寧猛?鄭鎮(zhèn)偉?蔣珊?游志堅

[摘要] 目的 研究鞘內注射美洛昔康（Mel）對CCI模型疼痛治療效果和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）內生長相關蛋白-43（GAP-43）、神經(jīng)生長因子（NGF）表達的影響。 方法 成年SD雄性大鼠隨機分成四組：正常對照（C）組不做處理，CCI組不予注藥，生理鹽水（NS）治療組予注射生理鹽水，美洛昔康治療（Mel）組予注射不同劑量美洛昔康（Mel組100μg，qd、Mel2組200μg，qd、Mel3組100μg，bid、Mel4組200μg，bid）；每（亞）組均為5只大鼠。35只大鼠分別于術前及術后3d、7d測試機械性縮足反射閾值（MWT）和熱縮腿潛伏期（TWL）。術后7d取材大鼠DRG，檢測其GAP-43、NGF表達水平。 結果 MWT、TWL方面CCI組、NS組和Mel組較正常組顯著下降（P<0.05）；美洛昔康組比CCI、NS組下降幅度?。≒<0.05），且劑量越大MWT、TWL下降幅度越小（P<0.05）。GAP-43、NGF表達方面CCI組、NS組>Mel組>C組（P<0.05），且美洛昔康劑量越大，表達越少。 結論 鞘內注射美洛昔康能明顯減輕大鼠CCI模型的機械痛敏和熱痛敏，并降低DRG內GAP-43、NGF的表達水平。

[關鍵詞] 神經(jīng)性疼痛；鞘內給藥；環(huán)氧化酶抑制劑；生長相關蛋白-43；神經(jīng)生長因子

[中圖分類號] R614 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）05-09-06

[Abstract] Objective To study the impact of intrathecal injection of meloxicam to the effect of CCI model on pain management and the expression of Growth-associated protein 43 and Nerve growth factor. Methods Adult SD male rats were randomly divided into four groups.Rats in control group were nothing，rats in CCI group were treated with no drug injection and normal saline，rats in treatment group were treated with saline injection，and rats in meloxicam group were treated with injection of different doses of meloxicam （100μg， qd in Mel1 group，200μg qd in Mel2 group，100μg， bid in Mel3 group，and 200μg， bid in Mel4 group）.5 rats were in each group.Mechanical withdrawal threshold （MWT） and Thermal withdrawal latency （TWL） of the 35 rats were determined before the operation and 3d，7d after the operation.DRG was selected on 7d after the operation to detect the expression level of GAP-43 and NGF. Results MWT and TWL in CCI group，MS group and Mel group were significantly decreased，compared with control group （P<0.05）.The decrease range of Mel group was less than that of CCI group and NS group （P<0.05）. The larger the dose，the smaller the decrease of MWT and TWL （P<0.05）.In the expression level of GAP-43 and NGF，CCI group>NS group>Mel group>Control group （P<0.05）.The larger the Meloxicam dose，the less the expression. Conclusion Intrathecal injection of meloxicam can significantly reduce mechanical allodynia and thermal hyperalgesia of rats CCI model，and reduce the expression of GAP-33 and NGF in DRG.

[Key words] Neuropathic pain；Intrathecal administration；Cyclooxygenase inhibitor；Growth-associated protein 43；Nerve growth factor

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是各種疾患引起的外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導通路異?；蚬δ苷系K導致的痛敏癥狀，可出現(xiàn)于許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，影響到6%～8%的普通人群。NP對生活質量、情緒和睡眠的影響超過了其致病的病理負擔[1]。由于其發(fā)病機制尚不明了，治療效果不滿意，目前多采用對癥處理。研究[2-3]表明，環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）與神經(jīng)性疼痛的發(fā)生密切相關，應用COX抑制劑治療神經(jīng)疼痛有一定效果。但全身用藥帶來的副作用卻限制了其臨床應用，而鞘內給藥報道不多。GAP-43被認為是神經(jīng)損傷生長發(fā)育和損傷再生分子標志，NGF表達與DRG出芽有關。二者被認為與神經(jīng)損傷后神經(jīng)性疼痛的發(fā)生相關[4]。為此，2016年5～10月本研究探討鞘內注射（intrathecal injection，INTRA）選擇性COX抑制劑美洛昔康對CCI疼痛模型的治療效果，以及對GAP-43、NGF表達水平影響。進而探討病理性神經(jīng)疼痛的機制，以及預測COX抑制劑鞘內給藥對疼痛治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 動物分組與鞘內給藥

