趙廣紅，周立志**，董元秋，宋昀微,2

(1：安徽大學資源與環(huán)境工程學院，合肥 230601) (2：安徽升金湖國家級自然保護區(qū)管理局，池州 247200)

安徽升金湖越冬白頭鶴(Grusmonacha)腸道菌群組成的時間變化*

趙廣紅1，周立志1**，董元秋1，宋昀微1,2

(1：安徽大學資源與環(huán)境工程學院，合肥 230601) (2：安徽升金湖國家級自然保護區(qū)管理局，池州 247200)

腸道微生物對于維持動物消化道內環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義，而腸道微生物菌群結構也受寄主食物成份等外界環(huán)境因素的影響. 研究動物腸道微生物菌群結構可以更好地了解動物生活狀況. 以升金湖越冬白頭鶴的糞便作為研究對象，以微生物16S rRNA的 V3～V4區(qū)作為標記基因，進行高通量測序，分析升金湖越冬不同時期白頭鶴腸道菌群結構的差異性. 研究結果表明：升金湖越冬期不同時期白頭鶴糞便樣品中微生物多樣性指數如香農威納多樣性指數和辛普森指數無顯著性差異. 但是越冬期不同階段的糞便樣品中菌群組成存在差異，主要包括：在門分類水平，越冬前期擬桿菌門含量較高，厚壁菌門含量較中后期低；越冬中期放線菌門含量較高；越冬后期變形菌門含量較高. 在屬分類水平，相對于其他兩個時期，越冬前期普氏菌屬(Prevotella)含量較高，越冬中期桿菌屬(Lysinibacillus)含量較高，越冬后期梭菌屬(Clostridium)含量較高，并且普氏菌屬含量從越冬前期到中期、再到后期有明顯的下降趨勢，而梭菌屬含量從越冬前期到中期、再到后期有明顯的升高趨勢. 這些結果表明不同越冬時期白頭鶴腸道菌群組成不同，越冬期不同階段的食物變化可能作為一個影響因素.

白頭鶴；腸道菌群組成；越冬期；16S rRNA；升金湖

動物腸道微生物群落具有豐富的種類和功能多樣性[1]，這些微生物之間及微生物和宿主之間存在穩(wěn)定復雜的關系. 許多情況下，動物及其腸道微生物之間互利共生，協(xié)同進化[2]. 隨著16S rRNA作為微生物標記基因的應用以及高通量等分子生物學技術的發(fā)展，加之糞便取樣手段的引入，腸道微生物，特別是腸道微生物對宿主生理功能的影響，已經成為近年來研究的熱點問題[3]. 動物胃腸道菌群對宿主的營養(yǎng)、消化和吸收方面具有重要作用，腸道微生物含有很多分解酶可以降解食物中不易消化的成分，如多糖類纖維素類物質[4]，并且可以合成氨基酸、脂肪酸及維生素等宿主必需物質[5]. 同時腸道微生物在宿主免疫功能上也有重要作用[6].

腸道微生物在影響宿主動物生理功能的同時，其菌群結構也受到宿主生存環(huán)境的影響[7]，特別是宿主食性不僅能夠影響，而且在一定程度上能夠決定腸道微生物菌群組成[8]. 有研究表明，動物腸道微生物數目由肉食性到雜食性再到草食性呈逐步增加趨勢[9]. 在對人的腸道微生物研究時，由于飲食習慣的不同，不同地區(qū)生活的居民的腸道微生物菌落結構具有很大的差異，而相同地區(qū)生活的居民的腸道微生物菌落結構相似性較高[10-12]. 腸道微生物菌群結構對于動物的食性具有很強的適應性，大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)以竹子為主要食性，含有豐富的纖維素，在長期的進化過程中，在其腸道微生物中含有豐富的能夠分解纖維素的梭菌屬(Clostridium)[13].

白頭鶴(Grusmonacha) 屬于鶴形目，鶴科，為大型遷徙水鳥，屬于國家I級重點保護野生動物，世界自然保護聯盟(IUCN)紅色物種名錄中的易危物種[14]，長江中下游的升金湖是白頭鶴的重要越冬地，每年在此越冬的白頭鶴大約在300只左右[15]. 升金湖作為淺水內陸湖泊，含有豐富的生物資源，特別是每年冬季，大量的灘涂暴露，為越冬水鳥提供豐富的食物資源以及覓食棲息地[16]. 近幾年，由于湖泊漁業(yè)養(yǎng)殖、圍墾造田、水利建設、旅游開發(fā)等人為因素的干擾，白頭鶴的棲息地不斷退化，適宜的覓食生境不斷喪失[17]. 升金湖越冬白頭鶴覓食的主要生境為稻田和草灘[18]，但在不同的越冬階段，它們的相對重要性發(fā)生變化[19]. 白頭鶴在越冬前期選擇稻田作為主要覓食生境，以稻谷作為主要食物；越冬中期，白頭鶴對稻谷的利用率相對前期降低，但仍以稻谷作為最主要的食物資源；越冬后期，白頭鶴逐漸選擇草灘生境作為其主要覓食生境，以朝天委陵菜(Polygonumcriopolitanu)作為主要食物資源[20]. 因此，不同越冬階段白頭鶴腸道微生物菌群組成的研究對于了解食物資源變化對腸道微生物菌群結構的影響具有重要意義.

