宋宏偉，楊琛，劉偉，劉志

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng)110001）

白細(xì)胞介素17A在急性百草枯中毒小鼠腎損傷中的作用

宋宏偉，楊琛，劉偉，劉志

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng)110001）

目的探討白細(xì)胞介素17A（IL-17A）在急性百草枯中毒小鼠腎損傷中的作用及其機(jī)制。方法72只ICR小鼠隨機(jī)分為3組:生理鹽水組（NS組）、百草枯中毒（PQ）組和抗體組（PQ+Ab組），每組24只。PQ與PQ+Ab組均采用一次性灌胃PQ溶液建立PQ中毒模型，PQ+Ab組于染毒2 h后一次性腹腔注射IL-17A抗體，NS組分別給予等量生理鹽水。各組于染毒后8、24、48、72 h取6只小鼠處死，分別收集血清和腎組織樣本，ELISA法檢測(cè)血清IL-17A、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）水平，化學(xué)比色法檢測(cè)腎組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性，腎組織經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后觀察組織形態(tài)變化并評(píng)分，免疫組化法和實(shí)時(shí)定量PCR法分別檢測(cè)IL-17A蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果與NS組比較，PQ與PQ+Ab組小鼠血清中IL-17A水平升高，腎組織中MPO活性增加，血SCr、BUN升高（均P＜0.01）；與PQ組比較，PQ+Ab組小鼠血清中IL-17A顯著降低、腎組織中MPO活性降低、血SCr、BUN水平下降（均P＜0.01），腎病理?yè)p傷減輕。結(jié)論IL-17A可能通過(guò)活化、募集中性粒細(xì)胞促進(jìn)急性PQ中毒小鼠腎損傷，抗體阻斷IL-17A能減輕該損傷。

白細(xì)胞介素17A；百草枯；中毒；腎損傷；小鼠

百草枯（paraquat，PQ）是一種雜環(huán)類(lèi)除草劑，對(duì)人畜均有極強(qiáng)的毒性。有意或無(wú)意口服PQ溶液是中毒的主要途徑，一旦中毒能引起多器官損傷。腎臟是PQ中毒后受累較早的器官，PQ中毒早期死亡患者多并發(fā)腎損傷。白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）是一種細(xì)胞因子，有研究［1］證實(shí)，IL-17A參與炎癥性疾病導(dǎo)致的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），敲除IL-17A基因能保護(hù)膿毒癥導(dǎo)致的AKI［2］，本研究通過(guò)建立急性PQ中毒小鼠模型，腹腔注射IL-17A抗體阻斷IL-17A，探討IL-17A在急性PQ中毒腎損傷中的作用及其可能途徑。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

8周齡健康雌性ICR小鼠（SPF級(jí)，26～30 g）購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司［SCXK（遼）2015-0001］，建模實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，小鼠自由活動(dòng)、飲水、攝食，12 h光照/12 h黑暗處理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均符合倫理學(xué)。PQ溶液（濃度為25%，陜西加倫多有限公司），IL-17A、BUN、SCr ELISA試劑盒（北京博奧森有限公司），小鼠IL-17A中和性抗體（美國(guó)eBiosicence公司），IL-17A免疫組化試劑盒（英國(guó)Abcam公司），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），mRNA引物（上海生工生物工程股份有限公司），其他試劑均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 動(dòng)物分組與干預(yù)

72只小鼠隨機(jī)均分為3組：對(duì)照組（NS組）、中毒組（PQ組）、抗體組（PQ+Ab組），每組24只。NS組一次性灌胃等體積生理鹽水，PQ和PQ+Ab組一次性灌胃PQ溶液（25 mg/kg），PQ+Ab組每只小鼠灌胃PQ溶液2 h后一次性腹腔注射IL-17A中和性抗體（5 mg/kg）。各組小鼠分別于染毒后8、24、48、72 h各取6只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后處死。血液樣本經(jīng)2 000 r/min離心后留取上層清液，保存于-20℃冰箱，待檢；取左腎組織剪碎，加入適量生理鹽水制成10%的組織勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清液保存于-20℃冰箱，待檢；取部分右腎組織固定于10%中性甲醛溶液，4℃冰箱保存，剩余部分保存于-80℃冰箱，待做PCR。