實驗采用成年SD雄性大鼠（汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心提供），體重200～260g。實驗大鼠分為四組，分別為正常對照（C）組，CCI組，生理鹽水（NS）治療組和美洛昔康Mel（上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，H20020217）治療組，Mel組又根據(jù)給藥劑量的不同分為四個亞組。首先，從INTRA成功大鼠中按隨機數(shù)字法選出5只大鼠作為C組，之后將INTRA和CCI造模成功的大鼠按隨機數(shù)字法分到其余各組中，每（亞）組均為5只。CCI組，行INTRA和CCI造模，但未予注藥；NS組，行INTRA和CCI造模，術后6h開始每天鞘內注射生理鹽水1次，容量為20μl；Mel組，行INTRA和CCI造模，術后6 h開始鞘內注射美洛昔康，注射的劑量分別為：Mel1組100μg，qd，Mel2組200μg，qd，Mel3組100μg，bid，Mel4組200μg，bid，直至術后第7d，鞘內注射的美洛昔康其容量均為20μL，再加NS 5μL沖管。

1.2 方法

1.2.1 鞘內給藥模型的制作 選取PE-10導管（smiths medical公司，英國），本研究進行了部分改造。見圖1。按照Strkson RV 報道的方法[5]進行選取腰段置管并加以改進，采用腰麻針引導。

1.2.2 利多卡因篩選實驗 置管術3d后取運動功能正常的大鼠鞘內注射2%利多卡因（上海旭東海普藥業(yè)，中國）20μL+NS 7μL，藥物與NS間隔1μL氣泡，確保全部注入蛛網(wǎng)膜下隙，如注藥30s內出現(xiàn)雙下肢癱瘓并在30min內恢復則表示鞘內置管模型成功。用于后續(xù)CCI造模實驗。

1.2.3 大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型 參照Bennett和Xie1988年創(chuàng)建的方法[6]，在大鼠右側臀肌間隙暴露坐骨神經(jīng)主干部位，4-0的鉻腸線結扎坐骨神經(jīng)，結扎以引起大鼠腿部輕微抽搐而不影響神經(jīng)外膜的血運為度，共打并列的結4個，結與結之間的間距大約為1mm，結扎完成后依次縫合肌肉和皮膚。左側作為正常對照。術后6h，大鼠完全清醒的狀態(tài)下，以Von Frey觸針（stolting公司，美國）和BME-410C熱痛刺激儀（中國醫(yī)學科學院科學院生物工程研究所，中國）測試大鼠的機械性痛閾和熱痛閾，選擇機械性痛閾和熱痛閾縮短的大鼠，即成功的CCI模型進入下一步的實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1 機械性縮足反射閾值（MWT） 于篩網(wǎng)上用五塊透明的有機玻璃板圍成一個屋形空間，大鼠置于其中安靜20min。使用Von Frey纖維絲垂直刺激大鼠右側后肢足底中部，從2g開始，逐步增加，直至大鼠出現(xiàn)縮足反應后，記錄陽性（X），陽性前最后一次陰性（O）觸針開始，序貫測試三次，得到一系列數(shù)據(jù)，如OXOXOO，然后按照S.R. Chaplan等介紹的vonfrey使用方法[7]，查表得到系數(shù)k值，進行公式運算，得到50%縮足反射閾值。50%（g） threshold=[10（Xf+kδ）]/10000，Xf=最末次測試von Frey hair觸針對應的對數(shù)值，在Vonfrey觸針手柄上有標識；K值可根據(jù)撤足反應模式查表得出；δ=0.224。

1.3.2 熱縮腿潛伏期（TWL） 用BME-410C型熱痛刺激儀照射大鼠足底。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮腿潛伏；切斷時間為25s，以防止組織損傷。每只動物測定5次，剔除最小值和最大值，取剩余三數(shù)值的平均值，每次間隔3min。MWT和TWL分別于CCI術前、術后3d、術后7d測試。

1.3.3 標本取材、免疫組織化學 術后7d測試完，1%戊巴比妥麻醉后，取材大鼠L5、L6背根神經(jīng)節(jié)，4%多聚甲醛固定12h，蠟塊包埋，組織切片，片厚4μm。使用SP法檢測背根神經(jīng)節(jié)中的GAP-43和NGF的表達情況，主要步驟大致如下：（1）常規(guī)脫蠟至水；（2）高壓抗原修復；（3）3%過氧化氫室溫孵育；（4）滴加正常山羊血清封閉；（5）滴加兔抗GAP-43單克隆抗體（Abcam，公司，英國）或兔抗NGF多克隆抗體（Abcam公司，英國）孵育，4℃過夜；（6）PBS緩沖液洗，滴加生物素化的羊抗兔IgG；（7）滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液；（8）DAB顯色試劑室溫下顯色，鏡下控制反應時間；（9）蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹脂封片；（10）陰性對照用PBS替代一抗行免疫組化染色。應用圖像分析系統(tǒng)ImagePro-Plus6.0對免疫組化染色結果進行分析，在200倍鏡下觀察大體情況，然后在400倍光鏡下觀察并隨機選取三個視野，運用ImagePro-Plus6.0測定每張圖片的平均光密度值（IOD/area），即每個視野陽性染色區(qū)域總光密度與陽性染色區(qū)域的面積之比，取三個視野的平均值，應用平均光密度值來表示GAP-43和NGF表達水平的強弱，半定量分析和比較各組標本中GAP-43和NGF的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用ImagePro-Plus6.0圖像軟件分析免疫組化切片，以平均光密度值來表示GAP-43、NGF蛋白表達水平的高低。采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗結果計量資料以（）表示，組間比較采用多樣本均數(shù)單因素方差分析，組內比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

