Fv/Fm均明顯高于對(duì)照組, 而且不同濃度的C10-HSL對(duì)微藻Fv/Fm的影響規(guī)律近乎一致,均呈現(xiàn)出0—48h緩慢上升, 48—84h快速上升的變化趨勢(shì)。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 100、200和300 nmol/L處理組的小球藻Fv/Fm已經(jīng)分別達(dá)到0.72、0.75和0.76, 較各組起始數(shù)值分別提高了18.03%、22.95%和24.59%。結(jié)果說(shuō)明, C10-HSL處理有助于PSII光合反應(yīng)中心活性的發(fā)揮, 顯著增強(qiáng)了小球藻的潛在最大光合能力。

C10-HSL對(duì)小球藻Yeild的影響 Yeild為實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量, 反映植物PSII在部分關(guān)閉情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率。如圖 3所示, 培養(yǎng)期間各試驗(yàn)組Yeild呈單調(diào)上升的變化趨勢(shì), 而相較于對(duì)照組C10-HSL對(duì)小球藻Yeild提高具有明顯的促進(jìn)作用, 且顯示出C10-HSL濃度越高促進(jìn)作用越強(qiáng)的特性, 說(shuō)明C10-HSL增強(qiáng)了小球藻PSII的實(shí)際光合能力。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, C10-HSL處理組小球藻Yeild均明顯高于對(duì)照組, 而且不同濃度的C10-HSL對(duì)微藻Yeild的影響規(guī)律近乎一致, 均表現(xiàn)出0—24h快速上升, 24—36h緩慢變化, 36h之后繼續(xù)快速提高的變化趨勢(shì)。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 100、200和300 nmol/L處理組的小球藻Yeild已經(jīng)分別達(dá)到0.45、0.46和0.47, 較各組起始數(shù)值分別提高了25.00%、27.77%和30.56%。另外, 通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)期間處理組Yeild和Fv/Fm的增量變化, 發(fā)現(xiàn)C10-HSL處理后小球藻Yeild變化幅度高于Fv/Fm, 說(shuō)明C10-HSL對(duì)微藻實(shí)際光合能力的影響強(qiáng)于對(duì)其最大光合潛力的作用。

C10-HSL對(duì)小球藻ETR的影響 ETR為表觀光合電子傳遞速率, 是反映植物PSII反應(yīng)中心活性與光合電子傳遞效率強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo), 其數(shù)值與光強(qiáng)、植物吸收入射光和能量分布比例以及光子通量密度有關(guān)。如圖 4所示, 各試驗(yàn)組ETR隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不斷上升, 同時(shí)與對(duì)照組相比C10-HSL處理明顯促進(jìn)了小球藻ETR的升高, 且C10-HSL濃度越高促進(jìn)作用越強(qiáng)。培養(yǎng)期間, C10-HSL處理組小球藻ETR均明顯高于對(duì)照組, 但是處理組間差異并不顯著。另外與Fv/Fm和Yeild的變化趨勢(shì)不同,小球藻ETR在實(shí)驗(yàn)初期即0—24h時(shí)上升幅度最大,此后ETR增加率逐漸趨于平穩(wěn)。微藻PSII反應(yīng)中心吸收光能后激發(fā)電子, 然后通過(guò)光合電子傳遞鏈將高能電子向其他受體傳遞, 電子傳遞速率和傳遞通路的情況直接決定了光合作用后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)程[21]。結(jié)果表明, C10-HSL有助于小球藻PSII反應(yīng)中心活性的發(fā)揮, 同時(shí)對(duì)保證光合電子傳遞效率也有一定的積極作用。

圖 2 C10-HSL對(duì)小球藻Fv/Fm的影響Fig. 2 The effect of C10-HSL on Fv/Fmof Chlorella vulgaris

圖 3 C10-HSL對(duì)小球藻Yeild的影響Fig. 3 The effect of C10-HSL on Yeild of Chlorella vulgaris

圖 4 C10-HSL對(duì)小球藻ETR的影響Fig. 4 The effect of C10-HSL on ETR of Chlorella vulgaris

