田曉明 顏立紅 向光鋒 蔣利媛

（湖南省森林植物園，長沙 410116）

植物4香豆酸：輔酶A連接酶研究進(jìn)展

田曉明 顏立紅 向光鋒 蔣利媛

（湖南省森林植物園，長沙 410116）

4香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase EC6.2.1.12，4CL）是木質(zhì)素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化肉桂酸及其衍生物生成相應(yīng)的硫酯。同時(shí)也是苯丙烷類代謝途徑中的第三個(gè)步驟，連接木質(zhì)素前體和各個(gè)分支途徑的紐帶，在木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。近年來利用基因工程手段調(diào)控木質(zhì)素生物合成，降低木質(zhì)素含量，減少制漿造紙過程中的污染已成為研究熱點(diǎn)。結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于4CL的研究成果，對(duì)植物4CL基因家族、酶學(xué)性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)以及4CL在調(diào)控木質(zhì)素生物合成中的作用等方面進(jìn)行綜述，并對(duì)4CL的研究方向提出展望，旨為對(duì)該基因的研究提供參考。

4CL；木質(zhì)素；酶學(xué)；晶體學(xué)；基因調(diào)控

木質(zhì)素是植物體中僅次于纖維素的一種重要大分子有機(jī)物質(zhì)，其總量占生物圈中有機(jī)碳含量的30%，占木本植物細(xì)胞壁干重的16%-35%［1］。陸生植物的木質(zhì)素合成是其適應(yīng)陸地生態(tài)環(huán)境的重要進(jìn)化特征之一。細(xì)胞內(nèi)合成的木質(zhì)素單體滲入到一些特化的細(xì)胞壁中（如木質(zhì)部的導(dǎo)管、厚壁組織和韌皮部纖維等）形成木質(zhì)素的聚合體，對(duì)植物體維持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、疏導(dǎo)水分和養(yǎng)料、防御病原菌侵害等方面有重要作用。由此可見，木質(zhì)素在植物的生長發(fā)育和抗性方面具有重要的生物學(xué)功能［2，3］。

普遍認(rèn)為，4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzymeA ligase，4CL）作用于苯丙烷類代謝途徑的第3個(gè)步驟，是聯(lián)系木質(zhì)素前體和各個(gè)分支途徑的紐帶，在木質(zhì)素單體合成過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［4，5］。4CL催化肉桂酸及其羥基或甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙烷類衍生物支路合成途徑［6］。其中以p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸為底物生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA、芥子酰CoA，被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為肉桂醇衍生物，最終通過脫氫還原反應(yīng)生成木質(zhì)素單體［7］。由于木質(zhì)素重要的生物學(xué)功能及生產(chǎn)價(jià)值，近年來對(duì)4CL酶基因的研究成為熱點(diǎn)。本文對(duì)植物4CL基因家族、4CL蛋白酶學(xué)、4CL蛋白晶體學(xué)、4CL調(diào)控木質(zhì)素生物合成等方面進(jìn)展展開綜述如下，旨為今后對(duì)該基因的研究提供參考。

1 植物4CL基因家族

近30年來，植物4CL基因序列被相繼克隆出來。 我 們 從NCBI（national centerfor biotechnology information）了解到，4CL基因的DNA或cDNA序列已從歐芹（Petroselinum crispum）［8］、水稻（Oryza. sativa）［9］、 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）［1］、 煙草（Nicotiana tabacum）［10］、 和 毛 白 楊（populus tomentosa carr）［11］等約40多種［12-21］植物中克隆出來（表1）。黃勝雄［22］等對(duì)已有的4CL序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)植物4CL基因主要聚為2 類：第1 類包括擬南芥、大豆、煙草、楊樹等大部分雙子葉植物的4CL基因；第2 類包括水稻、玉米、黑麥草這幾種單子葉植物和裸子植物的4CL基因。這表明在4CL 基因與植物的進(jìn)化過程密切相關(guān)。同時(shí)，也表明單子葉植物和雙子葉植物分化之前，4CL 基因在植物中已經(jīng)存在，而且4CL 基因在植物中的進(jìn)化時(shí)間早于單子葉和雙子葉植物的分化時(shí)間。

