沈 烽，趙大勇**，黃 睿，王司辰，曹新益，徐慧敏，曾 巾，余鐘波

(1：河海大學(xué)水文水資源與水利工程科學(xué)國家重點實驗室，南京 210098) (2：河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，南京 210098) (3：中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

南京玄武湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系*

沈 烽1,2，趙大勇1,2**，黃 睿1,2，王司辰1,2，曹新益1,2，徐慧敏1,2，曾 巾3，余鐘波1,2

(1：河海大學(xué)水文水資源與水利工程科學(xué)國家重點實驗室，南京 210098) (2：河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，南京 210098) (3：中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

應(yīng)用16S rRNA基因末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)和多元統(tǒng)計方法，探究了南京玄武湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化，并找出了浮游細(xì)菌群落組成分布的主要影響因子. 結(jié)果表明，玄武湖4個季節(jié)中夏季Invsimpson指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Pielou指數(shù)最高，而春季最低. 非度量多維尺度分析結(jié)果顯示浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在著明顯的季節(jié)性變化. Mantel檢驗、典范對應(yīng)分析、變量分割分析表明影響玄武湖細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最顯著的環(huán)境因子為溫度，其次為pH. 營養(yǎng)鹽濃度對玄武湖細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著. 總的來說，本研究將有助于更好地理解富營養(yǎng)化水體中的浮游細(xì)菌群落組成的季節(jié)變化規(guī)律.

浮游細(xì)菌；末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)；多元統(tǒng)計；玄武湖

南京玄武湖是典型的富營養(yǎng)化城市湖泊，早在1980s后期已經(jīng)處于嚴(yán)重富營養(yǎng)化狀態(tài). 近年來通過底泥疏浚、截污等方式水質(zhì)有了明顯的改善. 已經(jīng)有不少工作研究了玄武湖重金屬污染[1]以及浮游植物[2]、浮游動物的變化[3]等，但是對于玄武湖浮游細(xì)菌的研究還比較少.

浮游細(xì)菌是一種有著極高遺傳多樣性的生物，也是湖泊淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其在生物化學(xué)地球循環(huán)過程中扮演著重要的角色[4-5]. 在城市地區(qū)，由于人類生產(chǎn)生活排放的大量污染物進(jìn)入湖泊，改變了湖泊原有的營養(yǎng)負(fù)荷，使得耐污染的細(xì)菌大量繁殖. 對于像玄武湖這樣的處于退化狀態(tài)的水生態(tài)系統(tǒng)，大型水生生物極少，生物多樣性極低，以這些生物作為生態(tài)系統(tǒng)的表征指標(biāo)，無法為生態(tài)系統(tǒng)健康的評價提供足夠的信息[6]. 浮游細(xì)菌個體結(jié)構(gòu)簡單，對環(huán)境變化敏感，通過對外部環(huán)境變化的靈敏響應(yīng)，其多樣性和群落組成能真實反映水環(huán)境質(zhì)量的狀況[7]，也可作為水生生態(tài)系統(tǒng)健康狀況評估的指標(biāo)[8-9].

Zeng等[10]已經(jīng)對玄武湖浮游細(xì)菌的空間分布差異做了研究，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)對玄武湖浮游細(xì)菌群落時間變化的研究. 劉蘭英等[11]通過研究福州左海的浮游細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)季節(jié)變化是決定浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素. 季節(jié)變化會導(dǎo)致湖泊水體溫度、pH等環(huán)境因子的變化，同時改變浮游植物光合作用，導(dǎo)致水體中有機(jī)物含量發(fā)生變化[12]. 在城市水體人類活動輸入的營養(yǎng)物質(zhì)也可能對水體浮游細(xì)菌產(chǎn)生重要的影響[13]. 但是，不同環(huán)境因子對玄武湖浮游細(xì)菌群落變化影響的貢獻(xiàn)大小目前尚不清楚. 因此，有必要研究玄武湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化，并揭示導(dǎo)致這種變化的主要環(huán)境因子.

