王文娟, 吳蘭蘭, 雷曉慶, 趙懷玉, 林冬枝,2, 董彥君,2*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234; 2.上海師范大學(xué) 植物種質(zhì)資源開發(fā)中心,上海 200234)

一個新水稻低溫敏感葉色突變體tcm11的鑒定及基因定位

王文娟1, 吳蘭蘭1, 雷曉慶1, 趙懷玉1, 林冬枝1,2, 董彥君1,2*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234; 2.上海師范大學(xué) 植物種質(zhì)資源開發(fā)中心,上海 200234)

對粳稻“嘉花1號”經(jīng)60Coγ誘變處理獲得的穩(wěn)定遺傳低溫敏感葉色突變體tcm11(thermo-sensitive chloroplast mutant 11)進(jìn)行了表型鑒定與遺傳分析.在20 ℃條件下,該突變體三葉期之前幼苗均表現(xiàn)為黃色,光合色素含量明顯下降,葉綠體發(fā)育不完整,從第4葉開始逐漸轉(zhuǎn)為淺黃綠色直至最后死亡.而在32 ℃條件下,其表型與野生型相比沒有明顯差異,具有低溫敏感屬性.通過對培矮64S與tcm11雜交的F2代分離群體進(jìn)行遺傳分析,發(fā)現(xiàn)該低溫敏感突變體性狀是受單個隱性核基因(tcm11)控制,利用圖位克隆技術(shù)對tcm11進(jìn)行定位,將其定位在第11號染色體的InDel分子標(biāo)記ID13252與SSR分子標(biāo)記MM1361之間一個約1 566 kb的區(qū)域內(nèi).這也為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ).

水稻; 溫度敏感葉色突變體; 基因定位

0 引 言

水稻是世界上第二大糧食作物,也是中國最主要的糧食作物之一[1],因此如何提高水稻的產(chǎn)量以解決日益嚴(yán)峻的糧食不足問題顯得越發(fā)重要.光合作用是影響水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一,而葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官,葉色在很大程度上決定了光合作用的效率[2].葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場所,它是半自主性細(xì)胞器,由前質(zhì)體發(fā)育而來,其正常發(fā)育需要核基因和葉綠體基因相互協(xié)調(diào)[3].自然或非自然因素都會導(dǎo)致與葉綠素合成或葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因發(fā)生突變,造成葉綠素合成或降解受阻,葉綠體發(fā)育缺陷,最終引起葉色的變化.水稻葉色突變體種類很多,有一類突變體在不同溫度條件下會呈現(xiàn)不同的葉色表型,根據(jù)溫度對葉色標(biāo)記表達(dá)的影響,將水稻葉色突變體分為3種,即高溫表達(dá)型、低溫表達(dá)型和溫鈍型[4].低溫表達(dá)型(水稻低溫敏感葉色)突變體是指水稻突變體的葉色表型在一個相對低的溫度條件下才會發(fā)生與正常葉色有差異的變化.目前報道有cde2[5]、mr21[6]、Fan5[7]、tsc1[8]、tsl11[9]、tcm12[10]、tws[11]、lta1[12]、1103(s)[13]、v4[14]和v9[14]等,但其低溫誘導(dǎo)臨界溫度從20～28 ℃不等[15].另外,根據(jù)在低溫條件下的生長情況,又可分為低溫敏感致死型(如osv4)和低溫敏感轉(zhuǎn)綠型(如cde2)[15].

本文作者通過60Coγ輻射水稻粳稻“嘉花1號”得到一個新的低溫敏感葉色突變體tcm11,對該突變體的葉色表型、光合色素、葉綠體顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析,并利用了SSR及InDel分子標(biāo)記對該突變基因進(jìn)行了定位,為該基因的分子克隆及其作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用的低溫敏感葉色突變體tcm11是從粳稻“嘉花1號”種子經(jīng)60Coγ射線輻照后誘變所獲得的,經(jīng)多代自交繁育和選種,其農(nóng)藝性狀已經(jīng)穩(wěn)定.

1.2 方 法

1.2.1tcm11苗期葉色表型觀察

將突變體tcm11與野生型“嘉花1號”(WT)的種子分別在32 ℃條件下催芽3 d,然后將萌發(fā)的種子播種后分別置于20和32 ℃的光照培養(yǎng)箱(GXZ智能型,寧波江南儀器廠)中培養(yǎng),每天光照12 h,光子照度為180 μmol/(m2·s).每隔3 d觀察一次幼苗的生長情況,并適時觀察記錄葉片表型的變化.