本文通過16S rRNA 高通量測序技術，研究升金湖越冬白頭鶴不同時期腸道菌群組成情況，揭示越冬不同時期白頭鶴腸道菌群組成的差異，結合食物資源的變化，探討越冬白頭鶴腸道微生物與外界環(huán)境之間的關系，為白頭鶴越冬生理生態(tài)和種群管理提供基礎資料.

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與保存

根據白頭鶴的遷徙規(guī)律和越冬地的自然氣候特征，將白頭鶴越冬期劃分為3個時期，即越冬前期、中期和后期[21]. 于2014年12月-2015年4月，采用非損傷采樣技術采集安徽省升金湖(30.25°～30.50°N, 116.92°～117.25°E)越冬白頭鶴的糞便樣品. 按照3個越冬時期采樣,即：2014年11月上旬-2014年12月下旬，越冬前期；2015年1月上旬-2015年2月下旬，越冬中期；2015年3月上旬-2015年4月上旬，越冬后期. 前期和中期采樣時間間隔為34天，中期和后期的采樣時間間隔為55天(表1).

在采集糞便樣品前，用雙筒望遠鏡和單筒望遠鏡觀察白頭鶴集中覓食區(qū)域，選擇集群較大的群體，觀察確保在白頭鶴覓食期間周圍50 m范圍內沒有其他鶴以及雁鴨類存在或者活動. 等到白頭鶴取食結束離開覓食地后，立刻前往覓食地點進行采集，根據白頭鶴留下的足跡或覓食坑，確定為白頭鶴覓食地點. 戴一次性消毒手套并用鑷子采集白頭鶴新鮮糞便樣品，去除接觸地面的部分后，迅速將樣品放入無菌50 ml離心管中，并貼好標簽，放在冰上運回實驗室，置于-80℃超低溫冰箱冷凍保存(表1).

表1 3個越冬時期白頭鶴糞便樣采集的詳細信息

1.2 DNA的提取

本實驗采用德國QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 糞便微生物基因組DNA提取試劑盒來提取糞便樣品中的細菌基因組DNA，提取方法嚴格按照試劑盒制造商的具體操作步驟進行，DNA提取樣品保存在 -20℃超低溫冰箱中以備后續(xù)實驗使用.

1.3 16S rRNA基因擴增及高通量測序

選擇通用引物338F (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)作為這次實驗的擴增引物[22]，對細菌16S rRNA V3～V4區(qū)進行PCR擴增. 實驗采用20 μl反應體系：10×ex Buffer，2 μl； 0.25 mmol/L dNTPs， 2 μl；正反向引物(20 mmol/L)各0.5 μl；DNA模板，10 ng；exTaq DNA Polymerase, 0.5 μl; ddH2O，12.9 μl. PCR反應循環(huán)程序設置：94℃預變性3 min；95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸45 s，反應27個循環(huán)后72℃終端延伸10 min，終止于4℃. PCR 產物經2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定. 將符合標準的樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Illumina Miseq測序平臺進行高通量測序.

1.4 數據分析

高通量得到的原始數據都是以Fastq文件格式保存，首先對原始測序數據進行質量控制 (去除含有模糊堿基、含有6個以上單堿基高重復區(qū)、長度小于200 bp的序列)，獲得純凈序列；通過COPE( Connecting Overlapped Pair-Eend, V1.2.1)軟件對序列進行拼接，并去除上、下游引物，最終得到優(yōu)化數據. 運用USEARCH(Vsesion 7.1http://drive5.com/uparse/)按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU(Operational Taxonomic Units)歸類操作并進行OTU豐度統(tǒng)計，運用Mothur進行Rarefaction分析，利用R語言工具繪制稀釋性曲線圖(Rarefaction Curve)[23]. 采用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個分類水平統(tǒng)計每個樣品的群落組成，置信度閾值為0.7[24]. 應用Mothur分析軟件，在97% OTU水平上計算Alpha多樣性指數(包括物種豐富度的兩個指數(Chao1和Ace))、辛普森(Simpson)指數和香農威納(Shannon-Wiener)指數[25]. 運用R語言軟件繪制主坐標分析圖(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)，研究樣本群落組成的相似性. 應用SPSS 19.0軟件對樣品數據進行統(tǒng)計學分析，P<0.05時為具有顯著性差異.