1997年，Liu等[14]首先應(yīng)用末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)研究微生物的多樣性，與其他指紋圖譜技術(shù)相比，T-RFLP具有以下優(yōu)點：(1)能夠迅速產(chǎn)生大量重復(fù)、精確的數(shù)據(jù)[15]；(2)數(shù)據(jù)的輸出形式允許對大量信息的快速分析；(3)根據(jù)末端限制性片段(T-RFs)的長度與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，有可能直接鑒定群落圖譜中的單個菌種[16]. 近年來T-RFLP技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于土壤[17-18]、湖泊沉積物[19]、淡水水體[20]等生境中微生物群落的研究.

本文應(yīng)用T-RFLP技術(shù)，對玄武湖不同季節(jié)水體中浮游細(xì)菌群落組成進(jìn)行研究，探討浮游細(xì)菌群落組成的季節(jié)變化，進(jìn)而探究浮游細(xì)菌群落演替機(jī)制. 同時，通過多種多元統(tǒng)計方法研究浮游細(xì)菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系，找出影響玄武湖浮游細(xì)菌群落組成變化的關(guān)鍵環(huán)境因子，相關(guān)結(jié)果可為玄武湖富營養(yǎng)化水體的生態(tài)修復(fù)提供參考.

圖1 玄武湖采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling sites in Xuanwu Lake

1 材料與方法

1.1 樣品采集與準(zhǔn)備

2011年1月至2012年1月，分4個季節(jié)在南京市玄武湖采集水體樣品. 在玄武湖的北湖、東南湖和西南湖3個湖區(qū)各設(shè)置2～3個采樣點(圖1). 最終，春、夏、秋、冬4個季節(jié)的實際樣品數(shù)分別為6、8、9、9個. 每次采樣用采水器采集水面以下0.5 m處的水樣1000 ml，分裝在經(jīng)過滅菌處理的藍(lán)色玻璃瓶中，并現(xiàn)場測定水溫(T)及pH. 采集的水樣立即密封避光保存在保溫箱中，并盡快運回實驗室分析.

1.2 水體理化指標(biāo)分析

1.3 T-RFLP分析

取上述水樣通過0.22 μm濾膜過濾，采用Zeng等[10]DNA提取方法進(jìn)行DNA提取. PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用細(xì)菌通用引物對27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和926R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′). 前者5′端采用Cy5-N-羥基琥珀酰亞胺酯熒光標(biāo)記，PCR反應(yīng)體系和循環(huán)條件參照Zeng等[21]的方法進(jìn)行. 擴(kuò)增體系為50 μl，包含 5×PCR buffer 10 μl、0.25 mmol/L dNTP、2.5 mmol/L鎂離子、0.2 mmol/L上下游引物、10 ng DNA模板和2 U 的Taq酶，再加蒸餾水至50 μl. 擴(kuò)增程序為3 min 95℃的預(yù)變性，1 min 94℃變性，1 min 55℃退火，1 min 72℃延伸，循環(huán)30次，最后進(jìn)行7 min 72℃的延伸，4℃保存. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

用綠豆酶30℃消化PCR產(chǎn)物30 min. 用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)純化消化后的產(chǎn)物. 然后，用限制性核酸內(nèi)切酶HhaI(Takara, Otsu, Japan)37℃消化3 h，之后使用CEQ8000 (BeckmanCoulter, Fullerton, CA, USA)核酸片段分析儀對酶切產(chǎn)物進(jìn)行T-RFLP分析. 分析中只考慮長度介于60～600 bp(bp表示該片段所具有的堿基數(shù)，下同)以及相對豐度超過1%的片段的末端限制性片段，即T-RFs. 按照T-RFs占各個樣品的豐度百分比標(biāo)準(zhǔn)化，再分別計算每個樣品細(xì)菌群落的Invsimpson指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)(H′)和Pielou指數(shù)(J)，用它們反映水體中浮游細(xì)菌的多樣性和均勻度. 計算公式如下：

(1)

(2)

J=H′/lnS

(3)

式中，Pi為峰面積占總面積的比例，即T-RFs的相對豐度；S為T-RF數(shù).

對每個季節(jié)的多樣性指數(shù)兩兩做t檢驗，若P<0.05則認(rèn)為這兩個季節(jié)的多樣性指數(shù)有顯著差異，在圖中用不同的小寫字母區(qū)分.

