肖楠，徐黨輝，潘志堯，姚志峰

(1江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院南京衛(wèi)生分院，南京210038；2南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院；4南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

蓽茇酰胺對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞輻射敏感性的影響

肖楠1，徐黨輝2，潘志堯3，姚志峰4

(1江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院南京衛(wèi)生分院，南京210038；2南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院；4南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

目的 探討蓽茇酰胺對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞輻射敏感性的影響。方法 體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，分別加入1、2、4、8、16 μmol/L蓽茇酰胺作用24、48、72 h，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，篩選出對(duì)A549細(xì)胞毒性最低的濃度。將A549細(xì)胞分為空白對(duì)照組、蓽茇酰胺組、單純照射組以及聯(lián)合處理組，空白對(duì)照組不做處理，蓽茇酰胺組加入1 μmol/L蓽茇酰胺，單純照射組給予8 Gy X線(xiàn)照射，聯(lián)合處理組先給予1 μmol/L蓽茇酰胺作用48 h后再給予8 Gy X線(xiàn)照射。采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)察各組細(xì)胞周期及凋亡情況。結(jié)果 不同濃度蓽茇酰胺處理A549細(xì)胞24、48、72 h后，1 μmol/L蓽茇酰胺的細(xì)胞增殖抑制率均低于其他各組(P均<0.05)。聯(lián)合處理組48 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率高于單純照射組和蓽茇酰胺組(P均<0.05)。聯(lián)合處理組G0/G1期細(xì)胞比例較單純照射組增多,而S期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞凋亡率高于單純照射組(P均<0.05)。結(jié)論 1 μmol/L蓽茇酰胺能夠增加A549細(xì)胞對(duì)X射線(xiàn)的輻射敏感性，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、引起細(xì)胞G0/G1期阻滯有關(guān)。

蓽茇酰胺；肺腺癌；X射線(xiàn)；輻射敏感性；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

蓽茇酰胺是從胡椒科植物蓽茇的根中提取的酰胺類(lèi)化合物，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗焦慮、抗抑郁、抗腫瘤等多種生理及藥理活性[1～8]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞具有輻射增敏效應(yīng)[9]。2015年7～10月，我們觀(guān)察了蓽茇酰胺對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞輻射敏感性的影響，為蓽茇酰胺作為輻射增敏劑擴(kuò)大應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細(xì)胞由東南大學(xué)吳健雄重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。蓽茇酰胺用二甲基亞砜配成5 mmol/L的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，-20 ℃保存。使用時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋至設(shè)定的實(shí)驗(yàn)濃度。高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、PBS、青-鏈霉素溶液為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；二甲基亞砜、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒為南京凱基公司產(chǎn)品；余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取A549細(xì)胞加入含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)液，置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，單層貼壁生長(zhǎng)，每2～3日傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，制成5×104/mL的單細(xì)胞懸液。

1.3 蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞毒性最低濃度的確定 將A549細(xì)胞懸液接種到96孔板。培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，分別加入1、2、4、8、16 μmol/L蓽茇酰胺250 μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。于實(shí)驗(yàn)終止前4 h加入CCK8試劑10 μL，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，于450 nm波長(zhǎng)處用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度OD值。另設(shè)空白對(duì)照組，不施加任何處理因素。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值)/(空白對(duì)照組OD值)]×100%。取細(xì)胞增殖抑制率最低的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞輻射敏感性的影響觀(guān)察

1.4.1 細(xì)胞分組與處理 將A549細(xì)胞接種于6孔板(用于檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡)和96孔板(用于檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率)，分為蓽茇酰胺組、單純照射組、聯(lián)合處理組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。蓽茇酰胺組加入毒性最低濃度的蓽茇酰胺；單純照射組給予X線(xiàn)照射，輻射源為直線(xiàn)加速器產(chǎn)生的6 MV高能X線(xiàn)，源皮距100 cm，劑量率300 cGy/min，照射野20 cm×20 cm，細(xì)胞面覆蓋1.5 cm補(bǔ)償膜，常溫下照射，吸收劑量為8 Gy；聯(lián)合處理組先給予毒性最低濃度的蓽茇酰胺作用24 h后，再給予8 Gy X線(xiàn)照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。另設(shè)空白對(duì)照組，不施加任何處理因素。