2 結果與分析

2.1 細菌的Alpha多樣性

9個樣本共得到337447條有效序列，平均每個樣品測得 37494條有效序列(表2). 序列長度在428～ 447 bp之間，符合16S rRNA 基因V3～V4區(qū)域及引物設計長度. 序列經過聚類后共得到708個OTU. 采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建稀釋性曲線(圖1)，用來說明樣本的測序數據量是否合理. 圖1結果顯示，在測序量比較小時，隨著測序量的增加OTU數量會顯著增加，而隨著測序量的逐漸增大新增OTU的數量逐漸變少，曲線趨于平坦，說明本研究中的測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU. 通過方差分析對3個時期OTU數量進行統(tǒng)計分析，得到F2,6=0.034，P=0.967，表明基于本文的數據，3個時期OTU數量未檢測出顯著性差異. 而通過取3個時期OTU數量平均值，越冬前期為323個，越冬中期和越冬后期分別為298和302個，說明在越冬前期糞便中的微生物豐度最高. 表2為越冬前中后期白頭鶴腸道微生物的Alpha多樣性指標，覆蓋率都在99%以上，為進一步了解升金湖越冬前中后期白頭鶴腸道菌群豐度和多樣性變化，通過方差分析對各個Alpha多樣性指標進行統(tǒng)計分析，得到Ace (F2,6=0.434，P=0.667)、Chao1 (F2,6=0.243，P=0.792)、香農威納指數(F2,6=0.095，P=0.911)和辛普森指數(F2,6=0.229，P=0.802)，表明基于本文的數據，并未檢測出顯著性差異.

表2 3個越冬時期白頭鶴腸道菌群的多樣性及豐富度指數

2.2 主坐標分析

本文運用主坐標分析形象化地展示3個時期糞便微生物組成的差異性. 結果表明，同一個越冬階段的糞便樣品微生物菌群組成相似性較高，而不同越冬階段的糞便樣品微生物菌群組成差異性較高(圖2).

圖1 稀釋性曲線(大寫字母代表樣品編號，下同)Fig.1 Rarefaction curve

圖2 主坐標聚類分析Fig.2 Principal co-ordinates analysis

2.3 微生物菌落組成

2.3.1 門分類水平分析 9個升金湖白頭鶴糞便樣品共檢測出26個門. 越冬前期共鑒定到20個門，優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes, 14.2%)、藍藻細菌門(Cyanobacteria, 34.5%)、擬桿菌門(Bacteroidetes, 28.2%)；越冬中期共鑒定到15個門，優(yōu)勢菌門包括厚壁菌門(40.4%)、放線菌門(Actinobacteria, 44.2%)和變形菌門(Proteobacteria, 10%)；越冬后期共鑒定到18個門，優(yōu)勢菌門包括厚壁菌門(43.2%)和變形菌門(31%).

在3個時期都檢測出的門有12個，其中厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍藻細菌門存在于所有樣品中，并且作為優(yōu)勢菌，在總序列中的比例達到92.3%. 越冬前期厚壁菌門較中后期含量較低，而擬桿菌門(28.2%) 相對越冬中期(3.6%)和越冬后期(0.4%)含量較高；越冬中期放線菌門(44.2%) 較越冬前期(8.4%)和越冬后期(3.2%)含量高；越冬后期變形菌門含量(31%) 較越冬前期(11.2%)和越冬中期(10%)高，并且越冬后期未能鑒定的門含量較高，明顯高于越冬前期(0.05%)和越冬中期(0.1%)，表明越冬后期樣品中存在大量未知的新類群(圖3A ).