隨著植物中分離鑒定到越來越多的4CL基因，研究人員發(fā)現(xiàn)4CL具有被多基因所編碼的特點(diǎn)，表明4CL基因在植物的進(jìn)化過程中，隨著植物基因組的倍增產(chǎn)生了基因的多個(gè)拷貝，形成了同源的家族基因。目前已知，擬南芥［23，24］、大豆（Glycine max）［25］、覆盆子（Rubus idaeus L.）［26］、香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans）［16］、 美 洲 山 楊（Populus tremuloides）［7］中存在2-4個(gè)4CL家族成員，這些4CL家族基因的出現(xiàn)，與植物進(jìn)化過程中一些新功能的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系，因此各個(gè)家族成員在基因結(jié)構(gòu)和功能上的相似度不盡相同。

盡管目前已從許多植物中分離鑒定了4CL基因，4CL基因家族的大小依然未知，甚至在擬南芥、楊樹等模式植物中，雖然已知全部基因組序列，4CL基因家族的真正范圍仍然未知［27］。造成這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)?CL基因具有特異性的表達(dá)模式，在特定的時(shí)空低豐度表達(dá)某些家族成員，從而阻礙了基因家族的鑒定［28-30］。相信隨著功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)的不斷深入，研究人員將逐漸確定不同植物基因組中4CL基因的數(shù)目。

2 4CL酶學(xué)特性

在木質(zhì)素生物合成過程中，4CL基因?qū)αu基肉桂酸衍生物的偏好性及其表達(dá)模式有很大差異。例如，擬南芥中At4CLl和At4CL2編碼的同工酶與木質(zhì)素單體合成密切相關(guān)［31］。而At4CL3主要在花中表達(dá)，激活p-香豆酸作為查耳酮合成酶的底物，參與類黃酮的生物合成；At4CL4在只在特定條件下低水平表達(dá)［32］，其發(fā)育和脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)模式機(jī)理至今未知。大豆［33］中Gm4CL1和Gm4CL2參與植物生長和發(fā)育（包括木質(zhì)化過程）。毛白楊［34］中，Ptc4CL1參與木質(zhì)部的木質(zhì)素生物合成，而Ptc4CL2參與表皮細(xì)胞中酚類化合物（如類黃酮）的生物合成。以上結(jié)果表明，同一物種的4CL基因的不同成員mRNA的表達(dá)表現(xiàn)出器官、組織的特異性，這可能與不同成員參與不同的分支途徑有關(guān)。

植物4CL對(duì)芥子酸沒有活性是一個(gè)普遍現(xiàn)象。例如，毛白楊4CL1［35］對(duì)p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸有很高的親和力，它們的Km值在40-60 mol/L之間，而對(duì)肉桂酸的親和力較低，對(duì)芥子酸幾乎無活性；擬南芥中At4CL2的最適底物為咖啡酸，對(duì)肉桂酸的轉(zhuǎn)化能力也很低，對(duì)阿魏酸和芥子酸沒有活性。大豆中GmCL2、GmCL3 和GmCL4均不能催化芥子酸，而At4CL4和Gm4CLl能特異的催化芥子酸。對(duì)已有的4CL氨基酸序列比對(duì)分析表明，在所有已知的4CL氨基酸序列中存在保守的肽基序（motif）：AMP結(jié)合功能域（Motif I）和Box II（Motif II）。Motif I作為底物結(jié)合區(qū)域（SBP）參與了底物的識(shí)別。SBP的空間大小決定了4CL能否與羥基肉桂酸衍生物結(jié)合。Motif II直接參與催化反應(yīng)，同時(shí)與穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性和空間構(gòu)象有關(guān)［36］。用blast 比對(duì)不具有芥子酸催化活性的4CL基因序列與At4CL4和Gm4CLl（圖1）發(fā)現(xiàn)，SBP中的氨基酸338Val在At4CL4和Gm4CLl中特異性缺失［37］。這個(gè)研究結(jié)果有助于人們更好地理解苯丙烷類代謝途徑中關(guān)鍵酶的催化行為，并設(shè)汁具有新的底物特異性的4CL蛋白。但是，并未從根本上揭示4CL同工酶底物特異性的分子機(jī)制。要闡明4CL蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，最佳的方法就是獲得4CL蛋白的晶體，采集晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，解析4CL蛋白的原子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。

