李付鵬+譚樂(lè)和+郝朝運(yùn)

摘 要 以2份可拉種質(zhì)為材料，進(jìn)行可拉花粉離體萌發(fā)研究。結(jié)果表明，可拉花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基濃度為20 %蔗糖+200 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2。不同種質(zhì)花粉萌發(fā)規(guī)律不相同，24 h中Cl-1花粉萌發(fā)率隨著溫度的升高而持續(xù)升高，Cl-2花粉萌發(fā)率在12：00達(dá)到最高繼而降至較低水平。本研究結(jié)果將為可拉雜交育種，提高稔實(shí)率提供理論支撐。

關(guān)鍵詞 可拉 ；花粉 ；離體萌發(fā)

中圖分類(lèi)號(hào) S571.4

Abstract Studied with 2 copies of Korah germplasm materials of pollen germination on the body. The results showed that the tensile pollen germination of the optimum medium concentration of 20 % sucrose +200 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca （NO3）2. The pollen germination rate of different germplasm was not the same. The germination rate of Cl-1 in 24 h increased with the increase of temperature， and the germination rate of Cl-2 pollen reached the highest and then decreased to a lower level in 12：00. The results for Korah cross breeding， improve fertility rate and provide theoretical support.

Key words Korah ； pollen ； germination in vitro

可拉（Cola acuminata schott ex endl）屬梧桐科常綠喬木，原產(chǎn)于熱帶西非常綠低地和山區(qū)森林，廣泛分布于南北緯15°內(nèi)的熱帶地區(qū)，主要分布于北緯6°-7°以?xún)?nèi)的狹窄區(qū)域[1]。目前，可拉已種植于非洲、南美、大洋洲、東南亞的20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[2]，海南省及云南西雙版納是中國(guó)適宜種植可拉的地區(qū)?？衫N子含2 %的咖啡因和脂肪、蛋白質(zhì)等，具有與茶、咖啡同樣的刺激興奮作用，可用于制酒、飲料、巧克力和藥物等[3-4]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2012年世界可拉總產(chǎn)量為29.8萬(wàn)t，是西非熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有廣闊的發(fā)展前景。

中國(guó)于20世紀(jì)60年代開(kāi)始引種可拉，經(jīng)過(guò)多年觀察，在海南興隆地區(qū)能夠開(kāi)花結(jié)果[5]。通過(guò)試種發(fā)現(xiàn)，中國(guó)引種的2份可拉種質(zhì)每年均能正常開(kāi)花，然而稔實(shí)率偏低[6]；將2份可拉種質(zhì)混合種植，稔實(shí)率有所提高，并且種質(zhì)Cl-1的稔實(shí)率明顯高于種質(zhì)Cl-2?；ǚ勖劝l(fā)和生長(zhǎng)是受精以及結(jié)實(shí)的基礎(chǔ)，不同種質(zhì)、不同環(huán)境均會(huì)影響花粉萌發(fā)以及花粉管生長(zhǎng)。本研究以中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所收集保存的2份可拉種質(zhì)為材料，篩選可拉花粉離體萌發(fā)最佳的培養(yǎng)體系，分析海南種植可拉稔實(shí)率低的原因，也為可拉受精的生理特性研究、種質(zhì)創(chuàng)新奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所保存的2份可拉（Cola acuminata）種質(zhì)Cl-1和Cl-2（圖1）。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集

于晴天在9：00、12：00、15：00 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)剪取開(kāi)放的可拉花序，在實(shí)驗(yàn)室用鑷子夾取雄蕊，用細(xì)毛筆將花粉掃落于干凈的培養(yǎng)皿中，裝于離心管中，避光，備用。

1.2.2 花粉培養(yǎng)方法

花粉采用液體培養(yǎng)法。將濕潤(rùn)的濾紙平鋪于直徑為20 cm的培養(yǎng)皿中，凹面載玻片置于濾紙之上，并滴上配置好的各種液體培養(yǎng)基50 μL，再將收集的花粉撒播到培養(yǎng)基表面，為了保濕用封口膜將培養(yǎng)皿密封。置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 h。

1.2.3 試驗(yàn)處理

為篩選適宜的立體萌發(fā)培養(yǎng)基，利用不同濃度的蔗糖（Sucrose）、硼酸（H3BO3）、硝酸鈣（Ca（NO3）2）共組合出18種培養(yǎng)基（表1），每個(gè)處理3次重復(fù)。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，花粉萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基即為最適培養(yǎng)基，用于觀察比較不同種質(zhì)花粉萌發(fā)。

利用篩選出的15號(hào)培養(yǎng)基，分別將在9：00、12：00、15：00 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的Cl-1和Cl-2可拉花粉置于28 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)3 h，每份種質(zhì)3次重復(fù)。

1.2.4 萌發(fā)率檢測(cè)

使用4.5×10倍Olympus顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)的花粉總數(shù)、萌發(fā)花粉數(shù)，花粉萌發(fā)以其花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算花粉萌發(fā)率。

萌發(fā)率/%=（萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)）×100

2 結(jié)果

2.1 蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)的影響

由表2可見(jiàn)，蔗糖可促進(jìn)可拉花粉的萌發(fā)，并且花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的提高而增加。濃度為5 %時(shí)，花粉萌發(fā)率僅為23.6 %；當(dāng)濃度提高到20 %時(shí)，花粉萌發(fā)率顯著增加到48.7 %。說(shuō)明碳源對(duì)可拉花粉萌發(fā)十分必要，高濃度蔗糖會(huì)顯著促進(jìn)可拉花粉的體外萌發(fā)。

