何宗均+田陽(yáng)+梁海恬

摘 要：從15個(gè)污泥樣品中分離篩選出5株P(guān)HA產(chǎn)生菌，其中A-0603-11為產(chǎn)PHA最好菌株，經(jīng)蘇丹黑染色鏡檢發(fā)現(xiàn)有2～3個(gè)PHA顆粒，黑色部分的體積占菌體50%以上。生理生化試驗(yàn)表明，該菌為革蘭氏陰性桿狀，單鞭毛運(yùn)動(dòng)，好氧，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，不發(fā)酵D-葡萄糖和其它糖類。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，該菌為Delftia sp.，屬于Comamonadaceae叢毛單胞菌科。

關(guān)鍵詞：PHA；菌株；篩選；鑒定

中圖分類號(hào)：Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.04.006

Screening and Identification of PHA Producing Bacteria

HE Zongjun， TIAN Yang，LIANG Haitian

（Tianjin Institute of Agriculture Resources and Environmental Science， Tianjin 300192， China）

Abstract： A test was conducted in that 5 PHA producing bacterium strains isolated from 15 samples of sludge， and the A-0603-11 strains was the best for PHA production among them. By microscopy with staining on Sudan black dye， the A-0603-11 strains was found that they had two or three particles of PHA， and the black part volume accounted for over 50% of the bacteria. The physiological and biochemical experiments showed that the bacteria was in gram-negative rods， single flagella， aerobic， not fermentation d-glucose and other sugars， and oxidase was positive. According to the molecular biology， the A-0603-11 bacteria was Delftia sp. and it was belong to the Comamonadaceae fetlock division of bacterium.

Key words： PHA；bacteria；screening；identification

PHA（聚羥基脂肪酸酯，Polyhydroxyalkanoate）是廣泛存在于多種微生物及其它生物體內(nèi)的一種細(xì)胞內(nèi)涵物。PHA具有與化學(xué)合成塑料相似的物理機(jī)械特性，作為一種微生物合成的、性能類似于聚丙烯的可降解“塑料”而引起人們的關(guān)注。PHA在自然界中可降解，造成的環(huán)境污染小，是可再生的生物資源，有利于可持續(xù)發(fā)展，在很多領(lǐng)域有著較大的應(yīng)用潛力。例如PHA材料具有類似塑料的物化性質(zhì)，可以用作包裝材料或者日常消費(fèi)用塑料制品，用其替代現(xiàn)有的大規(guī)模使用的石油來(lái)源的不可降解塑料，將有助于解決“白色污染”等環(huán)境問(wèn)題；PHA材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，在高附加值的細(xì)胞組織工程領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景；PHA材料可作為生物可降解和生物相容性醫(yī)用植入材料和可控藥物緩釋載體；PHA作為一種胞內(nèi)生物聚酯，是多種微生物（包括細(xì)菌、古細(xì)菌）在碳源過(guò)剩時(shí)儲(chǔ)備能量和碳源的物質(zhì)，PHA本身具有可燃性，可以用于制備生物燃料[1-20]。但是，PHA材料在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用研究卻鮮有報(bào)道，因此，PHA材料在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用基礎(chǔ)研究應(yīng)該得到重視。基于以上考慮，本研究從農(nóng)業(yè)可降解材料產(chǎn)生菌的角度出發(fā)，篩選PHA產(chǎn)生菌并進(jìn)行初步的鑒定。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

篩選樣品：4個(gè)排污口污泥樣品和11個(gè)農(nóng)村生活污水溝污泥樣品。

初篩培養(yǎng)基：胰蛋白胨 2.5 g，酵母提取物2.5 g，葡萄糖5 g，蔗糖2 g，麥芽糖 2 g，甘露醇1 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉 20 g，水100 mL，調(diào)pH值至6.5～7.0，121 ℃高壓20 min，稍涼后，以體積比1∶100加入1%溴百里香酚藍(lán)（稱取1 g溴百里香酚藍(lán)溶于100 mL 70%酒精中）倒制平板。

復(fù)篩培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5 g，酵母提取物1.5 g，葡萄糖10 g，蔗糖2 g，麥芽糖2 g，甘露醇1 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉20 g，水100 mL，調(diào)pH值至6.5～7.0，121 ℃高壓20 min，稍涼后，以體積比1∶100加入1%溴百里香酚藍(lán)（稱取1 g溴百里香酚藍(lán)溶于100 mL 70%酒精中）倒制平板。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PHA產(chǎn)生菌的初篩 取污泥樣品5 g于250 mL錐形瓶，加入45 mL無(wú)菌水，加入少許玻璃珠，搖床振搖15 min。將土樣懸液稀釋101～106倍，取各稀釋度100 μL涂布平板，30 ℃培養(yǎng)24～28 h。向平板中噴灑0.1%溴百里酚藍(lán)指示劑（取1 g溴百里酚藍(lán)，溶于1 L 20%乙醇溶液中），挑取菌落周圍變藍(lán)的菌落。將上述菌落用平板劃線法接種于新的初篩平板（直接在培養(yǎng)基中加入0.01%溴百里酚藍(lán)）上進(jìn)行純化分離。

1.2.2 PHA產(chǎn)生菌的復(fù)篩 挑取上述菌落在復(fù)篩平板上劃線培養(yǎng)，挑取菌體涂片，固定，先用蘇丹黑染色，二甲苯?jīng)_洗，再用蕃紅二次染色2～3 min。晾干后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇有染色顆粒的菌落進(jìn)行保存，即為PHA產(chǎn)生菌。