1.2.2 葉片光合色素含量的測定

葉片光合色素含量的測定及計算方法參考[16].本實驗所取葉片是生長在20和32 ℃條件下的突變體tcm11和野生型“嘉花1號”的三葉期時的葉片,剪其第三葉片中間區(qū)域,稱取0.02 g,剪碎后放入具塞試管,加入5 mL葉綠素提取液(V(乙醇)∶V(丙酮)∶V(水)=5∶4∶1)到試管中,輕輕搖勻,后置于室溫黑暗的環(huán)境中處理18 h,直至葉片完全褪色.然后,利用METASH-UV5100分光光度計分別測定提取液在470、645和663 nm下的吸光度值,并利用該值分別計算出葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量.實驗重復(fù)3次,取平均值.

1.2.3 葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

葉片取樣與1.2.2相同,然后延葉脈方向剪成1 mm2的小正方形,之后立即放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定液(V(25%戊二醛)∶V(0.2 mol/L磷酸緩沖液)∶V(無菌水)=1∶4∶5)中,24 h后換新鮮固定液,4 ℃保存,固定好之后,進(jìn)行清洗,再固定,洗滌,脫水與硬化,置換,浸漬,包埋,聚合,修塊,切片,染色等一系列過程處理后,用透射電鏡(Hitachi765型)進(jìn)行觀察拍照.

1.2.4 遺傳分析和定位群體的構(gòu)建

2013年在上海以tcm11突變體為父本與母本培矮64S進(jìn)行雜交配組,獲得F1種子,2014年冬季F1種子種植在海南三亞,自交繁殖獲得F2種子,作為遺傳分析和定位群體.

1.2.5 水稻DNA的提取

本研究中,利用CTAB法[17]分別提取tcm11與培矮64S親本植株的DNA,而其F2代定位群體的DNA則是用快速簡便TPS法[18]進(jìn)行提取.

1.2.6 基因定位

首先利用本實驗室保存的SSR及InDel的分子標(biāo)記檢測突變體tcm11和培矮64S的多態(tài)性,然后選取均勻分布在水稻12條染色體上的有多態(tài)性的引物,隨機(jī)挑選F2中低溫(20 ℃)分離出的22株黃綠苗作連鎖分析,定位突變基因所在染色體,并進(jìn)一步擴(kuò)大F2群體進(jìn)行遺傳定位.在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)通過NCBI公布的粳稻日本晴和秈稻9311的全基因組序列的差異InDel位點,利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物(引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成)(表1),對突變基因進(jìn)行進(jìn)一步定位.應(yīng)用MAPMAK-ER/EXP3.0軟件[19],構(gòu)建目的基因區(qū)域的遺傳圖譜.PCR反應(yīng)體系包括:2μL模板DNA、1 μL 10 μmol/L引物、2.5 μL buffer for Taq DNA Pol、0.5 μL dNTP、1 μL DMSO、12 μL ddH2O、1 μL Taq酶(5U/μL),在Eppendorf和東勝PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s(退火溫度隨不同引物而變化),72 ℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min.反應(yīng)產(chǎn)物用2.5%～3.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,經(jīng)溴化乙錠染色后在UVP凝膠成像儀上成像,并拍照記錄.

表1 用于定位有多態(tài)的分子標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型

通過對突變體tcm11和野生型“嘉花1號”植株苗期葉色表型的觀察(圖1),結(jié)果顯示當(dāng)生長于20 ℃條件下時,tcm11從發(fā)芽后長出的葉鞘,第1葉(不完全葉)、第2葉及第3葉期幼苗均表現(xiàn)為黃化表型,從第4葉期開始,葉片逐漸轉(zhuǎn)為淺黃綠色,如圖1(a)所示,且在隨后的生長過程中持續(xù)保持直至最后死亡.當(dāng)其生長于32 ℃條件下時,tcm11的植株表型與野生型沒有明顯差異,如圖1(b)所示.這表明tcm11的表型與生長溫度和幼苗葉齡密切相關(guān),即突變體的葉色具有低溫敏感屬性.

圖1 野生型“嘉花1號”和突變體tcm11植株不同溫度條件下的生長過程.(a) 20 ℃,第2葉(左)、第3葉(中)、第4葉(右);(b) 32 ℃,第2葉(左)、第3葉(中)、第4葉(右)

2.2 突變體的光合色素含量變化

圖2 野生型“嘉花1號”和突變體tcm11植株在不同溫度條件下的三葉期葉片光合色素含量.(a) 20 ℃;(b) 32 ℃

對在不同溫度條件下突變體tcm11和野生型“嘉花1號”幼苗的三葉期葉片的光合色素測定結(jié)果(圖2)顯示,在20 ℃條件下,tcm11的光合色素含量(包括葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素)與野生型相比明顯降低,如圖2(a)所示;而在32 ℃條件下,tcm11和野生型的光合色素含量無明顯差異,如圖2(b)所示.此結(jié)果表明,tcm11在20 ℃下葉片中葉綠素含量明顯下降,導(dǎo)致植株表現(xiàn)為黃化.

