周 玄，曹昌娥，楊 嬌，陽美松，邵明園，高洋洋，賴 泳，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp蛋白外排活性的影響

周 玄1，曹昌娥1，楊 嬌1，陽美松1，邵明園1，高洋洋1，賴 泳1，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

目的：研究燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-糖蛋白（P-gp）外排活性的影響。方法：采用MTT法檢測燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響，以確定其試驗(yàn)劑量；通過BCA法測定燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中總蛋白量的影響，羅丹明123（Rh123）轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)評(píng)價(jià)燈盞花素作用后時(shí)間對(duì)P-gp外排活性的影響。結(jié)果：燈盞花素濃度<577.95μg/mL時(shí)，Caco-2細(xì)胞的存活率>90%；燈盞花素能增加Caco-2細(xì)胞中P-gp的外排活性，加入Rh123后，Rh123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的累積量先增加再減少；作用60 min后，燈盞花素（120、240μg/mL）對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)總蛋白量分別上調(diào)222.87%，154.23%。結(jié)論：燈盞花素能增加P-gp的外排活性，并上調(diào)Caco-2細(xì)胞中的總蛋白量。

燈盞花素；P-糖蛋白；Caco-2細(xì)胞；羅丹明123

燈盞花素是從燈盞花（菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬）中提取的黃酮類活性成分〔1-2〕，主要為燈盞甲素和燈盞乙素（野黃芩苷），絕大多數(shù)為燈盞乙素。研究表明，燈盞花素具有擴(kuò)張血管、增加腦血流量和動(dòng)脈流量、降低血液黏度和外周阻力、抗血小板聚集等藥理作用〔3-4〕。P-糖蛋白（P-gp）是由人MDR1基因編碼的分子量為170 kDa的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于能量依賴型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)超家族成員，其主要定位于成熟的腸上皮細(xì)胞的頂面、肝細(xì)胞小管膜、腎和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞等組織〔5-6〕。P-gp介導(dǎo)許多外源性化合物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其功能活性的改變對(duì)藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程具有顯著影響〔7-8〕。體外研究表明，燈盞乙素在Caco-2細(xì)胞模型中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)由P-gp介導(dǎo)〔9-10〕，燈盞花素可能會(huì)抑制腦組織中P-gp的表達(dá)〔11〕；通過鈣黃綠素-AM熒光篩選試驗(yàn)研究人轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤細(xì)胞株WM-266-4中燈盞乙素對(duì)P-gp活性的影響，結(jié)果顯示：燈盞乙素對(duì)P-gp表現(xiàn)出弱的抑制作用〔12〕，但尚未明確燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp活性的影響。因此，本研究旨在考察燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響，為今后的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器Caco-2細(xì)胞（中科院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS，Gibco公司）；雙抗、0.25%胰蛋白酶（美國Millipore公司）；MTT（噻唑藍(lán)）、PBS（磷酸緩沖鹽溶液）、羅丹明123（Rh123）均購自Solarbio公司；利福平（索萊寶公司）；DMSO（二甲基亞砜，美國Sigma公司）；燈盞花素（Breviscapin，含94.6%的燈盞乙素，云南植物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：HB201201）；RIPA裂解液（Beyetime，批號(hào)：P0013B，主要成分為50 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1%SDS以及sodium orthovan?adate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；Purifier Logic+二級(jí)生物安全柜（LABCONCO）；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國Bio Tek）；熒光分光光度計(jì)（960MC，上海精科）。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2細(xì)胞接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入10~15 mL DMEM培養(yǎng)基（含1%雙抗和10%FBS），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期生長（細(xì)胞融合率80%~ 90%）時(shí)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法） 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔終體積100μL，分為陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組不接種細(xì)胞。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，去除每孔培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的燈盞花素（溶于DMEM中）200μL，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組加入200μL空白培養(yǎng)基。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，PBS清洗2遍，每孔加20μL的MTT（5 mg/mL）繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，每孔加150μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解?？瞻讓?duì)照組調(diào)零后，用酶標(biāo)儀測490 nm處的吸光度值（A），按下式計(jì)算細(xì)胞存活率（cellsurvivalrate），存活率大于90%可認(rèn)為該濃度的燈盞花素對(duì)細(xì)胞生長無顯著影響。