表1 4CL的基因和cDNA序列

圖1 不同植物中4CL部分序列比對(duì)圖［38］

3 4CL蛋白晶體學(xué)研究

早在20世紀(jì)70年代初，4CL蛋白的研究就已經(jīng)開始進(jìn)行，但是4CL蛋白的三維結(jié)構(gòu)解析進(jìn)展緩慢，其蛋白結(jié)晶體的獲得成為當(dāng)前4CL研究中的一個(gè)難點(diǎn)。2010年，胡永林等［38］獲得了高質(zhì)量的毛白楊4CL1蛋白質(zhì)結(jié)晶體，并解析出毛白楊4CL1晶體結(jié)構(gòu)（圖2-A）。毛白楊4CL1基因包含536個(gè)氨基酸殘基，4CL1蛋白由兩個(gè)有機(jī)結(jié)合的球狀結(jié)構(gòu)域組成。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別為N-domain和C-domain。其中N-domain較大，由434個(gè)氨基酸殘基組成，是底物容納口袋。N-domain又可以分成3個(gè)子結(jié)構(gòu)，這3個(gè)子結(jié)構(gòu)分別為N1、N2和N3。C-domain較小，由第435-536位的氨基酸殘基組成，包含了催化位點(diǎn)。根據(jù)對(duì)4CL-APP復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)研究分析（圖2-B）發(fā)現(xiàn)，C-domain相對(duì)于N-domain旋轉(zhuǎn)了818度，N-domain中每355到391個(gè)原子的長度為1.9-2.2?，而C-domain的每71-103個(gè)原子的長度為0.9-1.7?。4CL具有催化活性的氨基酸殘基為Lys-438、Gln-443和 Lys-523，底物識(shí)別活性的殘基為Tyr-236、Gly-306、Gly-331、Pro-337和Val-338。底物識(shí)別口袋的大小決定了4CL的底物特異性。

毛白楊4CL1母體蛋白晶體和衍射單晶的獲得，使得從分子水平上闡明其催化反應(yīng)和底物偏好選擇機(jī)理提供了可能，并為4CL蛋白參與的生物代謝途徑的改造提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為植物中木質(zhì)素生物合成和黃酮類的生物合成機(jī)制提供了直接的理論依據(jù)，在苯丙烷類化合物的生物合成中具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

4 4CL基因的表達(dá)與調(diào)控

植物次生代謝途徑中絕大多數(shù)基因?qū)儆谡{(diào)控基因，4CL基因也不例外，其在植物不同組織中的差異表達(dá)主要受發(fā)育和環(huán)境因子的雙重調(diào)控。4CL受發(fā)育調(diào)控的研究例證很多，如Lee等［39-41］發(fā)現(xiàn)擬南芥4CL基因在苗期階段即被活化，其活性與子葉和根部木質(zhì)素形成有密切相關(guān)。趙艷玲等［42，43］發(fā)現(xiàn)，毛白楊4CL的表達(dá)水平與早材和晚材的形成階段相符合，在一個(gè)生長季節(jié)中呈現(xiàn)“雙峰”模式。Reinold等［44］通過原位雜交研究煙草花發(fā)育過程中4CL的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明在花發(fā)育的不同階段，轉(zhuǎn)基因煙草的心皮、花藥、花瓣及萼片中4CL的表達(dá)量存在差異。

植物4CL基因在不同發(fā)育階段表達(dá)受到啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。研究人員最早從歐芹中克隆到4CL啟動(dòng)子，全長1 530 bp，在木質(zhì)部特性定位表達(dá)［45］。丹參［11］4CL啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS在幼嫩擬南芥子葉的頂端和下胚軸，以及生長40 d的擬南芥葉片的邊緣、萼片、花藥中表達(dá)。潘翔等［34］分離克隆了毛白楊中4個(gè)4CL基因家族成員的啟動(dòng)子，并在轉(zhuǎn)基因煙草中分析4個(gè)啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)模式。研究表明，4個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)部位和表達(dá)模式有差異，其中Pto4CL4p和Pto4CL5p調(diào)控的表達(dá)模式比較接近，Pto4CL3p驅(qū)動(dòng)的組織特異性表達(dá)同時(shí)具有發(fā)育階段特異性。