2.3 突變體葉綠體顯微結(jié)構(gòu)

對突變體tcm11和野生型“嘉花1號”在20和32 ℃下生長至三葉期的第3葉的葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察(圖3),發(fā)現(xiàn)野生型“嘉花1號”無論在高溫和低溫條件下,葉綠體內(nèi)部都存在完整清晰的內(nèi)囊體片層結(jié)構(gòu),如圖3(a),(c)所示;突變體tcm11在20 ℃下,幾乎觀察不到一個完整的葉綠體,并且含有較多空泡,如圖3(d)所示,而在32 ℃下,與野生型無明顯差異,如圖3(b)所示.這說明突變體tcm11在低溫條件下葉綠體分化發(fā)育受到影響,導(dǎo)致光合色素不能正常積累,從而產(chǎn)生突變表型.

2.4 遺傳分析

2.5 基因定位

選取22株F2代突變型黃綠苗進(jìn)行連鎖分析,發(fā)現(xiàn)水稻第11號染色體上的分子標(biāo)記MM1172(圖4)有強(qiáng)烈的偏態(tài)擴(kuò)增,因此,確定tcm11位于第11號染色體,然后擴(kuò)大群體118株,如圖5(a)所示,將該基因定位在MM1159與MM1389之間,其遺傳距離分別為19cM和8.7cM.為了進(jìn)一步定位目標(biāo)基因區(qū)域,定位群體擴(kuò)大至3504株,將突變基因定位在ID13252與MM1361之間,物理距離約為1 566 kb,如

圖3 野生型“嘉花1號”和tcm11植株在不同溫度條件下的葉綠體顯微結(jié)構(gòu)(箭頭標(biāo)記為葉綠體).(a) WT,32 ℃;(b) tcm11,32 ℃;(c) WT,20 ℃;(d) tcm11,20 ℃

圖5(b)所示,并發(fā)現(xiàn)RM26601與突變基因共分離.根據(jù)(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和(http://rice.plantbiology.msu.edu)在該區(qū)間跨越了多個BAC克隆群(在AP005777.2與AP005631.3之間).

圖4 分子標(biāo)記MM1172在親本P1(嘉花1號)、P2(培矮64S)及22株具有突變表型F2代單株的DNA分離帶型

圖5 突變體tcm11的遺傳定位圖

3 結(jié) 論

水稻不僅是重要的糧食作物,也是單子葉植物和禾本科的模式植物,所以對水稻的功能基因研究極為廣泛,近來人們對水稻葉色突變體尤其是溫敏感葉色突變體的研究更為關(guān)注[15].鑒于溫度對水稻溫敏感葉色突變體葉綠體發(fā)育的影響,可以利用它們探究水稻的葉綠素合成、葉綠體發(fā)育、光合溫度響應(yīng)分子機(jī)制,同時在水稻遺傳改良、高產(chǎn)育種具有一定的應(yīng)用價值.

到目前為止,與tcm11定位于相同染色體且為低溫敏感葉色突變體的已知突變基因有tsl11[9],該突變體為一個幼苗葉色溫敏突變,在20 ℃條件下,與本研究中tcm11略有不同,幼苗葉色呈黃色,光合色素含量下降,葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)不完整;而在32 ℃條件下,其表型與野生型基本一致.經(jīng)遺傳分析表明,該tsl11突變體葉色性狀受一對隱性核基因控制,該tsl11基因定位在ID14506與ID14653之的147 kb的區(qū)間內(nèi).還有tcs1[8],該突變體在23.1 ℃條件下,為白化表型;而在30.1 ℃條件下,為與野生型相同的綠色表型.另外v4[14]和v9[14],這兩種突變體在20 ℃條件下,都為黃白色表型;而在30 ℃條件下,都表現(xiàn)為與野生型相同的綠色表型.雖然以上4種突變體都屬于低溫敏感葉色突變體,都與tcm11表型有些類似,但從基因定位區(qū)間上或表型不同來看,推測tcm11有可能是一個新的低溫敏感葉色突變體.