1.2.3 燈盞花素作用后時(shí)間對(duì)Rh123攝取的影響

Caco-2細(xì)胞用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心（1 000 r/min，5 min）棄上清后，PBS分散成細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，取0.5 mL接種入1.5 mL滅菌的EP管中?？瞻讓?duì)照組、陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組先分別加入500μL的PBS、利福平溶液（溶于DMEM中，10μmol/L）和燈盞花素溶液（120μg/mL、240μg/mL），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min后，置冰上終止反應(yīng)，4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清，冰冷的PBS洗2次（每次1 mL），4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清，再分別加入120μmol/L的Rh123（溶于DMEM中）溶液10μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（20、40、60、80、100 min），每到1個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)取出1批細(xì)胞，置冰上終止作用，4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清，冰冷的PBS洗2次（每次1 mL），4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清。加入50μL細(xì)胞裂解液，充分混勻，置冰上30 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min）。取20μL上清，加入1 980μL PBS混勻后，用熒光分光光度計(jì)測定吸收值（激發(fā)波長：466 nm，發(fā)射波長：535 nm）。

1.2.4 燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中總蛋白量的影響

取利福平和燈盞花素處理60 min后的Caco-2細(xì)胞，加入50μL細(xì)胞裂解液，充分混勻，置冰上30 min， 4℃離心（12 000 r/min，5 min），取上清液用BCA法測定蛋白量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用one-way ANOVA檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示。

2 結(jié)果

2.1燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性2 311.80，577.95，144.49，36.12，36.12，9.03和2.28μg/mL的燈盞花素分別與Caco-2細(xì)胞共孵育作用24、48及72 h后，除2 311.80μg/mL以外，其他濃度下細(xì)胞存活率均大于90%。表明濃度低于577.95μg/mL時(shí)，燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞無明顯毒性作用，故選用120、240 μg/mL的燈盞花素進(jìn)行下一步研究。見表1。

表1 燈盞花素不同濃度下Caco-2細(xì)胞的存活率

表1 燈盞花素不同濃度下Caco-2細(xì)胞的存活率

藥物燈盞花素濃度/（μg/mL）2 311.80 577.95 144.49 36.12 9.03 2.28細(xì)胞存活率/% 24 h 51.54±6.42 91.04±2.24 92.53±3.08 94.96±3.23 91.04±2.67 91.41±1.13 48 h 36.51±0.84 90.85±1.17 94.57±2.11 94.19±2.59 91.86±1.23 91.86±1.63 72 h 48.52±6.21 90.33±0.81 92.83±3.02 94.38±0.98 93.60±2.20 92.55±3.03

2.2燈盞花素作用后時(shí)間對(duì)Caco-2細(xì)胞胞內(nèi)Rh123累積量的影響利福平、燈盞花素（120、240μg/mL）與Caco-2細(xì)胞共孵育60 mim后加入Rh123，與空白對(duì)照組相比，20 min時(shí)Rh123在胞內(nèi)累積量分別減少16.64%，38.38%，22.12%（P<0.01）；40 min時(shí)Rh123在胞內(nèi)累積量分別減少58.81%，52.19%，38.51%（P<0.01）；60 min時(shí)Rh123在胞內(nèi)累積量分別減少78.81%，75.19%，70.69%（P<0.01）；80 min時(shí)Rh123在胞內(nèi)累積量分別減少60.17%，61.74%，52.45%（P<0.01）；100 min時(shí)Rh123在胞內(nèi)累積量分別減少20.56%，14.34%，34.94%（P<0.01）；120 min時(shí)Rh123在胞內(nèi)累積量分別減少9.64%（P<0.01），1.16%，21.32%（P<0.01）。以上結(jié)果表明，燈盞花素能增加Caco-2細(xì)胞中P-gp的外排活性；加入Rh123后，其在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的累積量先減少再增加，其中，高濃度（240μg/mL）對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp的作用較強(qiáng)。見圖1。

圖1 燈盞花素作用后時(shí)間對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)Rh123累積量的影響（

2.3燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中總蛋白量的影響

利福平（10μmol/L）、燈盞花素（120、240μg/mL）作用于Caco-2細(xì)胞60 min后，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)總蛋白量分別上調(diào)123.60%，222.87%，154.23%（P<0.01）。由此可見，燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中蛋白的表達(dá)具有誘導(dǎo)作用。見圖2。