所有入選大鼠實驗中未出現(xiàn)死亡、傷口感染、脫管情況。坐骨神經(jīng)結扎側后肢出現(xiàn)不敢負重、跛行、甩腿、舔足現(xiàn)象，病側后肢肌肉現(xiàn)萎縮。

2.2 大鼠機械性縮足反射閾值（MWT）、熱縮腿潛伏期（TWL）變化

2.2.1 機械性縮足反射閾值（MWT） （1）術前MWT各組基礎值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C組術前與術后差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；術后MWT CCI組、NS組明顯低于C組（P<0.05），CCI組和NS組的MWT值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；（2）術后3dMWT值，與CCI組比較，Mel4組明顯增加（P<0.05），而Mel1組、Mel2組、Mel3組雖有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（3）術后7d NS組和CCI組的MWT值，與Mel四個亞組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；（4）術后3d、7d，Mel四個亞組隨給藥劑量的成倍增加MWT逐漸延長，但并未出現(xiàn)成倍增加。見表1。

2.2.2 熱縮腿潛伏期（TWL） （1）術前TWL各組基礎值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C組術前與術后差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；TWL值術后CCI組、NS組明顯低于C組（P<0.05），CCI組和NS組的TWL值無明顯差異（P>0.05），Mel 2組、Mel3組無明顯差異（P>0.05）；（2）術后3dTWL值，Mel組與CCI組、NS相比明顯增加（P<0.05）；Mel1組與Mel2組、Mel3組、Mel4組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（3）術后7d TWL值，與CCI、NS組相比，Mel四個亞組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；（4）術后3d、7d，Mel亞組TWL值Mel 4組>Mel2組>Mel3組>Mel1組，隨給藥劑量成倍增加TWL逐漸延長。見表2。

2.3 GAP-43蛋白表達變化

C組背根神經(jīng)節(jié)內神經(jīng)元細胞GAP-43表達最少，CCI組、NS組與C組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；Mel組與CCI組、NS組比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CCI組與NS組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。Mel治療組，GAP-43表達量Mel1組>Mel3組>Mel2組>Mel4組，隨給藥劑量的成倍增加GAP-43的表達逐漸減少。Mel2組與Mel3組比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3，圖2。

2.4 NGF蛋白表達變化

C組背根神經(jīng)節(jié)內神經(jīng)元細胞NGF表達最少，Mel各亞組與CCI組、NS組比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CCI組與NS組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。NGF表達量Mel1組>Mel3組>Mel2組>Mel4組，隨給藥劑量的成倍增加NGF的表達逐漸減少。與Mel2組比，Mel3組、Mel4組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4，圖3。

3 討論

前列腺素（prostaglandins，PGs）是動物和人體內的一類炎癥、疼痛介質，環(huán)氧化酶（COX）是前列腺素合成的限速酶。研究表明，COX與神經(jīng)性疼痛的發(fā)生密切相關，目前發(fā)現(xiàn)脊髓中的COX主要有三個亞型：COX-1、COX-2和COX-3 [2-3，8]。抑制環(huán)氧化酶的表達有助于改善神經(jīng)性疼痛的痛敏狀態(tài)，美洛昔康是選擇性COX-2抑制劑，優(yōu)先作用于COX-2，也作用與COX-1。脊髓中的COX-2可能在神經(jīng)性疼痛的發(fā)生中起作用，而外周的COX-2可能在神經(jīng)性疼痛的維持中起作用[3，9]。全身性使用COX-2抑制劑對神經(jīng)性疼痛可以起到一定的治療效果，但用藥量大，加重了藥物副作用出現(xiàn)，極大地限制了該類藥物的應用。GAP-43蛋白是神經(jīng)發(fā)育和發(fā)育的分子標志，NGF是神經(jīng)修復、再生最具代表性的生長因子。眾多研究表明二者與神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)性疼痛相關[4，10-13]。

