袁發(fā)榮　李先加　普措多杰

[摘要] 目的 研究藏藥十五味云鵬散含汞制劑和無(wú)汞制劑對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響。 方法 選擇90只Balb/c種雌性小鼠，按體重隨機(jī)分為空白組、模型（環(huán)磷酰胺）組、陽(yáng)性（胸腺肽腸溶片0.01 g/kg）組、十五味云鵬散含汞制劑高、中、低劑量（0.38、0.18、0.09 g/kg）組及無(wú)汞制劑高、中、低劑量（0.38、0.18、0.09 g/kg）組，每組各10只；除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，造成免疫功能低下的動(dòng)物模型。各給藥組于第4天開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，空白組和模型組灌胃給予等體積的蒸餾水。在末次給藥1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，分別測(cè)定小鼠的脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、血清溶血素水平（HC50）以及二硝基氯苯誘導(dǎo)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（DTH）發(fā)生情況。 結(jié)果 與模型組比較，十五味云鵬散含汞制劑高、中劑量組和無(wú)汞制劑高、中劑量組均能明顯提高免疫低下小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)和HC50（P < 0.05）；可改善DTH。 結(jié)論 十五味云鵬散含汞制劑和無(wú)汞制劑可以增強(qiáng)免疫低下小鼠的免疫功能。

[關(guān)鍵字] 藏藥；十五味云鵬散；汞制劑；免疫低下

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（c）-0045-04

[Abstract] Objective To study the effect of Tibetan medicine Shiwuwei Yunpeng Powder containing mercury preparations and mercury-free preparations on immune function in immunocompromised mice. Methods 90 Balb/c female mice were randomly divided into blank group， model （cyclophosphamide） group， positive （0.01 g/kg Thymopeptides Enteric-coated Tablets） group and Shiwuwei Yunpeng Powder containing mercury preparations high-dose， middle-dose and low-dose （0.38， 0.18， 0.09 g/kg） group and mercury-free preparations high-dose， middle-dose and low-dose （0.38， 0.18， 0.09 g/kg） group according to their body weights， with 10 mice in each group. In addition to the normal group， the other groups immunocompromised mice models been made by cyclophosphamide intraperitoneal injection. From the fourth day， the mice were taken drug by intragastric administration， continuing 10 days， and the mice in the blank group and the model group were taken equal volume of distilled water. The mice were sacrificed by cervical dislocation 1 hour after the last administration. The spleen index， thymus index， value of hemolysin in serum and dinitrochlorobenzene-induced delayed allergy （DTH） were determinated respectively. Results Compared with the model group， the spleen index， thymus index， HC50 levels in the Shiwuwei Yunpeng Powder containing mercury preparations high-dose， middle-dose group and mercury-free preparations high-dose， middle-dose group were increased （P < 0.05）； and the DTH were improved. Conclusion Shiwuweiyunpeng Powder containing mercury preparations and mercury-free preparations can enhance immune function in immunocompromised mice.

[Key words] Tibetan medicine； Shiwuweiyunpeng Powder； Mercury preparations； Immunocompromised

藏藥十五味云鵬散由乳香、決明子、兒茶、黃葵子、川木香、訶子、余甘子、寬筋藤、渣馴、藏菖蒲、麝香、水銀炮制品等組成[1]。用于治療關(guān)節(jié)紅腫疼痛、發(fā)癢[2-3]，臨床效果顯著[4-5]；現(xiàn)代藥理研究表明，該藥具有祛風(fēng)濕、抗炎、鎮(zhèn)痛作用[6]，但對(duì)免疫方面的作用研究尚不完善。該方在臨床應(yīng)用中有2種配方制劑——含汞制劑及無(wú)汞制劑[6]。佐太是歷代名藏醫(yī)通過(guò)對(duì)水銀進(jìn)行特殊炮制加工而得到的具有奇特療效的制劑，藏醫(yī)認(rèn)為經(jīng)過(guò)炮制后單用或配制其他藥物就能治療各種疾病。蔣婀娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)佐太具有良好的抗驚厥、解熱、抗炎、增強(qiáng)免疫力的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，比較十五味云鵬散含汞制劑和無(wú)汞制劑對(duì)機(jī)體免疫作用影響。

1 材料與方法

1.1 藥物

十五味云鵬散，規(guī)格：0.7164 g/勺，生產(chǎn)批號(hào)：20150305，由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；注射用環(huán)磷酰胺，規(guī)格：0.2 g，生產(chǎn)批號(hào)：14121825，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；胸腺肽腸溶片，規(guī)格：20 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：140403，哈高科白天鵝藥業(yè)集團(tuán)有限公司；0.9%氯化鈉注射液，規(guī)格：250 mL：2.25 g，批號(hào)：2414120807，青州堯王制藥有限公司。