本研究發(fā)現(xiàn),tcm11突變體在低溫(20 ℃)條件下,其葉綠體的形成在葉片發(fā)育過程中受到嚴(yán)重阻礙,葉綠素?zé)o法正常合成,導(dǎo)致幼苗呈黃化轉(zhuǎn)黃綠表型;而在高溫(32 ℃)條件下,其表型及各項指標(biāo)又恢復(fù)到與野生型基本一致的水平.由此推斷,TCM11基因參與光合色素合成/葉綠體發(fā)育不僅與溫度有關(guān),而且與幼苗的葉齡有一定的關(guān)系,與已報道突變體cde2[5]和tcd9[15]等相類似.同時,本實驗在基因定位過程中,采用3504個單株的F2分離群體,tcm11突變基因仍定位在分子標(biāo)記ID13252與MM1361之間1 566 kb的一個較大區(qū)域,從兩分子標(biāo)記的位置來看,該基因位于著絲粒附近.著絲粒附近的交換率通常較低,增加了目的基因圖位克隆的難度[20].今后,將在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大定位群體,發(fā)展更多新的分子標(biāo)記,以及找到解決著絲粒附近交換率低的方法,進(jìn)一步對該基因進(jìn)行克隆和功能分析,這也將有助于加深溫度對水稻葉綠體發(fā)育分子作用機(jī)理的了解.

[1] 易俊良,陳立云.水稻超高產(chǎn)育種研究進(jìn)展 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(1):20-23.

Yi J L,Chen L Y.Advances of super high yield rice in breeding [J].Hu′nan Agricultural Sciences,2006(1):20-23.

[2] 周峰,張邊江,周泉澄,等.與植物生理學(xué)有關(guān)的重要研究進(jìn)展 [J].北方園藝,2010(9):212-214.

Zhou F,Zhang B J,Zhou Q C,et al.Important research advances in plant physiology [J].Northern Horticulture,2010(9):212-214.

[3] Mullet J E.Dynamic regulation of chloroplast transcription [J].Plant Physiology,1993,103(2):309-313.

[4] Kusumi K,Komori H,Satoh H,et al.Characterization of a zebra mutant of rice with increased susceptibility to light stress [J].Plant & Cell Physiology,2000,41(2):158-164.

[5] 魏祥進(jìn),宋建,劉勝,等.水稻苗期低溫白葉突變體cde2的鑒定和基因定位 [J].中國水稻科學(xué),2014,28(2):111-118.

Wei X J,Song J,Liu S,et al.Identification and genetic mapping of a thermo-sensitive white leaf mutant in rice [J].Chinese Journal of Rice Science,2014,28(2):111-118.

[6] 陳佳穎,趙劍,劉曉,等.一個新水稻溫敏感葉色突變體的遺傳分析及其基因分子定 [J].植物學(xué)報,2010,45(4):419-425.

Chen J Y,Zhao J,Liu X,et al.Genetic analysis and molecular mapping of a new thermosensitive leaf-color mutant inOryzasativa[J].Bulletin of Botany,2010,45(4):419-425.

[7] 董彥君,董文其,張小明,等.突變體Fan5苗色低溫敏感性狀的遺傳分析 [J].中國水稻科學(xué),1995,9(4):249-250.

Dong Y J,Dong W Q,Zhang X M,et al.Genetic analysis of low-temperature-sensitive seedling-colour character in the mutantFan5 [J].Chinese Journal of Rice Science,1995,9(4):249-250.

[8] Dong Y,Dong W,Shi S,et al.Identification and genetic analysis of a thermosensitive seedling-colour mutant in rice (OryzasativaL.) [J].Breeding Science,2001,51(1):1-4.

[9] 江少華,周華,林冬枝,等.水稻幼苗葉色溫敏感突變體的鑒定及其基因定位 [J].中國水稻科學(xué),2013,27(4):359-364.

Jiang S H,Zhou H,Lin D Z,et al.Identification and gene mapping of a thermo-sensitive leaf-color mutant at seedling stage in rice [J].Chinese Journal of Rice Science,2013,27(4):359-364.

[10] 董彥君,林冬枝,梅杰,等.一個水稻溫度敏感失綠突變體的遺傳分析及分子定位 [J].分子植物育種,2013(1):1-7.

Dong Y J,Lin D Z,Mei J,et al.Genetic analysis and molecular mapping of a thermo-sensitive chlorosis mutant in rice [J].Molecular Plant Breeding,2013(1):1-7.

[11] 李超,林冬枝,董彥君,等.一個水稻苗期溫敏感白色條斑葉突變體的遺傳分析及基因定位 [J].中國水稻科學(xué),2010,24(3):223-227.