1.4.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 先給予毒性最低濃度的蓽茇酰胺作用24 h后，再給予8 Gy X線(xiàn)照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，具體方法同1.3。

1.4.3 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取3組細(xì)胞分別加入0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞。取一部分細(xì)胞加入70%冰乙醇固定，4 ℃過(guò)夜，依次加入1 mg/mL核糖核酸酶10 μL、0.5 mg/mL碘化丙啶(PI)50 μL，4 ℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；另一部分細(xì)胞經(jīng)AnnexinV-FITC和PI雙染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞毒性最低濃度 不同濃度蓽茇酰胺處理A549細(xì)胞24、48、72 h后，1 μmol/L蓽茇酰胺的細(xì)胞增殖抑制率均低于其他各組(P均<0.05)，1 μmol/L蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用最弱。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率比較

注：與1 μmol/L組比較，*P<0.05。

2.2 蓽茇酰胺聯(lián)合X射線(xiàn)照射對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 空白對(duì)照組、蓽茇酰胺組、單純照射組和聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖抑制率分別為0、11.25%±1.11%、13.32%±1.52%、43.46%±2.73%，聯(lián)合處理組高于其他各組(P均<0.05)。

2.3 各組G0/G1期、S期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率比較 聯(lián)合處理組G0/G1期細(xì)胞比例較單純照射組增多，而S期細(xì)胞較單純照射組減少(P均<0.05)；聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率高于單純照射組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

研究表明，蓽茇酰胺可顯著抑制膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病細(xì)胞等多種實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的生長(zhǎng)增殖[2]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10，11]，并能干擾細(xì)胞周期進(jìn)程[11，12]，而腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性與細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞在增殖周期各時(shí)相的分布密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，蓽茇酰胺在體外能抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，且隨濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。

表2 各組細(xì)胞G0/G1期、S期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率比較±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與單純照射組比較，△P<0.05。

不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖是腫瘤的特征之一，因此不少抗腫瘤藥物作用于細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)，以此減少腫瘤細(xì)胞的分裂增殖。細(xì)胞的分裂在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。Jyothi等[11]報(bào)道，蓽茇酰胺處理過(guò)的小鼠胚胎癌細(xì)胞被阻滯在G1期。Kong等[12]發(fā)現(xiàn)，不同濃度的蓽茇酰胺作用于前列腺癌PC-3細(xì)胞后，相當(dāng)一部分細(xì)胞被阻滯于G2/M期，且PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與G2/M期阻滯相關(guān)。本研究顯示，蓽茇酰胺能使A549細(xì)胞阻滯于G0/G1期，表明蓽茇酰胺作用后的細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)，處于靜止期(G0期)的細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞周期進(jìn)程明顯減緩，最終使細(xì)胞增殖速度減慢，凋亡明顯增多，細(xì)胞凋亡前選擇性的G1期阻滯預(yù)示著DNA合成階段受阻。本研究篩選出蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞毒性最低的濃度為1 μmol/L，將其與X射線(xiàn)聯(lián)合作用后，明顯增加了細(xì)胞增殖抑制率，即在無(wú)明顯毒性作用的劑量下提高了A549細(xì)胞的輻射敏感性。蓽茇酰胺能使A549細(xì)胞阻滯于G0/G1期，同時(shí)明顯降低S期細(xì)胞比例，而G2/M期細(xì)胞沒(méi)有明顯變化，提示蓽茇酰胺可引起A549細(xì)胞周期阻滯，通過(guò)改變細(xì)胞周期時(shí)相的分布而發(fā)揮輻射增敏作用。蓽茇酰胺先作用于A(yíng)549細(xì)胞后再進(jìn)行一定劑量的X線(xiàn)照射，同樣出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯效應(yīng)，并且消除了X線(xiàn)對(duì)細(xì)胞輕度的G2/M期阻滯作用。說(shuō)明蓽茇酰胺的輻射增敏機(jī)制是通過(guò)增加凋亡最敏感的G0/G1期細(xì)胞比例，降低輻射抗拒的S期細(xì)胞，而不是增加輻射敏感的G2/M期細(xì)胞比例實(shí)現(xiàn)的。