除發(fā)育調(diào)控外，4CL基因在植物中也被傷害、病原體感染、紫外線輻射等外界刺激所激活而表達(dá)。目前已證實(shí)茉莉酸處理、傷害脅迫處理歐芹的成熟葉片，4CL mRNA均瞬間高豐度增加［46］。Uhlmann等［33］用晚疫病菌（Phytophthora infestans）感染馬鈴薯葉片，4CL轉(zhuǎn)錄活性2 h后達(dá)到最大值，接種12 h后，4CL酶活性增加2倍。Ehlting等［23］用植物霜霉病的致病寄生真菌（Peronos poraparasitica）的孢子感染擬南芥子葉，發(fā)現(xiàn)該致病因素強(qiáng)烈誘導(dǎo)At4CL1和At4CL2 mRNA的表達(dá)，而At4CL3 mRNA則不被誘導(dǎo)；紫外線照射擬南芥6 h后，At4CLl和At4CL2轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到最高；含致病基因avrB的十字花科（Cruciferae）黑斑病假單胞菌（Pseudomonas syringae pv. maculicola）侵染擬南芥6 h后，4CL均被激活表達(dá)，并產(chǎn)生不協(xié)調(diào)的交互作用。At4CL基因不同程度的脅迫反應(yīng)也說明植物體內(nèi)4CL 家族各成員可能參與了不同的生物代謝途徑。

隨著分子生物學(xué)尤其是基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，更多不同來源的苯丙烷類代謝途徑基因被分離和鑒定，通過與已知的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn) 4CL、PAL 和C4H 基因的啟動(dòng)子區(qū)域都有保守的“AC”順式作用元件，包括boxP、boxA、boxL。他們是決定以上3個(gè)基因在誘導(dǎo)因子、紫外線和傷害等脅迫條件下特異性表達(dá)的關(guān)鍵元件［47］。Logemann等［48］發(fā)現(xiàn)，含有紫外線的白光、真菌誘導(dǎo)子和機(jī)械傷害能誘導(dǎo)歐芹 PAL、C4H和4CL 基因mRNA同時(shí)瞬時(shí)表達(dá)。誘導(dǎo)子處理燕麥葉片后，PAL、C4H和4CL 酶活性同時(shí)達(dá)到最高水平。以上研究結(jié)果表明，PAL、C4H 和4CL 基因的表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄水平上的協(xié)同調(diào)控性。由于PAL、4CL和C4H是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵基因，對(duì)木質(zhì)素生物合成具有重要調(diào)控作用。因此，以上研究成果，有利于研究者探究苯丙烷類代謝途徑和木質(zhì)素生物合成途徑中各個(gè)酶系之間的相互作用，也為實(shí)現(xiàn)多基因的協(xié)同表達(dá)調(diào)控提供了更多的信息。

5 4CL基因在基因工程中的應(yīng)用

把木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因定位為靶基因，構(gòu)建該基因的反義、正義或干涉結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，利用獲得的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行基因表達(dá)和調(diào)控研究，是對(duì)木質(zhì)素合成途徑進(jìn)行系統(tǒng)研究的有力手段之一。4CL處于苯丙烷類代謝途徑形成不同類型產(chǎn)物的轉(zhuǎn)折點(diǎn)上，催化各種羥基肉桂酸生成相應(yīng)的硫酯，這些硫酯同時(shí)也是苯丙烷類代謝途徑和各種末端產(chǎn)物生成途徑的分支點(diǎn)。因此，通過基因工程手段上下調(diào)節(jié)4CL酶活性，是對(duì)其進(jìn)行功能分析的重要途徑。目前已獲得大量4CL轉(zhuǎn)基因植株，這些轉(zhuǎn)基因植株在4CL表達(dá)、木質(zhì)素含量、組成和植株發(fā)育等方面存在很大差異［27］。

Lee［41］采用反義手段分別抑制擬南芥和煙草中的4CL活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素總量明顯下降，G型木質(zhì)素降低，S型木質(zhì)素不發(fā)生變化，從而導(dǎo)致S/G比值升高，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育沒有受到影響，導(dǎo)管也未發(fā)生形變。Xu等［49］通過RNA干涉方式抑制柳枝稷（Panicum virgatum）中4CL的表達(dá)，研究結(jié)果中，轉(zhuǎn)基因柳枝稷4CL酶活性降低80%，木質(zhì)素總量、G型木質(zhì)素含量都顯著降低，而轉(zhuǎn)基因植株的生物量，纖維水解能力顯著提高，同時(shí)導(dǎo)管形態(tài)未發(fā)生變化。Hu等［7］利用反義RNA技術(shù)抑制山楊（Populus davidiana Dode）4CL1基因表達(dá)，4CL1活性下降90%以上的轉(zhuǎn)基因株系中木質(zhì)素含量下降達(dá)45%，且根、莖、葉生長勢增強(qiáng)，纖維素含量明顯增加，轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素與纖維素的含量存在互補(bǔ)調(diào)控作用。Voelker等［50］運(yùn)用反義RNA技術(shù)抑制雜交楊（Poplus tremula×populusalba）中4CL1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素的總量與4CL1 mRNA的表達(dá)量呈明顯正相關(guān)關(guān)系，4CL mRNA表達(dá)量降低50%，導(dǎo)致木質(zhì)素含量下降超過10%，木材S/G比值也降低，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)矮灌化，導(dǎo)管出現(xiàn)塌陷形變，但是木質(zhì)素的降低并沒有引起糖化作用的提高。Wagner等［51］采用RNA干涉手段抑制油松（Pinus tabulaeformis）4CL的活性，轉(zhuǎn)基因油松的木質(zhì)素總量降低28%，G型木質(zhì)素降低，H型木質(zhì)素提高，H/G比對(duì)照高4倍，同時(shí)木材細(xì)胞壁中多糖含量明顯增加，雖然轉(zhuǎn)基因植株表型未發(fā)生變化，但是管胞的木質(zhì)化程度極大地降低，僅僅只有S1層中的管胞的木質(zhì)化程度正常。