1.3 血清IL-17A、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法檢測(cè)血清IL-17A、BUN、SCr水平，具體步驟按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）檢測(cè)

采用化學(xué)比色法檢測(cè)腎組織勻漿上清液中MPO活性，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在460 nm處讀取吸光度值，MPO活性計(jì)算公式：MPO活性（U/g）=（A測(cè)定管-A對(duì)照管）/（11.3×取樣量）。

1.5 腎組織病理學(xué)檢測(cè)

腎組織常規(guī)脫水、石蠟包埋，用于制備石蠟切片。5 μm切片，HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理變化，Paller法［3］評(píng)估腎小管損傷程度：每張腎組織切片隨機(jī)選擇3個(gè)無(wú)重疊視野（×200），每個(gè)視野下隨機(jī)選擇3處腎小管，共9個(gè)腎小管計(jì)分，結(jié)果取平均值，分?jǐn)?shù)越高表示腎小管損傷越嚴(yán)重。

1.6 免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)IL-17A表達(dá)

將固定好的腎組織經(jīng)脫水、石蠟包埋和組織切片等步驟制作成5 μm的切片。IHC操作步驟嚴(yán)格按照IL-17A免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。IHC切片在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)腎組織IL-17A mRNA表達(dá)

腎組織勻漿，Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：37℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，85℃預(yù)變性2 min，85℃變性30 s，40℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)目的基因IL-17A與內(nèi)參基因GAPDH比較測(cè)定IL-17AmRNA表達(dá)量。同時(shí)繪制溶解曲線(xiàn)，以保證PCR的效果。IL-17A與GAPDH序列由PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)查得，委托上海生工生物工程有限公司合成引物：IL-17A（344 bp），上游5’-TGTCAATGCGGAGGGAAAG-3’，下游5’-GCAGTTTGGGACCCCTTTAC-3’；GAPDH（183 bp），上游5’-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’，下游5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3’。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Games-Howell法檢驗(yàn)，雙變量分析采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

NS組小鼠未見(jiàn)明顯異常。中毒小鼠可見(jiàn)躁動(dòng)不安、倦怠、活動(dòng)減少、行動(dòng)遲緩、呼吸急促、口唇分泌物增多等表現(xiàn)。與PQ組相比，PQ+Ab組小鼠呼吸急促、口唇分泌物等表現(xiàn)較輕。

2.2 腎組織形態(tài)學(xué)觀察及病理?yè)p傷評(píng)分

PQ組小鼠腎臟明顯腫脹、變大，PQ+Ab組小鼠腎組織腫脹、變大程度較PQ組小鼠稍顯輕微，見(jiàn)圖1。腎組織HE染色鏡下觀察NS組小鼠每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯病理改變；PQ與PQ+Ab組可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫并逐漸加重，管腔逐漸狹窄甚至閉塞，部分腎小球逐漸增大至結(jié)構(gòu)紊亂、間質(zhì)充血、水腫，并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；72 h時(shí)可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕、管腔開(kāi)放、間質(zhì)充血水腫減輕、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見(jiàn)圖2。腎組織病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果顯示，與NS組比較，PQ與PQ+Ab組明顯升高，48 h時(shí)最高（均P＜0.01）；與PQ組比較，PQ+Ab組病理?yè)p傷評(píng)分較低（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.3 各組小鼠血清IL-17A水平比較

NS組小鼠血清IL-17A各時(shí)間無(wú)明顯變化。與NS組比較，PQ與PQ+Ab組血清中IL-17A明顯升高，并在觀察時(shí)間內(nèi)持續(xù)升高（均P＜0.001）；與PQ組比較，PQ+Ab組各時(shí)間點(diǎn)血清IL-17A水平均下降（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 小鼠腎臟大體觀察Fig.1General observation of mouse kidneys

圖2 各組小鼠腎組織病理學(xué)所見(jiàn)Fig.2Histopathology of kidney tissue

表1 各組小鼠腎組織病理評(píng)分及血清IL-17A水平Tab.1Kidney tissue pathological score and serum IL-17A in mic

表1 各組小鼠腎組織病理評(píng)分及血清IL-17A水平Tab.1Kidney tissue pathological score and serum IL-17A in mic

1）P＜0.01 vs NS group；2）P＜0.01 vs PQ group；3）P＜0.001 vs NS group；4）P＜0.05 vs PQ group.