本實驗通過鞘內給藥模型、CCI疼痛模型組合，鞘內注射選擇性COX-2抑制劑美洛昔康，直接作用于相應神經(jīng)元脊髓節(jié)段，用藥量小、針對性強。避免因全身用藥量大才能達到效果的難題。使用Vonfrey觸針、BME-410C熱痛刺激儀對各組大鼠MWT、TWL進行測定觀察，正常對照組術前術后變化，差異無統(tǒng)計學意義，CCI組、NS治療組術后3d內MWT、TWL明顯下降，之后至術后7d內相對穩(wěn)定；美洛昔康治療組MWT、TWL術后3d內也出現(xiàn)相應下降，但幅度相比CCI組、NS組小，隨著實驗進展，用藥后MWT、TWL出現(xiàn)輕微回升，但不能達到完全緩解癥狀，術后7d改善效果依次為Mel4組>Mel2組>Mel3組>Mel1組。說明鞘內注射美洛昔康可以改善大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷的熱痛敏、機械痛敏癥狀，緩解程度與給藥劑量成一定的正相關性，再次驗證了COX在神經(jīng)性疼痛發(fā)生過程中的作用以及COX抑制劑在神經(jīng)性疼痛中的治療效果。Mel2組效果雖然與Mel3組差異無統(tǒng)計學意義，但其均值仍>Mel3組，可能提示鞘內單次大劑量用藥效果優(yōu)于多次小劑量用藥，這尚須進一步實驗去探討；另一方面，美洛昔康劑量成倍增加并未帶來治療效果的成倍改善，提示鞘內用藥可能存在最大效應劑量，即封頂劑量。環(huán)氧化酶作為炎癥介質PGs產(chǎn)生過程中的限速酶，其作用機制涉及許多受體結合的限制[14]，組織部位不同所含受體量可能也不同，環(huán)氧化酶抑制劑的作用過程是否也涉及到受體量的限制，如果可能，是否可以通過對損傷處神經(jīng)組織的受體進行粗定量，來作為我們治療神經(jīng)性疼痛局部用藥量參照，那么就可以最大限度的避免全身性用藥量大帶來的負面影響，提高藥效，精準治療。

另外，使用Image Pro Plus6.0專業(yè)圖像處理軟件對免疫組化切片GAP-43、NGF蛋白表達水平進行半定量分析比較，正常對照組兩種蛋白表達很低，CCI、NS組呈現(xiàn)高表達，美洛昔康治療組中等表達；也驗證了GAP-43、NGF在成熟組織中正常狀態(tài)下低表達，而在神經(jīng)損傷后才出現(xiàn)表達增加這一觀點[10，15]，兩者是參與神經(jīng)修復關鍵成分。實驗中可以看到，COX-2抑制劑美洛昔康越大，一定范圍內帶來的治療效果越好，同時GAP-43、NGF蛋白表達卻低。說明COX-2抑制劑美洛昔康可能參與了抑制了GAP-43、NGF的表達，其具體機制有待進一步探討，目前相關文獻較少。研究表明[16-19]，GAP-43、NGF作為神經(jīng)修復的重要因子，在神經(jīng)出芽、攀緣纖維、纖維再分布等過程中起到關鍵作用，并參與神經(jīng)性疼痛的發(fā)生，這涉及神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性、神經(jīng)膠質細胞的激活。尤其是NGF，作為第一個神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，可通過酪氨酸激酶受體TrkA和腫瘤壞死因子受體p75NTR兩種膜受體介導引起一系列的生物效應，如誘導神經(jīng)纖維生、參與炎癥因子釋放以及影響離子通道開放，敏化外周傷害性感受器，同時可使非選擇性的配體門控陽離子通道閾值降低，導致痛覺神經(jīng)元動作電位的閾值降低，從而介導疼痛信號的傳導，導致病理性疼痛[20-23]。因此，把COX-2選擇性抑制劑美洛昔康在本實驗中治療效果與二者蛋白表達情況進行聯(lián)系，我們推測COX-2抑制劑對神經(jīng)性疼痛的治療機制是否涉及神經(jīng)修復過程，COX-2抑制劑如何參與到了GAP-43、NGF表達，是否參與神經(jīng)重塑、星形細胞活化等過程，有待以后實驗進一步探究。目前國內有關鞘內給藥環(huán)氧化酶抑制劑治療疼痛的研究報道尚少。

綜上所述，可見COX抑制劑美洛昔康對神經(jīng)性疼痛的治療效果是肯定的，而目前有關鞘內注射COX抑制劑治療神經(jīng)性疼痛的國內國外文獻報道尚少，結合GAP-43、NGF指標的亦未多見，為此該項研究進行了嘗試性探索。由于本實驗觀察時間為7d，鞘內長期給藥COX抑制劑安全性暫不能下結論，目前僅限于基礎實驗研究，但其作為一種特殊給藥方式治療神經(jīng)疼痛，有著自身的優(yōu)點，臨床應用前景廣闊，值得引起學者們關注。

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（收稿日期：2017-01-15）