2.3.2 屬分類水平分析 9個升金湖越冬白頭鶴糞便樣品共檢測到252個屬，主要屬在9個樣品中的分布見表3. 從圖3B可以看出3個時期糞便樣品菌群在屬水平上的分布，越冬前期共鑒定到201個屬，優(yōu)勢菌群為普氏菌屬，平均比例為24.3%，要明顯高于越冬中期(2.1%)和越冬后期(0.01%). 并且其含量從越冬前期到越冬中期再到越冬后期有明顯的降低趨勢(圖4A)，在越冬后期的3個樣品中只存在于樣品N中. 越冬中期共鑒定到175個屬，優(yōu)勢菌為桿菌屬(20.3%)、節(jié)細菌屬(18.3%)和冷細菌屬(15%). 越冬后期共鑒定到182個屬，占優(yōu)勢的菌群為腸桿菌屬(24.4%)和梭菌屬(10.6%)，其中梭菌屬含量要顯著高于越冬前期(P=0.046)，明顯高于越冬中期(2%)，并且從越冬前期到越冬中期再到越冬后期有明顯的升高趨勢(圖4B). 另外細菌纖維菌屬(Cellulomonas)和Cellulosilyticum在白頭鶴腸道微生物中的平均含量也呈現出越冬后期(0.1%、0.4%)明顯大于越冬前期(0.02%、0.05%)，這兩種細菌也可以降解食物中的纖維素.

表3 升金湖越冬白頭鶴糞便微生物屬分類水平的分布

圖3 3個越冬時期白頭鶴腸道菌群的門(A)和屬(B)組成Fig.3 Gut microbiota composition in Hooded Cranes at the phylum (A) and genus (B) taxonomical levels in the three wintering periods

圖4 普氏菌屬(A)和梭菌屬(B)在越冬前、中、后期的含量Fig.4 Contents of Prevotella (A) and Clostridium (B) in the three wintering periods

3 討論

3個時期升金湖越冬白頭鶴腸道微生物菌群結構特征均表現出含有較高的腸道微生物多樣性，越冬前、中、后期腸道菌群OTU數量以及多樣性指數并沒有顯著性差異. 但越冬前期OTU數量平均值最高，并且檢測到的門和屬最多，說明在越冬前期檢測到的細菌豐度及細菌種類最多. 通過主坐標分析，越冬前、后期樣品分別表現出相似性，表明越冬前、中、后期白頭鶴腸道菌群組成可能存在差異性. 動物的生存環(huán)境，特別是食性變化影響其腸道微生物菌群結構[26]，以前的研究顯示越冬期間白頭鶴覓食棲息地會發(fā)生變化，升金湖越冬白頭鶴在越冬前期主要以稻田生境為覓食棲息地，越冬后期主要以草灘生境為覓食棲息地[18]，這兩個時期食物相對單一，可能造成白頭鶴腸道菌群組成分別在這兩個時期表現出一定的相似性，而越冬中期作為兩個時期的過渡期，生境異質性較大，食物多樣化，可能造成白頭鶴腸道菌群構成在越冬中期相對于越冬前期和越冬后期差異性大.

升金湖白頭鶴腸道微生物在門分類水平上主要由厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍藻細菌門組成，與豬、馬、牛等哺乳動物以及麝雉、火雞、家禽等鳥類相似[27-30]. 屬分類水平上，共檢測到252個屬，以普氏菌屬、腸桿菌屬、桿菌屬、節(jié)細菌屬、梭菌屬和冷桿菌屬最為常見，這與豬的腸道微生物在屬水平上以放線桿菌屬、嗜血桿菌屬、巴氏桿菌屬、消化鏈球菌屬、梭桿菌屬、韋永氏球菌屬為主有差異，而與以草為主要食性的馬在腸道微生物分布上相似性較高，都含有較高的普氏菌屬和梭菌屬，并且都含有纖維菌屬.

不同越冬階段下白頭鶴腸道菌群組成分析表明，在越冬前期，擬桿菌門作為其優(yōu)勢菌，其中普氏菌屬比例較高，有關研究表明這種菌群結構在人類和其他動物的腸道微生物菌群結構中普遍出現[31-32]. 這種菌群結構的普遍存在可能與其功能有關，根據以前的研究，擬桿菌門主要參與碳水化合物發(fā)酵以及多糖、膽汁酸和類固醇代謝[33]，而普氏菌屬作為擬桿菌門中的重要細菌，主要參與腸道中碳水化合物以及植物蛋白質的分解代謝[34]，稻谷中含有大量的植物蛋白質、淀粉和脂肪，并且在以谷物等食性為主的人群的腸道菌群中含量較高[35-38]. 3個時期越冬白頭鶴腸道菌群組成分析表明，普氏菌屬作為越冬前期的優(yōu)勢菌，高于越冬中期和后期，并且隨著越冬時間呈現降低趨勢；而具有降解腸道中纖維素作用的梭菌屬[13]，在越冬后期含量較高，顯著高于越冬前期，明顯高于越冬中期. 這可能與升金湖越冬白頭鶴在越冬期間覓食棲息地及食性變化有關：越冬前期白頭鶴以稻谷為主要食性，越冬中期對稻谷利用率降低，在越冬后期稻田生境受到長時間的覓食消耗和春耕等原因，食物利用率最低[17]；而隨著越冬時間的推移，在越冬后期，進入早春階段，植被快速生長并進入花期，白頭鶴逐漸把草灘作為主要覓食地[39]，食物中可能含有較高的纖維素. 通過對2011年11月—2012年4月升金湖越冬白頭鶴糞便進行顯微鏡觀察，不同越冬期白頭鶴食物組成不同：前期為稻谷、蓼子草(51.96%、16.20%)；中期為稻谷、朝天委陵菜(30.94%、17.16%)；后期以朝天委陵菜、稻谷(46.74%、14.31%). 其中稻谷、蓼子草隨著越冬期的變化相對密度逐漸減小，朝天委陵菜逐漸增大[21]. 這一結果表明，白頭鶴越冬不同階段食物資源的變化可能對其腸道菌群組成造成了一定的影響，這種影響機制后期還需要進一步深入研究.