1.2.3 PHA產(chǎn)生菌的鑒定 16S rDNA測(cè)序，擴(kuò)增V3區(qū)，PCR引物為27F和1429采用高保真DNA聚合酶，F(xiàn)ast Pfu。生理生化鑒特性測(cè)定方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHA產(chǎn)生菌篩選情況

如表1所示：從4個(gè)排污口污泥樣品中分離出產(chǎn)堿菌株43個(gè)，其中產(chǎn)PHA菌株為1個(gè)；從11個(gè)農(nóng)村生活污水溝污泥樣品中分離出產(chǎn)堿菌株86個(gè)，其中產(chǎn)PHA菌株為3個(gè)。從15個(gè)樣品中共分離篩選出4株P(guān)HA產(chǎn)生菌株。對(duì)選出的4菌株按篩選地點(diǎn)及日期分別編號(hào)A-0423-21（球菌）、A-0504-9（桿菌）、A-0508-57（球菌）、A-0603-11（桿菌）和B-0510-68（球菌）。對(duì)以上5株菌進(jìn)一步的優(yōu)化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，A-0603-11菌為產(chǎn)PHA最好菌株，經(jīng)蘇丹黑染色鏡檢發(fā)現(xiàn)有2～3個(gè)PHA顆粒，黑色部分的體積占菌體50%以上，為最好菌株，并對(duì)之加以分析鑒定。

NCBI Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果如圖1所示。PCR擴(kuò)增區(qū)域1 497 bp 與文獻(xiàn)報(bào)道的Delftia sp. hg-1 16S完全一致，說(shuō)明該菌為Delftia sp，屬于Comamonadaceae叢毛單胞菌科，暫定該菌名稱為Delftia sp.A11。但Delftia sp.A11不一定就是Delftia sp. hg-1 菌株，因?yàn)橹籔CR擴(kuò)增了16S rDNA的一部分序列。

2.3 生理生化特性

生理生化試驗(yàn)表明，A-0603-11菌即Delftia sp.，為革蘭氏陰性桿狀，單鞭毛運(yùn)動(dòng)，好氧，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，不發(fā)酵D-葡萄糖和其他糖類。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從15個(gè)污泥樣品中，篩選分離出產(chǎn)堿菌共129株，又從產(chǎn)堿菌株中分離篩選出5株P(guān)HA產(chǎn)生菌。對(duì)這5株菌進(jìn)一步的優(yōu)化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，A-0603-11為產(chǎn)PHA最好菌株，經(jīng)蘇丹黑染色鏡檢發(fā)現(xiàn)有2～3個(gè)PHA顆粒，黑色部分的體積占菌體50%以上。生理生化試驗(yàn)表明，該菌為革蘭氏陰性桿狀，單鞭毛運(yùn)動(dòng)，好氧，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，不發(fā)酵D-葡萄糖和其它糖類。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定該菌為Delftia sp.，屬于Comamonadaceae叢毛單胞菌科。

基于PHA 的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用開(kāi)發(fā)是一個(gè)高科技、綠色、可持續(xù)的產(chǎn)業(yè)鏈， 隨著石油價(jià)格的不斷上漲，國(guó)家對(duì)能源安全和生態(tài)環(huán)境文明建設(shè)的重視， 以可再生資源為原料的PHA 材料逐漸為政府和企業(yè)界日漸重視。國(guó)內(nèi)對(duì)PHA 微生物生產(chǎn)的研究也正逐步降低材料成本， 同時(shí)一些高附加值的應(yīng)用開(kāi)發(fā)也取得了初步的成果， 一些大型發(fā)酵企業(yè)也加入到PHA 的研發(fā)和生產(chǎn)中， 推動(dòng)了產(chǎn)、學(xué)、研的有機(jī)結(jié)合。相信在國(guó)家政策和資金支持、在科學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界的不斷努力下， 以PHA為基礎(chǔ)的相關(guān)生產(chǎn)和應(yīng)用研究將會(huì)得到更快的發(fā)展。

面對(duì)當(dāng)前的農(nóng)業(yè)面源污染，如農(nóng)用地膜的污染、化肥過(guò)量以及不合理應(yīng)用造成的污染等，國(guó)家提出了建設(shè)農(nóng)業(yè)生態(tài)文明的戰(zhàn)略要求，健康可持續(xù)的農(nóng)業(yè)發(fā)展模式是實(shí)現(xiàn)這一戰(zhàn)略要求的基本條件之一，應(yīng)用環(huán)境友好型的新型農(nóng)用材料是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展模式的必備條件之一。PHA材料在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用基礎(chǔ)研究應(yīng)該得到重視，如可加工制造可降解的生物保水劑以逐漸代替已造成面源污染的農(nóng)用地膜，生產(chǎn)用作肥料的緩釋劑載體等。

基于以上考慮，在已篩選出PHA高產(chǎn)生菌Delftia sp.A11的基礎(chǔ)上，今后應(yīng)進(jìn)一步研究該菌合成的PHA組分、含量以及相關(guān)基因組成，為建立自有菌種資源庫(kù)，構(gòu)建工程菌株，為實(shí)現(xiàn)PHA材料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用和推廣奠定基礎(chǔ)。

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