2.3 C10-HSL對(duì)小球藻PSⅡ光合作用關(guān)鍵酶活性的影響

C10-HSL對(duì)小球藻Rubisco活性的影響 Rubisco是光合作用中最重要的酶之一, 既控制著CO2的固定, 同時(shí)又制約著碳向calvin循環(huán)和光呼吸過(guò)程的分流, 其活性大小直接影響著光合速率。如圖 5所示, 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Rubisco活性呈不斷上升的趨勢(shì), 而C10-HSL處理明顯促進(jìn)了Rubisco活力, 且C10-HSL濃度越高促進(jìn)作用越強(qiáng), 另外C10-HSL對(duì)Rubisco活力誘導(dǎo)的增長(zhǎng)率也隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷提高, 實(shí)驗(yàn)初始階段Rubisco活力上升緩慢, 到達(dá)48h時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn), 此時(shí)各實(shí)驗(yàn)組酶活存在顯著差異(P＜0.05), 100、200和300 nmol/L處理組的酶活力分別達(dá)到5.99、7.80和10.76 U/mg prot, C10-HSL影響Rubisco活力的劑量-效應(yīng)特征充分顯現(xiàn), 此后小球藻Rubisco活力迅速升高, 光合固碳能力迅速增強(qiáng)。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束, C10-HSL處理組的小球藻Rubisco活力分別達(dá)到14.92、20.94和29.23 U/mg prot, 為對(duì)照組的1.43、2.01和2.80倍。Rubisco良好的活性保證了微藻光合固碳生產(chǎn)有機(jī)物的能力, 也為種群的發(fā)展提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[22], 實(shí)驗(yàn)中小球藻細(xì)胞密度與Rubisco活力近乎一致的變化趨勢(shì)很好的印證了這一點(diǎn), 而C10-HSL促進(jìn)了這種共變關(guān)系的發(fā)展。

C10-HSL對(duì)小球藻TPI活性的影響 TPI是光合作用中參與calvin循環(huán)的關(guān)鍵酶, 催化磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉(zhuǎn)化, 磷酸二羥丙酮可以穿越葉綠體膜進(jìn)入胞漿, 并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖, 因此TPI是調(diào)控植物糖類合成的限速酶之一。如圖 5所示, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中TPI活性持續(xù)升高, 而C10-HSL處理明顯促進(jìn)了酶活力, 且C10-HSL濃度越高促進(jìn)作用越強(qiáng)。與Rubisco相比TPI活性隨時(shí)間上升的速率較為緩慢, 60h時(shí)100、200和300 nmol/L處理組酶活力分別為1.65、2.90和4.46 U/mg prot, 僅比初始水平提高了1.59、2.26和3.96倍, 此后酶活增速加快直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束達(dá)到峰值, 這時(shí)C10-HSL處理組酶活力分別達(dá)到4.41、9.95和11.71 U/mg prot, 較初始數(shù)值提高了5.89、10.18和12.01倍。實(shí)驗(yàn)中C10-HSL明顯促進(jìn)了小球藻TPI活力的持續(xù)升高, 說(shuō)明C10-HSL有助于增強(qiáng)微藻合成糖類的能力。

C10-HSL對(duì)小球藻PFP活性的影響 PFP催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化,是光合作用碳代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶。如圖 7所示, 各組小球藻PFP活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 在實(shí)驗(yàn)的48h時(shí)PFP活性出現(xiàn)峰值。與對(duì)照相比C10-HSL處理可以明顯增強(qiáng)微藻PFP活力,且C10-HSL濃度越高促進(jìn)作用越強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)的0—24h酶活力變化速率較低, 在36h時(shí)開(kāi)始迅速上升,尤其是300 nmol/L處理組PFP活力已經(jīng)達(dá)到14.46 U/ mg prot, 為對(duì)照的4.42倍。培養(yǎng)到48h時(shí)PFP活性達(dá)到峰值, 100、200和300 nmol/L處理組的酶活力分別為8.64、12.05和17.54 U/mg prot, 較起始階段分別提高了4.53、7.43和10.24倍。此后酶活性迅速下降, 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)PFP活性達(dá)到最低值, C10-HSL處理組的酶活僅為0.93、1.62和2.20 U/mg prot, 較峰值分別下降了89%、86%和87%。果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸是光合作用不同反應(yīng)階段的底物和產(chǎn)物, 二者作用的雙重性決定了它們?cè)诩?xì)胞中的含量與轉(zhuǎn)化必須達(dá)到合適的平衡[23], 實(shí)驗(yàn)中PFP活力先升高后降低的趨勢(shì)反映了微藻細(xì)胞中果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化速率的變化, 峰值則代表了二者相對(duì)含量平衡點(diǎn)的位置, 結(jié)果顯示C10-HSL明顯提高了PFP活力的變動(dòng)幅度和峰值, 表明C10-HSL的作用影響了果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸的轉(zhuǎn)化速率和平衡點(diǎn)。

圖 5 C10-HSL對(duì)小球藻Rubisco活力的影響Fig. 5 The effect of C10-HSL on Rubisco of Chlorella vulgaris

圖 6 C10-HSL對(duì)小球藻TPI活力的影響Fig. 6 The effect of C10-HSL on TPI of Chlorella vulgaris