Li C,Lin D Z,Dong Y J,et al.Genetic analysis and mapping of a thermo-sensitive white stripe leaf mutant at the seedling stage in rice (Oryzasativa) [J].Chinese Journal of Rice Science,2010,24(3):223-227.

[12] Yu P,Yi Z,Lv J,et al.Characterization and fine mapping of a novel rice albino mutant low temperature albino 1 [J].Journal of Genetics & Genomics,2012,39(8):385-396.

[13] 何瑞鋒,丁毅,余金洪,等.水稻溫敏葉綠素突變體葉片超微結(jié)構(gòu)的研究 [J].植物科學(xué)學(xué)報,2001,19(1):1-5.

He R F,Ding Y,Yu J H,et al.Study on leaf ultrastructure of the thermo-sensitive chlorophy ll deficient mutant in rice [J].Plant Science Journal,2001,19(1):1-5.

[14] 錢前.水稻遺傳學(xué)和功能基因組學(xué) [M].北京:科學(xué)出版社,2006.

Qian Q.Rice genetics and functional genomics [M].Beijing:Science Press,2006.

[15] 劉艷霞,林冬枝,董彥君.水稻溫敏感葉色突變體研究進(jìn)展 [J].中國水稻科學(xué),2015,29(4):439-446.

Liu Y X,Lin D Z,Dong Y J.Research advances in thermo-sensitive leaf coloration mutants in rice [J].Chinese Journal of Rice Science,2015,29(4):439-446.

[16] 張憲政.植物葉綠素含量測定——丙酮乙醇混合液法 [J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1986(3):28-30.

Zhang X Z.Plant chlorophyll content determination:Acetone ethanol mixture method [J].Liaoning Agricultural Science,1986(3):28-30.

[17] Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J].Nucleic Acids Research,1980,8(19):4321-4325.

[18] 朱環(huán)環(huán),劉艷霞,潘倩文,等.一個水稻白化致死突變體abl25鑒定及其基因定位 [J].上海師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,43(3):238-244.

Zhu H H,Liu Y X,Pan Q W,et al.Identification and gene mapping of a novel rice albino lethalabl25 mutant [J].Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences),2014,43(3):238-244.

[19] Lander E S,Green P,Abrahamson J,et al.MAPMAKER:An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations [J].Genomics,1987,1(2):174-181.

[20] 王虎義.玉米胚乳突變體Su5遺傳分析和基因定位 [D].長春:吉林大學(xué),2012.

Wang H Y.The maize endosperm mutantSu5 genetic analysis and gene location [D].Changchun:Jilin University,2012.

(責(zé)任編輯：顧浩然)

Identification and gene mapping of a novel low temperature sensitive leafcolor mutanttcm11 in rice (OryzasativaL.)

Wang Wenjuan1, Wu Lanlan1, Lei Xiaoqing1, Zhao Huaiyu1, Lin Dongzhi1,2, Dong Yanjun1,2*

(1.College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China; 2.Development Center of Plant Gemlplasm,Resources,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

A stable geneticlow temperature sensitive leaf color mutanttcm11 (thermo-sensitive chloroplast mutant11) derived fromJaponicarice variety Jiahua No.1 treated by60Co γ-rays was used in this study,whichwasidentified the phenotypic characterization and genetic analysis.Underthe condition of 20 ℃,thetcm11 mutant was showed the etiolation phenotype before 3-leaf-stage,which were greatly reduced the photosynthetic pigment contents andbroken the chloroplast structure.However,it began to turn the yellow green phenotype after 4-leaf-stageuntil it died.But under the condition of 32 ℃,its phenotype was no significant difference compared with wild type(Jiahua No.1),with low temperature sensitive attributes.Using segregatingindividuals from cross of Pei′ai 64S andtcm11,genetic analysis revealed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.Through map-based cloning,the mutant gene (tcm11) was located to 1 566 kb region between the molecular markers ID13252 and MM1361 on rice chromosome 11,which also the follow-up research laid the foundation for in the future.

rice (Oryzasativa); temperature sensitive leaf color mutant; gene mapping

2016-06-29

國家自然科學(xué)基金(30971552);上海市自然科學(xué)基金(16ZR1425300);上海師范大學(xué)(SK20159)

王文娟(1989-),女,碩士研究生,主要從事基因定位方面的研究.E-mail:wjwang0120@163.com

導(dǎo)師簡介: 董彥君(1965-),男,博士,教授,主要從事遺傳學(xué)方面的研究.E-mail:dong@shnu.edu.cn

Q 344

A

1000-5137(2017)02-0319-07

*通信作者