?

2.4 腎組織病理評(píng)分與腎血清中IL-17A的關(guān)系

結(jié)果顯示，腎病理?yè)p傷程度與腎血清中IL-17A含量成正相關(guān)（r=0.671，P＜0.001）。

2.5 各組小鼠血清BUN、SCr水平比較

NS組小鼠血清BUN、SCr各時(shí)間無(wú)明顯變化。與NS組比較，PQ與PQ+Ab組血清BUN、SCr水平明顯升高，均在48 h時(shí)達(dá)高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與PQ組比較，PQ+Ab組小鼠血清BUN、SCr降低（均P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.6 各組小鼠腎組織MPO活性比較

表2 各組小鼠血清BUN、SCr水平Tab.2Levels of BUN and SCr of mice

表2 各組小鼠血清BUN、SCr水平Tab.2Levels of BUN and SCr of mice

1）P＜0.01 vs NS group；2）P＜0.01 vs PQ group.

?

NS組小鼠腎組織MPO活性各時(shí)間無(wú)明顯變化；與NS組比較，PQ和PQ+Ab組小鼠腎組織MPO活性迅速升高（均P＜0.01）；與PQ組比較，PQ+Ab組MPO腎組織活性降低（均P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 小鼠腎組織MPO活性及IL-17A mRNA的表達(dá)Tab.3Activity of MPO and IL-17A mRNA expression in mouse kidneys

2.7免疫組化檢測(cè)各組小鼠IL-17A表達(dá)比較

IL-17A主要存在于細(xì)胞胞質(zhì)中，NS組的腎組織中未見(jiàn)表達(dá)IL-17A的細(xì)胞；PQ與PQ+Ab組小鼠腎組織中偶見(jiàn)表達(dá)IL-17A的細(xì)胞散在于腎小球和腎小管中，呈棕色；與NS組比較，3組間細(xì)胞表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。腎間質(zhì)中可見(jiàn)IL-17A存在，見(jiàn)圖3。

2.8 各組小鼠腎組織IL-17AmRNA表達(dá)比較

圖3 免疫組化檢測(cè)各組小鼠腎組織IL-17A表達(dá)DAB×200Fig.3Expression of IL-17A in mouse kidney tissue，assayed using IHC DAB×200

NS組小鼠腎組織中IL-17AmRNA極少量表達(dá)，與NS組比較，PQ組和PQ+Ab組小鼠腎組織IL-17A mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與PQ組比較，PQ+Ab組降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

腎臟是人體主要的排泄器官，進(jìn)入人體內(nèi)的PQ主要經(jīng)腎臟排泄，因此腎也是PQ中毒損傷的主要靶器官。本研究顯示，PQ中毒后，小鼠血漿BUN、SCr的水平迅速顯著升高。有研究［5］表明，PQ能引起以腎小管和間質(zhì)損傷為主的AKI表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)觀察到PQ中毒小鼠出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫、管腔逐漸狹窄甚至閉塞，部分腎小球增大、結(jié)構(gòu)紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等腎損傷的病理改變；IL-17A抗體阻斷后，上述病理改變減輕。