1.2 試劑

2，4-二硝基氯苯，批號(hào)：2015年04月01日，上海中秦化學(xué)試劑有限公司；硫化鈉，規(guī)格：500 g/瓶，生產(chǎn)批號(hào)：060320，成都金山化學(xué)試劑有限公司；丙酮，規(guī)格：500 mL/瓶，生產(chǎn)批號(hào)：2006年04月26日，天津市化學(xué)試劑六廠；豚鼠血清，規(guī)格：100 mL/瓶，生產(chǎn)批號(hào)：150526，廣州鴻泉生物科技有限公司；20%綿羊紅細(xì)胞（SRBC），規(guī)格：100 mL/瓶，生產(chǎn)批號(hào)：20150525，平睿生物科技（北京）有限公司；羧甲基纖維素鈉，生產(chǎn)批號(hào)：20080399，常州市武進(jìn)廟橋第二化工有限公司。

1.3 動(dòng)物

90只Balb/c小鼠，SPF級(jí)，雌性，6～8周齡，重量18～22 g，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，合格證號(hào)：SCXK（甘）2010-0001；實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境。室溫：20～26℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照，排氣扇通風(fēng)，自由飲食、攝水。

1.4 儀器

電子天平，型號(hào)JD1060-2，沈陽(yáng)龍騰電子稱(chēng)量?jī)x器有限公司；7 mm打孔器；離心機(jī)，型號(hào)TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋，型號(hào)HH-4，國(guó)華電器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，型號(hào)UV-2550，日本島津。

1.5 方法

90只健康Balb/c種雌性小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為9組，分別為空白組、模型組（環(huán)磷酰胺）、陽(yáng)性組（胸腺肽腸溶片0.01 g/kg）、十五味云鵬散含汞制劑高、中、低劑量組（0.38、0.18、0.09 g/kg）及無(wú)汞制劑高、中、低劑量組（0.38、0.18、0.09 g/kg）組，每組10只。除空白組外，其他各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液50 mg/kg 1次，連續(xù)3 d，制備免疫功能低下的動(dòng)物模型，空白組注射等量的生理鹽水作對(duì)照[8]。第4天各給藥組開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，給藥前各組藥物的水溶液經(jīng)超聲器震蕩處理（37℃ 30 min），空白組和模型對(duì)照組灌胃給予等體積的蒸餾水。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 耳廓皮膚遲發(fā)性超敏反應(yīng) 各組小鼠于給藥第2天以7%硫化鈉溶液涂抹腹部進(jìn)行脫毛，涂抹腹部脫毛范圍為3 cm×3 cm，將5% DNCB丙酮溶液0.05 mL均勻涂布在脫毛區(qū)域致敏，于給藥第5天強(qiáng)化1次，在第10天末次給藥后1 h，將1% DNCB丙酮溶液0.02 mL均勻涂布于小鼠左耳進(jìn)行攻擊，使局部產(chǎn)生水腫，攻擊后24 h，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳片，用打孔器取下直徑7 mm的耳片，稱(chēng)重，以左右耳片重量之差作為腫脹度，將其作為遲發(fā)性超敏反應(yīng)（DTH）觀察指標(biāo)[8-9]。

1.6.2 血清溶血素生成水平 各組小鼠于給藥第1天腹腔注射20% SRBC懸液0.2 mL/只，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前禁食12 h。末次給藥1 h后，眼底靜脈叢取血，放置1 h，用長(zhǎng)針將凝固血與管壁剝離，使血清充分滲出，2000 r/min離心10 min，并用生理鹽水將離心后的血清按1∶500比例稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮难? mL 10%SRBC懸液0.5 mL和1 mL 10%豚鼠血清加入5 mL離心管中，輕輕顛倒混勻。離心管放置于試管架上，37℃水浴保溫10 min，取出置于冰浴中10 min終止反應(yīng)，冷卻后離心（4000 r/min，10 min），并取1 mL上清液和3 mL都氏液加入玻璃試管中，混勻后靜置10 min，隨后倒入一次性比色皿中，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定A值。另取一試管加入0.25 mL SRBC懸液和都氏液3.75 mL，測(cè)定SRBC半數(shù)溶血時(shí)的A值。樣品血清溶血素生成水平（HC50）=（樣本A值/SRBC半數(shù)溶血時(shí)A值）×血清稀釋倍數(shù)[10-13]。

1.6.3 胸腺、脾臟系數(shù) 小鼠處死后，摘取胸腺、脾臟稱(chēng)量濕重，計(jì)算胸腺、脾臟系數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較，采用最小顯著法檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠耳廓皮膚遲發(fā)性超敏反應(yīng)比較