圖2 燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中總蛋白量的影響

3 討論

燈盞花素臨床上常作為輔助藥物與其他西藥聯(lián)合用于心、腦血管疾病的治療，如冠心病、心絞痛、缺血性血管疾病損傷、腦栓塞等〔4〕。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，燈盞乙素能抑制人肝微粒體CYP450酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4等）及大鼠肝微粒體CYP450酶（CYP2C7、CYP2C11、CYP2D4、CYP3A1等）活性〔9，12〕。燈盞花素可能會(huì)抑制腦組織中P-gp的表達(dá)〔11〕，而燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp活性的影響尚未明確。故本研究對(duì)燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp活性的影響進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)采用120、240μg/mL的燈盞花素分別與Caco-2細(xì)胞共孵育，通過測定Caco-2細(xì)胞內(nèi)P-gp底物Rh123的熒光強(qiáng)度來表示其累積量，以反映P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性的改變。結(jié)果顯示，共孵育60 min后，Caco-2細(xì)胞中P-gp的外排轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)；加入Rh123后，P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)活性隨時(shí)間發(fā)生改變；其中，高濃度（240μg/mL）對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp的作用較強(qiáng)。P-gp抑制劑可通過改變P-gp構(gòu)象逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，也可通過與其底物競爭P-gp結(jié)合位點(diǎn)阻斷藥物的外排〔13〕，從而短時(shí)間內(nèi)即可產(chǎn)生作用。燈盞乙素在Caco-2細(xì)胞模型中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)由P-gp介導(dǎo)〔9-10〕。燈盞花素與Caco-2細(xì)胞共孵育60 min后，燈盞花素對(duì)Caco-2細(xì)胞的作用達(dá)到平衡，Caco-2細(xì)胞中P-gp的外排活性增加，Rh123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的累積量減少，60 min時(shí)達(dá)到最低。當(dāng)加入P-gp底物Rh123后，Rh123將與燈盞花素競爭P-gp的結(jié)合位點(diǎn)，從而破壞已有平衡，使得Caco-2細(xì)胞中P-gp的外排活性逐漸降低，導(dǎo)致Rh123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的累積量又逐漸增加。燈盞花素高濃度（240μg/mL）時(shí)的變化趨勢相較于低濃度（120μg/mL）要緩，可能是燈盞花素高濃度時(shí)更能保持已有平衡。燈盞花素（120、240μg/mL）作用于Caco-2細(xì)胞60 min后，細(xì)胞內(nèi)總蛋白量分別上調(diào)222.87%，154.23%，結(jié)合燈盞花素能使Caco-2細(xì)胞內(nèi)Rh123的累積量減少，推測P-gp的量可能增加。但燈盞花素對(duì)P-gp蛋白表達(dá)量的影響還需進(jìn)一步研究。

由于P-gp底物比較寬泛（如蒽環(huán)類和多肽類抗生素、生物堿、類固醇類激素、局麻藥等），且底物間化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)差異很大〔14〕，因此，單一底物所得的結(jié)果可能并不準(zhǔn)確，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證其他類型的P-gp底物作為探針時(shí)，燈盞花素對(duì)P-gp活性的影響；同時(shí)燈盞花素與其他藥物可能的藥物相互作用也值得深入研究。綜上，燈盞花素短時(shí)間內(nèi)（60 min）就能增強(qiáng)Caco-2細(xì)胞中P-gp的外排活性并上調(diào)胞內(nèi)總蛋白量。結(jié)果提示，燈盞花素與P-gp底物共同使用時(shí)可能產(chǎn)生潛在相互作用，這將為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)性參考依據(jù)。

［參考文獻(xiàn)］

〔1〕JIANG N H，ZHANG G H，ZHANG J J，et al.Analysis of the transcriptome of Erigeron breviscapus uncovers puta?tive scutellarin and chlorogenic acids biosynthetic genes and genetic markers〔J〕.PLoS ONE，2014，9（6）：100357.

〔2〕孫文基，繩金房.天然活性成分簡明手冊(cè)〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1998.

〔3〕XU Q Y，LI X X.Influences of deng zhan xi xin injection on blood viscosity in patients with high blood viscosity〔J〕. Chin New Drugs Clin Rew，1995，14（4）：233-235.