有關(guān)PQ中毒腎損傷的機(jī)制目前認(rèn)為，一方面PQ在腎組織誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞釋放出炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子加重腎組織病理?yè)p傷［6-7］；另一方面，PQ中毒后，血清中升高的炎癥介質(zhì)也可參與腎損傷［8］，同時(shí)腎組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)也升高［9］。IL-17A是一種促炎細(xì)胞因子，主要由輔助性17細(xì)胞（T helper 17 cell，Th17）分泌，少量由巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌［10］，可參與炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病等，并在其中發(fā)揮重要作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，PQ中毒后，血清中IL-17A水平顯著升高；抗體阻斷IL-17A后，伴隨著血清中IL-17A含量降低，血清BUN、SCr濃度下降，腎組織病理?yè)p傷程度減輕。通過(guò)分析血清IL-17A的濃度與腎病理評(píng)分的關(guān)系發(fā)現(xiàn)血清中IL-17A含量越高，腎病理?yè)p傷越重。本研究結(jié)果表明，IL-17A促進(jìn)急性PQ中毒后小鼠AKI。此外，通過(guò)IHC和PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，PQ中毒后腎損傷的過(guò)程中，IL-17A在腎組織中極少表達(dá)，據(jù)此推測(cè)急性PQ中毒腎組織中參與腎損傷的IL-17A主要來(lái)自于外周循環(huán)。

既往研究［12］表明，IL-17A主要通過(guò)募集、活化中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞放大局部炎癥反應(yīng)加重組織損傷。MPO是由活化的中性粒細(xì)胞分泌的標(biāo)志酶，具有殺滅病原體、損傷組織的作用［13］。MPO的活性可以反應(yīng)局部組織中中性粒細(xì)胞的活化和聚集程度，其活性越高，則活化的中性粒細(xì)胞聚集越多，對(duì)組織的損傷也就越嚴(yán)重［14］。研究［15］證實(shí)，PQ中毒后，血中白細(xì)胞升高，中性粒細(xì)胞百分比增多。本實(shí)驗(yàn)PQ中毒后，小鼠腎組織中MPO活性顯著升高，而阻斷IL-17A后，腎組織中MPO活性降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PQ中毒腎損傷的發(fā)生有中性粒細(xì)胞的參與，同時(shí)也說(shuō)明，IL-17A可以通過(guò)活化、募集中性粒細(xì)胞參與PQ中毒后腎損傷。

本研究表明，小鼠PQ中毒后，IL-17A從外周血循環(huán)進(jìn)入腎組織，并通過(guò)活化、募集中性粒細(xì)胞促進(jìn)腎損傷，抗體阻斷IL-17A能顯著減輕PQ中毒小鼠的腎損傷，為抗體治療急性PQ中毒提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（編輯 武玉欣）

Effects of Interleukin-17A on Acute Paraquat-intoxication-induced Kidney Injury in Mice

SONG Hongwei，YANG Chen，LIU Wei，LIU Zhi
（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effects of interleukin-17A on kidney injury induced by paraquat（PQ）.MethodsSeventy-two ICR mice were randomly divided into 3 groups:NS，PQ，and PQ+Ab（n=24 for each）.The PQ-poisoning model was established by administering a gavage of PQ solution；mice in the PQ+Ab group were then administereda dose of anti-IL-17A antibody 2 hours later by i.p.injection，whereas the NS group were administered a corresponding volume of normal saline instead.The mice were killed at 8，24，48，or 72 h to obtain renal tissues and serum.An enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to determine serum IL-17A，serum creatinine（SCr），and blood urea nitrogen（BUN）levels.Chemical colorimetry was used to detect the viability of myeloperoxidase（MPO）in renal tissue，and hematoxylin-eosin（HE）staining was used to observe the renal pathologic changes.Immunohistochemistry（IHC）and PCR were used to examine IL-17A expression in renal tissues.ResultsSerum IL-17A，renal tissue MPO viabilities，BUN，and SCr were increased in the PQ and PQ+Ab groups，compared to those in the NS group（P＜0.01）.However，the above-mentioned parameters were lower in the PQ+Ab group than in the PQ group（P＜0.01）.ConclusionIL-17A promotes mouse kidney injury induced by acute PQ-intoxication through activating and/or recruiting neutrophils；therefore，blockade IL-17A，with antibody can attenuate the injury.

interleukin-17A；paraquat；intoxication；kidney injury；mice

R594.4

A

0258-4646（2017）05-0392-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81571882）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2013225303）

宋宏偉（1989-），男，碩士研究生.

劉志，E-mail：Liuzhicmu@163.com

2016-10-13

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