我國科研工作者對(duì)4CL基因調(diào)控木質(zhì)素的生物合成也進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。李金花［27］以毛果楊×美洲黑楊雜種H11為材料，獲得了楊樹Ptd4CL3的全長cDNA序列，并通過Northem雜交證實(shí)，Ptd4CL3在木質(zhì)部中表達(dá)量最高，將Ptd4CL3正義、反義基因分別導(dǎo)入白楊派雜種無性系717中，獲得轉(zhuǎn)基因楊樹，結(jié)果表明，正義和反義4CL基因調(diào)控均引起轉(zhuǎn)基因楊樹4CL酶活性和木質(zhì)素總量的降低，并且反義調(diào)控比正義調(diào)控對(duì)基因表達(dá)的抑制作用更明顯，且所有轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)和生長發(fā)育未見異常。李楨［52］通過反義抑制4CL基因表達(dá)獲得了轉(zhuǎn)基因毛白楊，顯微切片觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中存在極少數(shù)輕度形變或發(fā)育不良的導(dǎo)管，但轉(zhuǎn)基因楊生長狀態(tài)良好。賈彩虹［53，54］發(fā)現(xiàn)反義抑制的4CL轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素含量平均下降10.3%，且開花期存在花瓣開裂現(xiàn)象。陸海等［55］將組成型啟動(dòng)子CaMV 35S及形成層定位啟動(dòng)子GRPl.8分別和反義毛白楊4CLI基因融合，并分別導(dǎo)入煙草中，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草纖維素和木質(zhì)素含量的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)CaMV35S啟動(dòng)的反義4CL1轉(zhuǎn)基因煙草纖維素含量比對(duì)照提高了11.4%，而木質(zhì)素含量降低了19.1%；GRP1.8啟動(dòng)的反義4CLl轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素含量較對(duì)照平均下降了13.7%，而纖維素含量升高了15.6%。趙艷玲等［43］將GRP1.8啟動(dòng)子和CaMV35S啟動(dòng)子分別與反義毛白楊4CL1基因結(jié)合，并分別導(dǎo)人741毛白楊中，獲得轉(zhuǎn)基因741毛白楊，分析發(fā)現(xiàn)，GRP1.8啟動(dòng)的反義 4CL1酶活性在莖和根中的降低量高于葉片；另外還發(fā)現(xiàn)，由CaMV35S啟動(dòng)的4CL1 RNA干涉轉(zhuǎn)基因毛白楊，4CL基因的表達(dá)量、酶活性、木質(zhì)素含量都顯著降低，并且，RNA干擾技術(shù)阻礙基因表達(dá)能力要優(yōu)于反義RNA技術(shù)，這可能是由于4CL基因有許多同源的基因家族成員，RNA干涉更有效的降低了同源基因的表達(dá)。目前為止，溫室中的轉(zhuǎn)基因幼齡楊的生理特性已經(jīng)得到了詳細(xì)研究，而野外生長的轉(zhuǎn)基因楊的生理生化特性沒有足夠認(rèn)識(shí)，而且調(diào)控木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)基因植物也缺乏整個(gè)生長季的觀察和檢測分析，植物在野外生長過程中會(huì)遇到許多在溫室中不存在的因素的影響（如風(fēng)、雨和霜等），因此考察在溫室中培育的植物在野外繼續(xù)生長過程中能否保持其特征是一項(xiàng)很基礎(chǔ)的研究。田曉明等［56］對(duì)1年生和5年生轉(zhuǎn)基因楊樹分別從生理生化、基因表達(dá)、細(xì)胞壁組成、細(xì)胞壁解剖結(jié)構(gòu)和木材品質(zhì)等角度進(jìn)行研究。結(jié)果表明，調(diào)控4CL的基因表達(dá)，將對(duì)木質(zhì)素單體合成途徑相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生協(xié)同調(diào)控作用，最終也對(duì)木質(zhì)素單體組成產(chǎn)生影響。