細(xì)胞受到輻射后凋亡是其主要的死亡形式，腫瘤對(duì)放療抵抗的原因之一就是腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡產(chǎn)生了抵抗性[13]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明，蓽茇酰胺除自身能誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡外，還能增強(qiáng)輻射對(duì)肺腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，聯(lián)合處理組較單純照射組細(xì)胞凋亡率顯著增加。前文述及蓽茇酰胺使細(xì)胞周期阻滯于G1期，因處于該期的細(xì)胞受照射后未能完全修復(fù)，易發(fā)生凋亡，因此凋亡細(xì)胞比例明顯提高。一般而言，凋亡反應(yīng)的增加預(yù)示細(xì)胞對(duì)于輻射更加敏感[14，15]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率較單純照射組顯著增加，說(shuō)明蓽茇酰胺很可能增加了輻射所致的細(xì)胞凋亡。Kong等[12]研究發(fā)現(xiàn)，用蓽茇酰胺處理的前列腺癌PC-3細(xì)胞出現(xiàn)空泡化以及染色體濃集現(xiàn)象等細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)，并檢測(cè)到Caspase-3活性升高，證實(shí)蓽茇酰胺能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺未明顯改變Bax的表達(dá)，但使Bcl-2表達(dá)下降、Bax/Bcl-2比值下降，而腫瘤細(xì)胞Bax/Bcl-2的表達(dá)程度與其輻射敏感性呈正相關(guān)[16]。蓽茇酰胺是否也通過(guò)凋亡抑制蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相對(duì)表達(dá)量的改變誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而表現(xiàn)出輻射增敏效應(yīng)值得進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株的增殖有明顯抑制作用的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的增殖無(wú)影響或影響很小[2，5]。本研究顯示，蓽茇酰胺明顯抑制A549細(xì)胞增殖，而且有效抑制濃度處于微摩爾水平，劑量很小，毒性反應(yīng)可能較輕。理想的放射增敏劑應(yīng)能顯著增加腫瘤細(xì)胞的放療療效，而對(duì)正常組織沒(méi)有或很少有不良反應(yīng)，從這一點(diǎn)來(lái)看，蓽茇酰胺具備明顯優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步深入研究。

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Effect of piplartine on radio-sensitization of human pulmonary adenocarcinoma A549 cells

XIAONan1,XUDanghui,PANZhiyao,YAOZhifeng

(1NanjingHealthSchoolofJiangsuUnionTechnicalInstitute,Nanjing210038,China)

Objective To investigate the effect of piplartine on radio-sensitization of human pulmonary adenocarcinoma A549 cells.Methods A549 cells cultured in vitro were treated with 1, 2, 4, 8 and 16 μmol/L piplartine for 24, 48 and 72 h. CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibition of piplartine on A549 cells in each group and then we selected the minimum concentration which had no obvious toxic effect on A549 cells. A549 cells were divided into four groups: the control, piplartine group, radiation group and the combination treatment group. The control group was not treated. The piplartine group was given the concentration of 1 μmol/L piplartine, the radiation group was given X-ray radiation of 8 Gy alone, and the combination treatment group was given the concentration of 1 μmol/L piplartine for 48 h, then was exposed to X-ray radiation of 8 Gy. CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibition of piplartine on A549 cells in each group. Cell cycle and apoptosis of A549 cells were analyzed by flow cytometry (FCM).Results After being treated with piplartine for 24, 48 and 72 h, the proliferation inhibition rate of the piplartine group was lower than that of the other groups (allP<0.05). The proliferation inhibition in the combination treatment group was higher than that of the radiation group and the piplartine group at 48 h (allP<0.05). The percentage of cells in the G0/G1phase of the combination treatment group was significantly increased, and was decreased in the S phase, and apoptosis rate was also higher than that of the radiation group (P<0.05).Conclusion Piplartine at the concentration of 1 μmol/L can enhance the radio-sensitivity of A549 cells, which may be associated with the enhancement of radiation-induced inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis as well as cell arrest in G0/G1phase.

piplartine; pulmonary adenocarcinoma; X-ray; radio-sensitization; cell proliferation; cell cycle; apoptosis

肖楠(1984-)，男，碩士，講師，主要研究方向?yàn)樾夭坑跋裨\斷學(xué)。E-mail： 15996301027@126.com

姚志峰(1986-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤的放射治療。E-mail： yzf058565@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.004

R734.2

A

1002-266X(2017)06-0013-04

2016-08-05)