1.4 多元統(tǒng)計分析

非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)用于判定不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性；典范對應(yīng)分析(canonical correlation analysis, CCA)用于研究環(huán)境因子對浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響；Mantel及偏Mantel檢驗用于探究環(huán)境差異與群落結(jié)構(gòu)差異的相關(guān)性；基于冗余分析(redundancy analysis, RDA)的變量分割分析(variation partitioning analysis, VPA)用于研究不同環(huán)境因子對群落差異的貢獻(xiàn)大小. 所有的統(tǒng)計分析方法都應(yīng)用R語言軟件(The R Programming Language, version 3.2.3)中的Vegan程序包完成.

2 結(jié)果

2.1 玄武湖水質(zhì)參數(shù)

玄武湖氮、磷濃度在4個季節(jié)都已經(jīng)達(dá)到了“中-富”級富營養(yǎng)化水平(Thomas標(biāo)準(zhǔn)[22]中-富級：無機(jī)氮介于0.5～1.5 mg/L; TP介于0.03～0.10 mg/L)，大部分都達(dá)到了“富”級水平(Thomas標(biāo)準(zhǔn)富級:無機(jī)氮>1.5 mg/L; TP>0.1 mg/L). 在秋、冬季TN濃度有著明顯的提高，平均濃度分別達(dá)到2.321和3.038 mg/L(表1).

表1 玄武湖水體物理化學(xué)指標(biāo)

2.2 Alpha多樣性指數(shù)分析

根據(jù)T-RFLP圖譜中T-RF數(shù)和豐度，分別計算各樣品細(xì)菌的多樣性指數(shù). Invsimpson指數(shù)表明夏季玄武湖細(xì)菌群落的多樣性要顯著高于春季和冬季，Shannon-Wiener指數(shù)也表明夏季的細(xì)菌群落多樣性相對要比其他季節(jié)高. 此外，從Pielou指數(shù)看出夏季細(xì)菌群落中物種分布較為均勻. Invsimpson和Shannon-Wiener指數(shù)都表明玄武湖在春季細(xì)菌群落的多樣性最低，并顯著低于其他季節(jié)(P<0.05)(圖2).

圖2 玄武湖4個季節(jié)浮游細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)變化Fig.2 Variations of the Alpha diversities of the bacterioplankton community in Xuanwu Lake in four seasons

2.3 不同季節(jié)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異

為了探究不同季節(jié)玄武湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的可能差異，計算了樣品間T-RFs的差異性(Bray-Curtis距離)，采用NMDS分析方法，繪制出樣品的二維分布圖(圖3). 可以看出，玄武湖不同季節(jié)的樣品彼此重疊很小，這表明不同季節(jié)之間有比較顯著的差異. 其中，春季和冬季的樣品點距離相對比較相近，秋季和夏季的點比較相近，這表明春季、冬季樣品中細(xì)菌群落組成比較相似，夏季和秋季樣品中細(xì)菌群落組成相對比較相似. 從圖中箭頭可以看出，箭頭的指向不是一條直線，從春季變化到夏季后有“折返”的現(xiàn)象，通過秋季又到達(dá)和春季相近的冬季，從中可看出玄武湖中浮游細(xì)菌群落組成的季節(jié)性演替.

2.4 浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

圖3 玄武湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的NMDS分析Fig.3 Two-dimensional NMDS map of composition of bacterioplankton community structure in Xuanwu Lake

圖4 玄武湖樣品浮游細(xì)菌群落與環(huán)境因子的CCA分析Fig.4 CCA ordination biplot between sampling sites of Xuanwu Lake and environment factors

Mantel及偏Mantel檢驗被用來分析樣品間浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異與環(huán)境變量差異的相關(guān)性. 樣品間浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異通過計算樣品間T-RFs組成的Bray-Curtis距離所確定，樣品間環(huán)境變量的差異通過

表2 環(huán)境因子與CCA排序軸的相關(guān)性分析

1)顯著水平基于1000次置換；***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05，下同.