2.2 H3BO3對(duì)花粉萌發(fā)的影響

在一定濃度范圍內(nèi)，花粉萌發(fā)率隨培養(yǎng)基內(nèi)H3BO3濃度的增加而增加，但超過(guò)一定濃度時(shí)，H3BO3對(duì)花粉萌發(fā)具有抑制作用。最適可拉花粉萌發(fā)的H3BO3濃度為200 mg/L，在該培養(yǎng)基內(nèi)花粉萌發(fā)率達(dá)41.6 %；當(dāng)H3BO3濃度繼續(xù)增加到300 mg/L，花粉萌發(fā)率下降到36.9 %。

2.3 Ca（NO3）2對(duì)花粉萌發(fā)的影響

Ca（NO3）2對(duì)可拉花粉萌發(fā)的影響與H3BO3具有相同趨勢(shì)，同樣是在較低濃度范圍內(nèi)，隨著Ca（NO3）2濃度的提高，花粉萌發(fā)率增加，超過(guò)一定濃度后，花粉萌發(fā)率急劇下降。Ca（NO3）2濃度為300 mg/L時(shí)，可拉花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，為41.5 %。

2.4 不同種質(zhì)花粉萌發(fā)與采集時(shí)間的關(guān)系

由圖2可以看出，可拉花粉的萌發(fā)率與時(shí)間成明顯的相關(guān)性，并在不同種質(zhì)間表現(xiàn)出顯著的差異。上午9：00種質(zhì)Cl-1和Cl-2的萌發(fā)率均呈現(xiàn)出較低水平，均在15 %以下。隨著溫度的升高，中午12：00種質(zhì)Cl-1和Cl-2的花粉萌發(fā)率均大幅提升，種質(zhì)Cl-2的花粉萌發(fā)率達(dá)60.6 %。12：00之后，種質(zhì)Cl-1的花粉萌發(fā)率繼續(xù)升高，至下午15：00達(dá)80.3 %；種質(zhì)Cl-2的花粉萌發(fā)率轉(zhuǎn)而下降，下午15：00僅有12.4 %。說(shuō)明在1 d內(nèi)，可拉花粉的活性與溫度密切相關(guān)，種質(zhì)Cl-1的花粉活性隨著溫度升高而增加，而過(guò)高的溫度會(huì)影響種質(zhì)Cl-2的花粉活性。

3 討論

不同植物花粉體外萌發(fā)所需的最適培養(yǎng)基組分各有差異[7-9]。多數(shù)植物花粉的萌發(fā)及生長(zhǎng)與蔗糖、硼酸和Ca2+濃度有緊密關(guān)聯(lián)，各組分對(duì)花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)的作用有所不同，一定濃度的蔗糖、硼酸以及鈣元素對(duì)花粉萌發(fā)有良好的促進(jìn)作用。通過(guò)試驗(yàn)篩選，可拉花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基濃度為20 %蔗糖+200 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2。

可拉花分雄花、雌花和兩性花，兩性花比例不高，在10 %左右，在開(kāi)花當(dāng)天雄蕊雖已發(fā)育成熟，而散粉需1-2 d，授粉昆蟲(chóng)為蒼蠅[10]，花粉活性會(huì)直接影響到稔實(shí)率。通過(guò)分析開(kāi)花后1 d可拉花的花粉萌發(fā)率，一天中花粉的活性會(huì)發(fā)生顯著變化，并且不同種質(zhì)間萌發(fā)率的變化規(guī)律各不相同。一天中，2份可拉種質(zhì)的花粉萌發(fā)率具有一定的互補(bǔ)性，12：00之前Cl-2的花粉萌發(fā)率高于Cl-1，12：00之后Cl-1花粉仍有較高的活性。將Cl-1和Cl-2可拉混合種植，花粉可以自由散播，有助于稔實(shí)率的提升。種質(zhì)Cl-2的稔實(shí)率低于Cl-1，二者之間差異在于12：00花粉萌發(fā)率不同，除花粉活性的因素外，是否與柱頭親和性、花粉管生長(zhǎng)等相關(guān)有待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1] Pan A， Jacobs B. The earliest record of the genus Cola （Malvaceae sensu lato： Sterculioideae） from the Late Oligocene （28-27 Ma） of Ethiopia and leaf characteristics within the genus[J]. Plant Systematics and Evolution，2009，283：247-262.

[2] Lim T K. Edible medicinal and non medicinal plants[M]. Cola nitida，2012：175-183.

[3] Beattie G B. Soft drink flavours： their history and characteristics[M]. Cola for kola flavours，The Flavour Industry， 1970：390-394.

[4] Ogutuga D B A. Chemical composition and potential commercial uses of kola nuts Cola nitida（Vent.） schott & endlicher[J]. Ghana Journal of Agricultural Science， 1975， 8：121-125.

[5] 董云萍，龍宇宙，邢谷楊，等. 可拉引種試種研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，21（1）：1-8.

[6] 董云萍，楊逢春，吳 剛. 海南興隆地區(qū)可拉果實(shí)性狀分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（12）：28-30.

[7] 王勝華，陳 放，周開(kāi)達(dá). 水稻花粉的立體萌發(fā)[J]. 作物學(xué)報(bào)，2000，26（5）：609-612.

[8] 戴 麗，孫 鵬，蔣晉豫. 刺槐、紅花刺槐、四倍體刺槐花粉體外萌發(fā)對(duì)比[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（1）：1-5.

[9] 秦 萌，栗 燕，唐麗丹，等. 紫薇花粉的貯藏方法及離體萌發(fā)研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，46（6）：637-641.

[10] List of crop plants pollinated by bees[DB/OL]. http：//en.wikipedia.org/w/index.php？oldid=446284805.