6 展望

4-香豆酰-CoA 連接酶（4CL）是苯丙烷類代謝途徑下游分支途徑上處于終端位置的酶，是連接苯丙烷代謝途徑與木質(zhì)素生物途徑的關(guān)鍵酶，在木質(zhì)素單體合成中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。但生物某個(gè)性狀通常是由多個(gè)基因共同控制，在林業(yè)生產(chǎn)上，由于單個(gè)轉(zhuǎn)基因的信號(hào)強(qiáng)度較弱，很難獲得理想實(shí)驗(yàn)的植株，多基因共同轉(zhuǎn)化將有待解決這一難題。隨著分子生物學(xué)尤其是“基因組計(jì)劃”的發(fā)展，擬南芥、水稻、毛果楊等植物全基因組測序已經(jīng)完成。使得研究人員不僅可以研究單一酶基因的結(jié)構(gòu)和功能，還可以從基因家族、基因簇等層面研究代謝途徑中多個(gè)酶基因的協(xié)同表達(dá)與調(diào)控，這為研究4CL的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的方向。

已完成的擬南芥全基因組測序中鑒定出4種4CL基因的功能，但在擬南芥基因組中還存在許多4CL相似的基因，這些4CL相似基因的功能尚不得而知。毛果楊等木本植物中有多少4CL基因，其功能如何尚在研究中。相信“基因組計(jì)劃”的發(fā)展，會(huì)分離并鑒定出更多植物的4CL基因。

由于木本植物生長周期較長，個(gè)體基因型的不同會(huì)在不同程度上影響到植株再生和轉(zhuǎn)化效率。因此，調(diào)控4CL基因影響植株生長的作用機(jī)制尚不清楚，關(guān)于轉(zhuǎn)4CL基因木本植物的細(xì)胞壁化學(xué)組成、木材品質(zhì)和解剖特性等材性研究尚不多見。田曉明等［56］對(duì)轉(zhuǎn)4CL基因毛白楊進(jìn)行細(xì)胞壁組成、細(xì)胞壁解剖結(jié)構(gòu)和木材品質(zhì)等分析發(fā)現(xiàn)，4CL1基因?qū)ιL素含量具有間接調(diào)控作用，轉(zhuǎn)基因毛白楊木質(zhì)部導(dǎo)管形態(tài)變化，導(dǎo)致木質(zhì)部傳導(dǎo)性降低，干擾植物的正常生理代謝，從而對(duì)植株生長產(chǎn)生影響。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Research Progress on 4-Coumarate：Coenzyme A Ligase（4CL）in Plants

TIAN Xiao-ming YAN Li-hong XIANG Guang-feng JIANG Li-yuan
（Hunan Forest Botanical Garden，Changsha 410116）

4CL（4-coumarate：coenzyme A ligase，EC6.2.1.12）is a key enzyme in the lignin biosynthesis pathway，and it catalyzes a hydroxycinnamic acids and its derivatives to generate the corresponding thioester. Concurrently，4 CL is also the third step in the metabolic pathway of phenylpropane，ligating the precursor of lignin and varied branch pathways，playing the critical regulating role in the lignin synthesis. It has become a research hotspot that uses the genetic engineering way to alter lignin biosynthesis，to reduce lignin content，and to decrease the pollution in pulp and papermaking process. Combining the new reports about 4CL in recent years，we summarized the research progresses on phylogenetics，enzymatic activities，crystal structure and catalytic mechanism and regulation of 4CL in lignin biosynthesis. The future directions of researches on 4CL were also suggested, This paper provides reference information for 4CL in the future study.

4CL；lignin；enzymology；crystallography；gene regulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.003

2016-09-06

湖南省林業(yè)科技計(jì)劃項(xiàng)目（XLK201514），湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016NK2156），湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016NK2194）

田曉明，女，博士后，高級(jí)工程師，研究方向：珍稀瀕危植物致瀕機(jī)理、保護(hù)與利用；E-mail：tianxiaoming1986@126.com