〔4〕ZHANG H F，HU X M，WANG L X，et al.Protective effects of scutellarin against cerebralischemia in rats：evidence for inhibition of the apoptosis-inducing factor pathway〔J〕. Planta Med，2009，75（2）：121-126.

〔5〕ZHANG L，REYNOLDS K S，ZHAO P，et al.Drug interac?tions evaluation：an integrated part of risk assessment of therapeutics〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol，2010，243（2）：134-145.

〔6〕JONES P M，GEORGE A M.Opening of the ADP-bound active site in the ABC transporter ATPase dimer：evidence for a constant contact，alternating sites model for the cata?lytic cycle〔J〕.Proteins，2009，75（2）：387-396.

〔7〕KUMAR Y S，ADUKONDALU D，SATHISH D，et al.PGlycoprotein and cytochrome P-450-mediated herbal drug interactions〔J〕.Drug Metabol Drug Interact，2010，25（1）：3-16.

〔8〕MARCHETTI S，MAZZANTI R，BEIJNEN J H，et al.Con?cise review：Clinical relevance of drug drug and herb drug interactions mediated by the ABC transporter ABCB1（MDR1，P-glycoprotein）〔J〕.Oncologist，2007，12（8）：927-941.

〔9〕CHEN X，JIN J，CHEN Y，et al.Effect of scutellarin on the metabolism and pharmacokinetics of clopidogrelin rats〔J〕. Biopharm Drug Dispos，2015，36（1）：64-68.

〔10〕YOU H S，ZHANG H F，DONG Y L，et al.Absorption and transportation characteristics of scutellarin and scutella?rein across Caco-2 monolayer model〔J〕.Journal of Chi?nese integrative medicine，2010，8（9）：863-869.

〔11〕金桂蘭，覃慧林，石孟瓊，等.燈盞花素對(duì)小鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用及與腦組織P-糖蛋白表達(dá)研究〔J〕.中藥藥理與臨床，2015，31（1）：76-79.

〔12〕HAN Y L，LI D，YANG Q J，et al.In vitro inhibitory ef?fects of scutellarin on six human/rat cytochrome P450 en?zymes and P-glycoprotein〔J〕.Molecules，2014，19（5）：5748-5760.

〔13〕VARMA M V，ASHOKRAJ Y，DEY C S，et al.P-glyco?protein inhibitors and their screening：a perspective from bioavailability enhancement〔J〕.Pharmacol Res，2003，48（4）：347-359.

〔14〕朱寶英，黃靜，王永林，等.P-糖蛋白及腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)〔J〕.中國藥房，2011，22（6）：550-552.

Effectof Breviscapin on the Efflux Activity of P-gp in Caco-2 Cells

Zhou Xuan1,Cao Chang'e1,Yang Jiao1,Yang Meisong1,Shao Mingyuan1,Gao Yangyang1,Lai Yong1,2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the effect of breviscapin on the efflux activity of P-gp in Caco-2 cells.Methods:Cellsurvival rate of Caco-2 cells with differentbreviscapin concentrations were measured by MTT assay.The BCA assay was used to determine the total protein level of Caco-2 cells and the efflux activity of P-gp was determined by Rhodamine-123 assay after the incubation with breviscapin.Results:The cell survival rate of Caco-2 cells was higher than 90%when the concentration ofbreviscapin was less than 577.95μg/mL.The efflux activity of P-gp was increased by breviscapin（120μg/mL,240μg/mL）in Caco-2 cells.The intracellular accumulation of rhodamine-123 was increased and then decreased after the addition of rhodamine-123.After the incubation for 60 min with breviscapin（120μg/mL,240μg/mL）,total protein level in Caco-2 cells was up-regulated 222.87%,154.23%respectively.Conclusion:Breviscapin can up-regulate totalprotein leveland increase the efflux activity of P-gp in Caco-2 cells.

Breviscapin;P-gp;Caco-2 cell;Rhodamine-123

R285

A

2096-2266（2017）04-0020-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.006

（責(zé)任編輯 李 楊）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81241139；81360511）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2013J118）

2016-08-19

2016-11-08

周玄，碩士研究生，主要從事體內(nèi)藥物分析研究.

*通信作者：賴泳，教授.