4 結論

本文對不同越冬階段下的白頭鶴腸道菌群組成做了初步探討，9個樣本得到337447條有效序列，經聚類后共得到708個OTU. 白頭鶴在不同越冬階段其腸道菌群組成不同，越冬前期擬桿菌門含量較高，厚壁菌門含量較中后期低；越冬中期放線菌門含量較高；越冬后期變形菌門含量較高. 在屬分類水平，越冬前期以普氏菌屬為優(yōu)勢菌；越冬后期以梭菌屬為優(yōu)勢菌，不同越冬階段下的食物變化可能作為影響白頭鶴腸道微生物菌群結構的一個重要因素，后期還需要進一步研究其對白頭鶴腸道微生物菌群組成的影響機制.

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The temporal variations of gut microbiota composition in overwintering Hooded Crane (Grusmonacha) at Lake Shengjin， Anhui Province

ZHAO Guanghong1, ZHOU Lizhi1**, DONG Yuanqiu1& SONG Yunwei1,2

(1:SchoolofResourcesandEnvironmentalEngineering,AnhuiUniversity,Hefei230601,P.R.China) (2:LakeShengjinNationalNatureReserveofAnhuiProvince,Chizhou247200,P.R.China)

The gastrointestinal microbiome plays a significant role in maintaining the stability of gastrointestinal environment of animals, and at the same time the composition of gastrointestinal microbial communities is also influenced by external environment such as diets. Studies on the gut microbiota structure can better understand the ecological conditions of animals. In this study, a total of 9 faeces samples were collected noninvasively from overwintering Hooded Cranes (Grusmonacha) at Lake Shengjin, Anhui Province. Through high-throughput sequencing of V3-V4 regions of 16S rRNA of microbiome, there are 337447 reads and 708 Operational Taxonomic Units (OTUs). The OTU abundance reached the highest in the early wintering period, clustering 586 OTUs with average 323 OTUs. A total of 20 bacterial phyla and 201 genera were identified in the early wintering period, representing 175 genera from 15 bacterial phyla in the mid-wintering period. A total of 18 bacterial phyla with 182 genera were identified in the late wintering period. The results showed that the microbial diversity index such as Shannon-Wiener index and Simpson index had no significant differences in fecal samples of different wintering periods at Lake Shengjin. However, microbial composition had certain differences among three periods. At the microbial phylum level, the phyla Firmicutes (14.2%), Cyanobacteria (34.5%), Bacteroidetes (28.2%) were predominated in the early wintering period, and the phyla Firmicutes (40.4%), Actinobacteria (44.2%) and Proteobacteria (10%) were predominated in the mid-wintering period, while the phyla Firmicutes (43.2%) and Proteobacteria (31%) were predominated in the late wintering period. At the genus level, compared with the other two wintering periods, the amount ofClostridiumwas higher in the late wintering period and the amount ofPrevotelladecreased distinctly from the early to the middle-late wintering periods, while the amount ofClostridiumincreased distinctly from the early to the middle-late wintering periods. The variation of composition of gastrointestinal microbial may be explained by changes of diets of the Hooded Cranes in the wintering period. The study shed some light on overwintering ecology of Hooded Cranes.

Hooded Cranes; gut microbiota composition; wintering periods; 16S rRNA; Lake Shengjin

*國家自然科學基金項目(31472020, 31172117)和安徽大學研究生創(chuàng)新項目(YQH100288)聯合資助. 2016-05-17收稿； 2016-09-09 收修改稿. 趙廣紅(1989～)，女，碩士研究生；E-mail: zhaoguanghongabc@163.com.

；E-mail: zhoulz@ahu.edu.cn.