表3 玄武湖樣品微生物群落組成1)和環(huán)境變量的Mantel和偏Mantel檢驗

Tab.3 Mantel and partial Mantel tests for the correlations between the bacterioplankton community composition in sampling sites of Xuanwu Lake and environmental variables

影響Mantel檢驗偏Mantel檢驗r控制r溫度0．523???pH營養(yǎng)物質(zhì)0．523???pH0．227??溫度營養(yǎng)物質(zhì)0．227??營養(yǎng)物質(zhì)-0．137溫度pH-0．121

為了定量分析不同類型的環(huán)境因子對于微生物群落結(jié)構(gòu)變異的影響作用大小，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了VPA分析. 結(jié)果(圖5)表明，pH、溫度以及營養(yǎng)物質(zhì)濃度分別單獨解釋了微生物群落變異的5.27%(P<0.05)、16.37%(P<0.001)和9.57%(P=0.621). 所有環(huán)境變量的解釋量為33.79%.

3 討論

本文通過T-RFLP技術(shù)研究了南京玄武湖浮游細(xì)菌群落的季節(jié)性變化. Alpha多樣性指數(shù)分析表明，不同季節(jié)玄武湖浮游細(xì)菌群落的多樣性是不同的. 夏季玄武湖的浮游細(xì)菌多樣性最高，而春季最低. 邢鵬等[25]、Wu等[26]對太湖浮游細(xì)菌的研究也得出了類似的結(jié)論，這可能是富營養(yǎng)化湖泊共有的特征. 研究表明，浮游細(xì)菌與浮游藻類的群落結(jié)構(gòu)有著密切的相關(guān)性[27-28]. 浮游藻類生物量也在夏、秋季達(dá)到一年的最大值，浮游藻類分泌到胞外以及細(xì)胞破裂產(chǎn)生的有機(jī)物是細(xì)菌分解作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能成為細(xì)菌營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源[29]. 因此，對于浮游細(xì)菌群落變化的研究可以在一定程度上反映浮游藻類群落變化.

圖5 環(huán)境變量與玄武湖樣品細(xì)菌群落的VPA分析Fig.5 VPA analysis of bacterial communities in sampling sites of Xuanwu Lake and environmental variables

多樣性指數(shù)的季節(jié)變化說明玄武湖中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨著季節(jié)變化. NMDS結(jié)果表明，浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)從春季開始隨著時間的推移到達(dá)和春季相差最大的夏季，最終又回到和春季相近的冬季的結(jié)構(gòu). 這說明隨著環(huán)境因子變化到接近于最初始的狀態(tài)，細(xì)菌群落也能回到近似于初始狀態(tài)時的結(jié)構(gòu). Deng等[30]在研究鈾污染修復(fù)時發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)境的變化微生物的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，當(dāng)一段時間后，微生物群落結(jié)構(gòu)能夠恢復(fù)到近似于變化前的狀態(tài). 這與我們的研究結(jié)果相一致.

進(jìn)一步采用CCA分析探究導(dǎo)致玄武湖細(xì)菌群落產(chǎn)生這種季節(jié)性變化的原因. CCA分析結(jié)果表明，溫度、pH對群落結(jié)構(gòu)有著極其重要的影響，氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定影響，但影響作用不如前兩者. 已有的研究表明，微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性與空間[31]、時間[32-33]、環(huán)境變量(如溫度、pH和營養(yǎng)鹽濃度)等因素有關(guān)[34]. 因此，根據(jù)環(huán)境因子的類型把環(huán)境變量劃分成溫度、pH和營養(yǎng)物質(zhì)(氮、磷等)3個組，以探究何種類型的環(huán)境因子對玄武湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大. Mantel和偏Mantel檢驗結(jié)果表明，溫度和pH對群落結(jié)構(gòu)有著極其顯著的影響(P<0.001). 但是，營養(yǎng)鹽對群落結(jié)構(gòu)差異的影響并不顯著. 有研究表明，在營養(yǎng)水平較低的湖泊中，營養(yǎng)鹽濃度可能是細(xì)菌生長的限制因子[35]. 但是馮勝等[12]在研究富營養(yǎng)化湖泊——太湖中發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)并不是浮游細(xì)菌生長的主要限制因子，本研究與其結(jié)論一致. 相反，溫度、pH能夠顯著影響浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu). 溫度直接影響著細(xì)菌的新陳代謝能力，是細(xì)菌生長和存活最重要的影響因素之一，隨著溫度的升高，細(xì)胞中生物化學(xué)反應(yīng)的速率和生長速率都會加快，但溫度升高超過一定界限也會使機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能受到影響[36]. 細(xì)菌生長同樣需要一個合適的酸堿環(huán)境，不同類群的細(xì)菌有其最適宜的pH范圍. Langenheder等的研究發(fā)現(xiàn)：在酸性的湖泊中細(xì)菌生長被抑制[37]，表明不同pH對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的選擇性. 在本研究中，各采樣站點屬于弱堿性環(huán)境，適合大部分細(xì)菌生長，同時也存在一定的梯度，因而會對浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的選擇性.