C10-HSL對(duì)小球藻FDA活性的影響 FDA

是參與磷酸戊糖途徑和calvin循環(huán)的重要酶, 催化果糖-1,6-二磷酸和景天庚酮糖-1,7-二磷酸的合成反應(yīng), 是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵限速酶之一。與PFP活性變化類似, 小球藻FDA活力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì), 酶活性峰值出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的60h時(shí), 較PFP相對(duì)滯后(圖 8)。與對(duì)照相比處理可以明顯增強(qiáng)微藻FDA活力, 且C10-HSL濃度越高促進(jìn)作用越強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)初始階段FDA即表現(xiàn)較高的活性水平, 此后酶活力穩(wěn)步上升直至達(dá)到峰值, 此時(shí)C10-HSL處理組的FDA活力分別為15.66、18.87和24.69 U/mg prot, 較起始階段分別提高了5.53、6.15和11.47倍。此后酶活性緩慢回落, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)C10-HSL處理組PFP活力為5.05、8.65和10.04 U/mg prot, 較峰值分別下降了68%、54%和59%。果糖-1,6-二磷酸是光合磷酸化過(guò)程的重要參與者, 景天庚酮糖-1,7-二磷酸是光合固碳反應(yīng)中CO2受體核酮糖-1,5-二磷酸的前體, 二者的合成速率對(duì)光合反應(yīng)進(jìn)程有重要影響[24], 實(shí)驗(yàn)中PFP活力的波動(dòng)反映了微藻細(xì)胞中光合磷酸化與CO2固定速率的變化, 而C10-HSL明顯提高了FDA活性的變動(dòng)幅度和峰值,說(shuō)明C10-HSL的作用影響了小球藻光合磷酸化與CO2固定的過(guò)程。

圖 7 C10-HSL對(duì)小球藻PFP活力的影響Fig. 7 The effect of C10-HSL on PFP of Chlorella vulgaris

圖 8 C10-HSL對(duì)小球藻FDA活力的影響Fig. 8 The effect of C10-HSL on FDA of Chlorella vulgaris

3 討論

以往的研究多把AHLs看做藻類生長(zhǎng)的脅迫因子, 在其作用下藻類生長(zhǎng)及一系列正常生理指標(biāo)受到抑制[25—27]。與此不同的是, 本研究發(fā)現(xiàn)微量C10-HSL促進(jìn)了普通海水小球藻生長(zhǎng), 顯著提高了微藻細(xì)胞密度(P＜0.05), 這與Rivas等[28]證實(shí)的藻際共棲菌Pseudomonas sp.和Rhizobium sp.產(chǎn)生的C6-HSL會(huì)顯著提高布朗葡萄藻Botryococcus braunii生物量的結(jié)論相吻合。由于微藻主要依靠光合作用來(lái)積累生物量并發(fā)展種群, 因此微量C10-HSL提高小球藻細(xì)胞密度的原因很有可能就在于AHLs對(duì)微藻光合生理的促進(jìn)。有文獻(xiàn)[29]指出, 在正常狀態(tài)下藻類的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm值穩(wěn)定在0.65左右, 當(dāng)受到環(huán)境脅迫時(shí)該值會(huì)顯著下降, 而在本研究中小球藻的Fv/Fm值處于0.60—0.77, 且表現(xiàn)出隨C10-HSL濃度升高Fv/Fm增大的趨勢(shì), 說(shuō)明C10-HSL對(duì)小球藻最大潛在光合能力的提高起到了促進(jìn)作用, 而非脅迫影響。另外決定光合速率的關(guān)鍵限速酶Rubisco在C10-HSL作用下活性顯著上調(diào), 進(jìn)一步在酶學(xué)水平上證明了C10-HSL對(duì)小球藻光合生理過(guò)程的促進(jìn)作用。需要指出的是植物光合作用是由許多代謝過(guò)程構(gòu)成的復(fù)雜反應(yīng)網(wǎng)絡(luò), 本研究只是考察了AHLs對(duì)其中幾個(gè)重要節(jié)點(diǎn)反應(yīng)的作用, 因此并不能把握AHLs影響光合生理的全貌, 所以后續(xù)的研究應(yīng)朝著高通量全局分析的方向發(fā)展。

另外AHLs家族的不同分子及處理濃度對(duì)其生物活性的發(fā)揮存在很大差異, 畢相東[30]發(fā)現(xiàn)在400 nmol/L的C6-HSL脅迫下小球藻PSII的D1蛋白表達(dá)量顯著下調(diào), 而烯醇酶的表達(dá)量顯著上調(diào), 表明C6-HSL在損傷微藻細(xì)胞光合機(jī)構(gòu)的同時(shí)加強(qiáng)了其厭氧呼吸速率, 周麗娟等[31]證實(shí)10—80 μmol/L的α-氨基-γ-丁內(nèi)酯氫溴酸(AHLs的一種)可以明顯抑制銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa和集胞藻Synechocysti sp.的生物量及蛋白表達(dá), 以上結(jié)果均與本研究的結(jié)論不同, 但也從另一方面說(shuō)明AHLs的生物活性取決于其分子結(jié)構(gòu)、作用濃度及作用對(duì)象, 因此摸索不同AHLs對(duì)資源微藻的生物活性差異有助于優(yōu)化藻-菌共生系統(tǒng), 同時(shí)也可以為微藻的集約化健康養(yǎng)殖提供參考, 本研究的結(jié)果說(shuō)明C10-HSL (有效作用濃度300 nmol/L)有成為養(yǎng)殖環(huán)境中小球藻生長(zhǎng)促進(jìn)劑的潛力。