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠耳腫脹度顯著降低（P < 0.01）。與模型組比較，十五味云鵬散含汞制劑高、中、低劑量組和無(wú)汞制劑高、中、低劑量組小鼠耳腫脹度有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.2 各組小鼠血清溶血素生成水平比較

與空白組比較，模型組小鼠HC50明顯降低（P < 0.01），與模型組比較，十五味云鵬散含汞制劑高、中劑量組和無(wú)汞制劑高、中劑量組HC50均明顯升高（P < 0.01）。

2.3各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)比較

與空白組比較，模型組小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)顯著下降（P < 0.05，P < 0.01）；與模型組比較，十五味云鵬散含汞制劑高、中劑量組和無(wú)汞制劑高、中劑量組小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)明顯升高（P < 0.05，P < 0.01）。

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種烷化類(lèi)的免疫抑制劑，可殺傷淋巴細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)，它誘導(dǎo)的免疫低下模型是研究藥物免疫活性的常用模型[9]。本試驗(yàn)通過(guò)連續(xù)3 d小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液50 mg/kg 1次，制備免疫功能低下的動(dòng)物模型，動(dòng)物處死后開(kāi)腹查驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脾臟和胸腺明顯萎縮，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HC50降低，表明小鼠非特異性免疫和體液免疫功能明顯下降，證明造模成功。

胸腺和脾臟是重要的免疫器官，成年動(dòng)物脾臟是其最大的免疫器官，內(nèi)含大量的免疫細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞約占40%，B淋巴細(xì)胞約占60%，在細(xì)胞免疫和體液免疫中的地位極其重要[14]。其質(zhì)量的變化可反應(yīng)體內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化，間接提示機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，因此，本研究選用胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)評(píng)判機(jī)體免疫功能。血清溶血素檢測(cè)法是反映體液免疫功能狀況的一種方法，溶血素主要由IgM和IgG組成，如果用藥后溶血素生成增多，則出現(xiàn)紅細(xì)胞溶血時(shí)的吸光度值增高，表明用藥后機(jī)體的體液免疫作用增強(qiáng)[15]。溶血素測(cè)定法的原理是經(jīng)SRBC免疫過(guò)的動(dòng)物，其B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生抗SRBC的抗體-溶血素。分離出致敏動(dòng)物的血清，與綿羊紅細(xì)胞一起作用，在補(bǔ)體參與下可以產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，溶血程度中釋放的血紅蛋白含量來(lái)測(cè)定[16]。由此可知，血清溶血素水平高低可以反映出機(jī)體體液免疫功能的強(qiáng)弱。DTH是細(xì)胞免疫反應(yīng)，當(dāng)致敏T淋巴細(xì)胞再次接觸相同的抗原時(shí)，能引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞釋放出多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥，表現(xiàn)為皮膚紅腫、硬結(jié)等[17]。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)小鼠DTH和血清溶血素抗體生成反應(yīng)，觀察十五味云鵬散含汞制劑和無(wú)汞制劑對(duì)免疫低下小鼠的免疫功能的作用；結(jié)果顯示，十五味云鵬散含汞制劑高、中劑量組和無(wú)汞制劑高、中劑量組可改善免疫低下小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)，小鼠耳腫脹度，提高免疫低下小鼠HC50值。結(jié)果提示，十五味云鵬散含汞制劑和無(wú)汞制劑能夠促進(jìn)機(jī)體體液免疫功能，并且能夠緩解小鼠免疫功能低下引起的胸腺和脾臟的萎縮，對(duì)免疫器官具有一定的保護(hù)作用。這可能與方劑中訶子、余甘子和寬筋藤等藥物成分有關(guān)。研究表明訶子主要含有鞣質(zhì)類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、糖類(lèi)等成分；多糖作為訶子中一類(lèi)活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[18-22]。余甘子能增加小鼠血清溶血素含量，明顯增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，改善遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，對(duì)小鼠特異性細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用；能提高NK細(xì)胞活性，增強(qiáng)小鼠非特異性細(xì)胞免疫功能[23]。寬筋藤有調(diào)節(jié)免疫和阻止環(huán)磷酰胺誘發(fā)貧血等作用，且其水提物升高小鼠白細(xì)胞的數(shù)量[24]。

研究結(jié)果表明：十五味云鵬散含汞制劑和無(wú)汞制劑對(duì)環(huán)磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下具有一定的調(diào)節(jié)改善作用，能改善小鼠DTH，增強(qiáng)小鼠血清溶血素抗體、提高小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)，提示該藥能夠增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能和特異性免疫功能。

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（收稿日期：2016-09-19 本文編輯：李岳澤）