VPA分析表明，溫度對于變異的解釋量最高. 營養(yǎng)鹽雖然解釋量達(dá)到了9.57%，但是營養(yǎng)鹽中包含了多個變量，這是多個變量共同作用的結(jié)果，且影響并不顯著(P=0.621). 此外，溫度和pH共同解釋的量僅為0.26%，這說明溫度和pH對浮游細(xì)菌群落的影響是兩個不同的方向，彼此之間干擾較小，這與圖4中pH和溫度箭頭方向接近正交的結(jié)果是一致的. 所有環(huán)境變量的解釋量為33.79%，說明還有其他一些沒有檢測的環(huán)境因子對浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)起著重要作用.

與其他分子生物學(xué)技術(shù)相比，T-RFLP技術(shù)具有較高的分辨率，而且毛細(xì)管電泳裝置一次可以檢測多個樣品，對于大范圍長時間尺度的微生物群落結(jié)構(gòu)分析研究具有較好的實用性. 但是，由于基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增等實驗過程中產(chǎn)生的偏倚性[38-39]，T-RFLP可能無法完全準(zhǔn)確地反映環(huán)境樣品中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性. 同時，也有研究表明，對不同物種的序列進(jìn)行限制性酶切有可能得到相同的T-RFs，因此在T-RFLP 的圖譜上，一個峰代表的有可能不只是一個物種，所以為了了解每個T-RFs所代表的物種，還需要結(jié)合克隆文庫[40-41]等方法進(jìn)一步分析.

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Seasonal variation of bacterioplankton community structure in Xuanwu Lake(Nanjing) and its relationship with environmental factors

SHEN Feng1,2, ZHAO Dayong1,2**, HUANG Rui1,2, WANG Sichen1,2, CAO Xinyi1,2, XU Huimin1,2, ZENG Jin3& YU Zhongbo1,2

(1:StateKeyLaboratoryofHydrology-WaterResourcesandHydraulicEngineering,HohaiUniversity,Nanjing210098,P.R.China) (2:CollegeofHydrologyandWaterResources,HohaiUniversity,Nanjing210098,P.R.China) (3:StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment,NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

To explore the seasonal variations of bacterioplankton community structure in Xuanwu Lake and identify the main factors affecting bacterioplankton community composition, the bacterial 16S rRNA terminal restriction fragment length polymorphism technology and multivariate statistical methods were applied. The results show that the Invsimpson, Shannon-Wiener and Pielou indexes were the highest in summer, and the lowest in spring. Nonmetric multidimensional scaling analysis showed that bacterioplankton community structure exhibited a seasonal pattern. Mantel test, canonical correlation analysis and variation partitioning analysis show that the most significant environmental factor on the bacterioplankton community structure was temperature, and followed factor was pH. The influence of nutrient concentration was not significant. Overall, this study will be helpful for better understanding of the bacterioplankton community composition in eutrophic lakes.

Bacterioplankton; terminal restriction fragment length polymorphism technology; multivariate analysis; Xuanwu Lake

*國家自然科學(xué)基金項目(41371098，41571108)、水文水資源與水利工程科學(xué)國家重點實驗室專項研究經(jīng)費項目 (20145027312, 20155019012)、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費項目(2015B14214)和湖泊與環(huán)境國家重點實驗室開放基金項目(2014SKL010)聯(lián)合資助. 2016-03-23收稿； 2016-07-13收修改稿. 沈烽(1992 ～)，男，碩士研究生；E-mail：472779237@qq.com.

；E-mail: dyzhao@hhu.edu.cn.