有研究[8]表明AHLs介導(dǎo)的LuxI/LuxR雙元件系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌群感信號(hào)途徑的物質(zhì)基礎(chǔ), 該系統(tǒng)調(diào)控著微生物的種群動(dòng)態(tài)和代謝生理, 其中AHLs發(fā)揮了類似轉(zhuǎn)錄因子的作用, 但目前AHLs影響藻類生理的機(jī)制尚不明晰, AHLs分子是否同樣作為轉(zhuǎn)錄因子類似物影響藻類相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響其生理代謝的強(qiáng)度和途徑的疑問(wèn)至今未得到圓滿回答, 所以在基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平上探討AHLs對(duì)藻類生理過(guò)程的作用機(jī)制應(yīng)該作為未來(lái)研究的重要方向。

4 結(jié)論

(1) 在100、200和300 nmol/L C10-HSL作用下,小球藻生長(zhǎng)受到促進(jìn), 細(xì)胞密度顯著升高, 而且存在著隨C10-HSL濃度上升促進(jìn)作用增強(qiáng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系。(2) 在C10-HSL作用下小球藻PSⅡ光化學(xué)活性指標(biāo)——最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率Yeild及表觀光合電子傳遞效率ETR明顯提高, C10-HSL對(duì)Yeild的作用強(qiáng)于對(duì)Fv/Fm的影響。(3) 小球藻光合作用關(guān)鍵限速酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco、磷酸丙糖異構(gòu)酶TPI、焦磷酸: 果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶PFP、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶FDA活性均不同程度上升, 表明小球藻光合固碳及合成糖類的能力有所增強(qiáng)。

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EFFECTS OF AHLS ON PSⅡ PHOTOCHEMISTRY ACTIVITY AND PHOTOSYNTHESIS CRUCIAL ENZYMES OF CHLORELLA VULGARIS

DOU Yong, JIANG Zhi-Fei, ZHANG Wen-Hui, GAO Jin-Wei, JIANG Miao, SHI Xie-Yao and ZHOU Wen-Li
(Tianjin Key Lab for Aquaculture Ecology and Cultivation, Fisheries College of Tianjin Agriculture University, Tianjin 300384, China)

As an excellent resource microalgae, Chlorella has wide applications for aquaculture, production of biofueland development of functional food, which requires to develop the intensive cultivation pattern and optimize the breeding environment of Chlorella. AHLs(N-acyl-homoserine lactones)are known as the quorum sensing signal molecule produced by commensalism bacteria in phycosphere to regulate the biological function of bacteria and life activities of algae. This study was conducted to evaluate the effects of 100, 200, 300 nmol/LC10-HSL (N-decanoyl-L-homoserine lactones) on PS photochemistry activity and photosynthesis crucial enzymes of the marine microalgae Chlorella vulgaris in the photoautotrophic culture process. The results indicated that C10-HSL significantly increased the growth of C. vulgaris by enhanced cell density in dosage-dependent pattern. PS photochemistry activity indicators—Fv/Fm(maximal photochemical efficiency), Yeild (actual photochemical efficiency) and ETR (apparent photosynthetic electron transport ratio) increased obviously by C10-HSL. C10-HSL had higher effect on Yeild than Fv/Fm. The photosynthesis crucial enzymes—Rubisco (ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase), TPI (triose-phosphate isomerase), PFP (pyrophosphate: fructose-6-phosphate-1-phosphoric acid transferase) and FDA (fructose-1,6-bisphosphate aldolase) induced significantly by C10-HSL, indicating enhanced photosynthetic carbon fixation and carbohydrate synthesis.

AHLs; Marine Chlorella vulgaris; Photochemistry activity; Photosynthesis crucial enzymes

X173

A

1000-3207(2017)03-0629-08

10.7541/2017.80

2016-06-16;

2016-10-17

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(13JCZDJC29300); 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(FREU2015-04); 天津農(nóng)學(xué)院科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013NO8)資助 [Supported by the Key Projects of Applied Basic and Frontior Technology Research of Tianjin (13JCZDJC29300); Fund of Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, P. R. China (FREU2015-04); Scientific Research Plan Program of Tianjin Agricultural University (2013NO8)]

竇勇(1985—), 男, 山東淄博人; 博士, 講師; 主要從事微藻生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail: douyonghero@163.com

周文禮, E-mail: saz0908@126.com