馬林琳　畢俊波

【摘要】 目的 研究確定建立長波紫外線（UVA）照射人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HEKC）損傷模型的照射劑量。方法 選用原代培養(yǎng)的處于指數(shù)生長期的HEKC， 將采用UVA劑量為3.07、6.14、12.29、24.58 J

進行照射的設(shè)為劑量組， 對未進行UVA照射的設(shè)為對照組。細(xì)胞損傷程度采用改良四甲基偶氮唑鹽 （MTT）法進行檢測。結(jié)果 HEKC采用3.07 J UVA照射后， 細(xì)胞損傷率7.27%；HEKC采用6.14 J UVA照射后， 細(xì)胞損傷率32.73%；HEKC采用12.29 J UVA照射后， 細(xì)胞損傷率72.73%；HEKC采用24.58 J UVA照射后， 細(xì)胞損傷率95.45%；各劑量組吸光度（OD）值及損傷率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 建立UVA損傷HEKC模型最適照射劑量的IC50值為8.09 J。

【關(guān)鍵詞】 長波紫外線；人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞；模型；照射劑量

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.31.018

【Abstract】 Objective To research and determine exposure dose in ultraviolet A （UVA）-damaged human epiderm keratinocytes （HEKC） model. Methods HEKC during exponential growth phase in primary culture were taken. Dosage groups included UVA exposure by doses of 3.07， 6.14， 12.29 and 24.58 J， and control group included non-exposed cases. Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） test was applied to detect cellular damage degree. Results After 3.07 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 7.27%； After 6.14 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 32.73%； After 12.29 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 72.73%； After 24.58 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 95.45%. The differences of optical delnsity （OD） value and damage rate between each dose group and control group had statistical significance （P<0.05）. Conclusion The optimal dose in establishment of UVA-damaged HEKC model is 8.09 J in IC50.

【Key words】 Ultraviolet A； Human epiderm keratinocytes； Model； Exposure dose

人們對皮膚衰老等問題的關(guān)注度逐年提高， 而日光中紫外線是導(dǎo)致人們皮膚衰老因素中最直接的外源性因素之一。研究發(fā)現(xiàn)， 紫外線與皮膚曬傷、皮膚老化、皮膚炎癥以及皮膚癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[1]。紫外線引起的皮膚衰老通常稱為“光老化”， 人體肌膚可以出現(xiàn)不同程度的紅斑、變黑以及膠原蛋白的分解變性， 最終出現(xiàn)皮膚彈性降低、色素沉著、毛細(xì)血管擴張等。重者可致光敏性皮膚病， 如日光性皮炎（又稱曬傷）， 暴露區(qū)皮膚瘙癢、刺痛、皮膚脫屑， 還可能潰破結(jié)痂。人們迫切的希望尋找到一種有效的紫外線損傷防護產(chǎn)品。建立一個細(xì)胞損傷程度適中的UVA損傷HEKC模型， 在體外更好的模擬機體的狀況， 既是研究紫外線對人體皮膚損傷的基礎(chǔ)， 也是研究開發(fā)紫外線防護產(chǎn)品的前提。在建立該模型過程中， 如何確定一個合適的UVA輻照劑量尤為重要。本研究對幾種不同劑量UVA的影響進行比較， 擬為UVA損傷HEKC模型選擇一個恰當(dāng)?shù)腢VA輻照量。

1 材料與方法

1. 1 材料 UVA光源以及紫外輻照度計（北京師范大學(xué)光學(xué)儀器廠）。主要儀器及試劑：溫度計、Keratinocyte-SFM（GIBCO公司）、DispaseⅡ（Sigma公司）、0.05% Trypsin-EDTA（GIBCO公司）、異丁醇（上海試劑一廠）、MTT（Sigma公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS）試液（國產(chǎn)分析純試劑配制）、十二烷基硫酸鈉（廣州南方化玻公司分裝）以及原代細(xì)胞培養(yǎng)手術(shù)器械。HEKC：健康男性環(huán)切術(shù)切除的包皮組織， 原代培養(yǎng)得到HEKC。

1. 2 方法

1. 2. 1 HEKC原代培養(yǎng) 皮膚標(biāo)本經(jīng)PBS液反復(fù)沖洗后， 經(jīng)酶作用一定時間， 參照陳勇等[2-4]報道的細(xì)胞培養(yǎng)方法， 獲得HEKC。

1. 2. 2 實驗分組 UVA照射劑量分為3.07、 6.14、 12.29、24.58 J劑量組和對照組。

1. 2. 3 細(xì)胞接種及處理 HEKC以2×104個/cm2接種到15個∮35 mm培養(yǎng)皿中， 置5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)， 生長至指數(shù)生長期棄去培養(yǎng)液， 用于實驗操作。

1. 2. 4 UVA損傷 通過紫外輻照度計確定6.4 W/cm2的照射強度， 根據(jù)不同照射劑量， 確定照射時間分別為8、16、32、64 min。將照射裝置置于超凈工作臺內(nèi)， 對HEKC進行UVA損傷， 對照組超凈臺內(nèi)放置相同時間后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1. 2. 5 細(xì)胞損傷程度的測定 采用改良MTT法， 于酶標(biāo)儀雙波長下測定OD值。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各劑量組OD值及損傷率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 小結(jié)

為了使模型的建立更具有穩(wěn)定性， 同時考慮建立模型進行實驗研究的現(xiàn)實意義， 采用GWBASIC軟件計算UVA照射對細(xì)胞損傷程度的IC50值， 通過計算得到UVA照射對HEKC的IC50值為8.09 J。綜合分析認(rèn)為， 建立UVA損傷HEKC模型， 采用8.09 J的UVA輻照劑量， 細(xì)胞損傷率維持在50%左右， 細(xì)胞損傷程度可控、模型穩(wěn)定性好。既充分滿足實驗穩(wěn)定可靠的同時， 又與體內(nèi)環(huán)境相似， 利于藥物療效的研究， 其現(xiàn)實意義不容忽視。

參考文獻

[1] 馬林琳， 張玲， 羅敏， 等. UVA損傷人表皮細(xì)胞模型中載物界面的選擇. 中國實用醫(yī)藥， 2009， 4（5）：1-2.

[2] 陳勇， 戴和平， 龍志高， 等.人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與原代無血清培養(yǎng).湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2003， 28 （5）：481-484.

[3] 孫曙光， 程大勝， 王良喜， 等.表皮細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化， 山東醫(yī)藥， 2006， 46（5）：13-14.

[4] Qin F， Zan L. Culture Conditions for the Isolation and Growth of Scalper Epidermal Cells in Vitro. Chinese Journal of Zoology， 2003， 38（6）：76-79.

[收稿日期：2016-11-07]