吳 強(qiáng) 胡寶坤

（1威高泰爾茂（威海）醫(yī)療制品有限公司，山東威海264210；2青島綠十字高邦職業(yè)安全咨詢事務(wù)所有限公司，山東青島266011）

真菌多糖以其獨(dú)特的生物活性而引起人們越來越多的關(guān)注?；覙浠ǎ℅rifola frondosa）是亞熱帶至溫帶森林中的一種大型藥、食兼用珍稀真菌?；覙溆置惾~多孔菌、栗子蘑、蓮花菌，日本俗名舞茸。鮮灰樹花肉質(zhì)脆嫩，味如雞絲，營養(yǎng)豐富，且含有生物活性物質(zhì)，具有獨(dú)特的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。這種傳奇的菇類直到20世紀(jì)80年代中期才人工栽培成功，此后以日本為主的科學(xué)家在化學(xué)、生化學(xué)、藥理學(xué)等方面對灰樹花進(jìn)行了廣泛的研究，證明了灰樹花是非常有價(jià)值的藥食兩用菇類，特別是從灰樹花中提取的最有效活性成分灰樹花D-fraction具有極強(qiáng)的抗癌功效[1-6]。

目前有關(guān)灰樹花的產(chǎn)品大多都是從子實(shí)體中提取得到的，雖然灰樹花人工栽培技術(shù)已經(jīng)很成熟，但人工栽培周期長，而液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體要比固態(tài)培養(yǎng)子實(shí)體簡單迅速，同時(shí)深層發(fā)酵得到的灰樹花菌絲體不但具有和子實(shí)體相當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)及藥用效果，還可得到胞外多糖等子實(shí)體所不具備的營養(yǎng)保健成分[7-8]。因此采用深層發(fā)酵方法生產(chǎn)灰樹花菌絲體可以部分替代灰樹花子實(shí)體，降低生產(chǎn)成本?；覙浠▽俣嗫拙鷮伲谝簯B(tài)深層培養(yǎng)條件下代謝能力強(qiáng)，是多糖富集的良好載體。筆者對灰樹花發(fā)酵條件及對影響灰樹花深層發(fā)酵得胞外多糖的因素進(jìn)行研究?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株灰樹花菌株GWH，購自華中農(nóng)大食用菌科研教學(xué)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 碳源對灰樹花深層發(fā)酵的影響 選擇葡萄糖、蔗糖、淀粉、馬鈴薯+葡萄糖分別作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進(jìn)行考察：葡萄糖80 g/L、蔗糖80 g/L、淀粉80 g/L、馬鈴薯180 g/L（取浸提液）+葡萄糖20 g/L。

培養(yǎng)基：碳源、豆餅粉10 g/L（降解浸提液）、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH 6.5。每種配方重復(fù)3次，結(jié)果取無顯著差異的數(shù)值的平均值。

1.2.2 氮源對灰樹花深層發(fā)酵的影響 選擇豆餅粉、蛋白胨及谷氨酸發(fā)酵廢液（用味精代替）分別作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源進(jìn)行考察：豆餅粉10 g/L（降解浸提液）、蛋白胨10 g/L、味精10 g/L。

培養(yǎng)基：氮源、馬鈴薯180 g/L（取浸提液）+葡萄糖20、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH6.5。每種配方重復(fù)3次，結(jié)果取無顯著差異的數(shù)值的平均值。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用L9（34）正交表，固定其它的因素，以篩選出的碳源、氮源以及pH作為因子，第四列為空列（表1），進(jìn)行正交試驗(yàn)（表2），以確定其最佳培養(yǎng)基配方。

表1 灰樹花深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平

其它成分：麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的驗(yàn)證 按1.2.3試驗(yàn)方法確定的最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行三批發(fā)酵試驗(yàn)，以對發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 測定方法

1.3.1 灰樹花菌絲體生物量測定 取1.3.2.1離心后沉淀物無菌水反復(fù)沖洗后，60℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.3.2 多糖的測定方法 采用苯酚-硫酸法[9]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.2.1 胞外多糖的測定 取5 mL發(fā)酵液，4000 r/min離心15 min，上清液加3倍酒精，4℃冰箱中靜置過夜完全沉淀后加去離子水適度稀釋，測定胞外多糖含量。

1.3.2.2 胞內(nèi)多糖的測定 取1.3.1的干菌絲加入30 mL去離子水在80℃溫度下蒸煮3 h后過濾，反復(fù)2次，合并2次上清液，濃縮至30 mL并冷卻至室溫，加入3倍酒精，4℃冰箱中靜置過夜完全沉淀后加去離子水適度稀釋，測定胞內(nèi)多糖含量。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按表3量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液并稀釋成相應(yīng)濃度，在490 nm波長下測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 L 9（34）正交表

表3 多糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制表

所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 灰樹花多糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2.4 樣品含量測定 吸取樣品液1.0 mL（相當(dāng)于40μg左右的多糖），按上述顯色操作，測光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.4 培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)液按10%接種量接入液態(tài)培養(yǎng)基，26℃，150 r/min，培養(yǎng)10 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)多糖及菌絲生長的影響不同碳源對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)多糖及菌絲生長影響的結(jié)果見表4。結(jié)果表明：葡萄糖和蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基胞外多糖產(chǎn)量較低，最適于灰樹花發(fā)酵產(chǎn)糖及菌絲體生長的碳源為馬鈴薯+葡萄糖；葡萄糖和馬鈴薯+葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基利于菌絲體生長，胞內(nèi)多糖含量高。但在發(fā)酵過程中，淀粉和馬鈴薯+葡萄糖中所含的多糖一部分被灰樹花菌絲體利用，另一部分被水解為其它糖類，可能會使測定結(jié)果偏高。綜合各方面的因素，采用馬鈴薯+葡萄糖作為碳源最為合適。

表4 不同碳源對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)外多糖及菌絲生長的影響

表5 不同氮源對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)外多糖及菌絲生長的影響

2.2 氮源對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)多糖及菌絲生長的影響不同氮源對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)多糖及菌絲生長影響的結(jié)果見表5。結(jié)果表明：豆餅粉、蛋白胨、味精對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖及菌絲生長的影響不大，其中豆餅粉稍有利于菌絲體的生長，而味精作氮源時(shí)胞外多糖稍高，考慮成本及原料來源，采用豆餅粉作為灰樹花深層發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)氮源。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

以胞外多糖為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 灰樹花液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析

由方差分析初步可知，影響灰樹花深層發(fā)酵得胞外多糖的因素主次順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，即碳源影響顯著，最佳組合為A3B2C2D，因B因素間差異不顯著，考慮到節(jié)約原料，因此選擇B因素最佳水平為1，所以最佳組合為A3B1C2，即最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯225 g/L、葡萄糖25 g/L、豆餅粉6 g/L、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH6.5。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的驗(yàn)證三批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表7。由表7結(jié)果可知，該培養(yǎng)基配方適合用于灰樹花的深層發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)多糖。

表7 三批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

試驗(yàn)篩選出最適于灰樹花發(fā)酵產(chǎn)多糖及菌絲體生長的碳源為馬鈴薯+葡萄糖，氮源為豆餅粉；得到最佳培養(yǎng)基配方為馬鈴薯225 g/L、葡萄糖25 g/L、豆餅粉6 g/L、麩皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L、pH6.5。