安曼云

摘要： 杓蘭屬（Cypripedium）植物因具有較高的觀賞和藥用價值而長期被過度采集，已成為瀕危植物。利用菌根技術(shù)進(jìn)行杓蘭屬植物的保護(hù)和人工栽培，需要獲得其可培養(yǎng)的菌根真菌。該研究采用分離培養(yǎng)法和共生回接方法，研究了云南杓蘭菌根真菌菌群組成及其共生關(guān)系。結(jié)果表明：（1）從10株云南杓蘭300塊毛根組織中分離獲得126株內(nèi)生真菌，歸屬為3個菌屬，分別是膠膜菌屬（Tulasnella）73株、伏革菌屬（Corticium）36株、角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium）17株。其中，膠膜菌屬為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)量的57.94%。（2）6株供試菌株中，4株菌株可顯著縮短種子的萌發(fā)過程，6株菌株對幼苗的生長有顯著的促進(jìn)作用。（3）從中篩選獲得一株CY18高效促生真菌，對云南杓蘭種子共生萌發(fā)和幼苗共生生長有極顯著的促進(jìn)作用。該研究結(jié)果為更好地利用菌根技術(shù)進(jìn)行杓蘭屬植物資源的保護(hù)與可持續(xù)利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 云南杓蘭， 菌根真菌， 優(yōu)勢菌群， 膠膜菌屬

中圖分類號： Q948

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）06076305

Abstract： Cypripedium plants are endangered by overharvesting due to their high ornamental and medicinal value. It is necessary to obtain the culturable mycorrhizal fungi in the application of mycorrhizal technology for the protection and artificial cultivation of C. yunnanense. The composition of mycorrhizal fungi and their symbiotic relationship of C. yunnanense were studied by culturedependent and inoculate methods. The results showed that one hundred and twentysix independent fungal isolates were obtained from three hundred root tissues of C. yunnanense. The isolates were identified to three genera： Tulasnella （seventythree）， Corticium （thirtysix） and Ceratobasidium （seventeen）. Among them，Tulasnella （57.94%） were dominant genus. The mycorrhizal fungi could significantly shorten the seed germination process and promoted the seeding growth. The strain CY18 was found to be a growthpromoting fungus. Moreover， above results simultaneously could be used as a valuable candidate sources for the protection and sustainable utilization of C. plants resources by mycorrhizal technology.

Key words： Cypripedium yunnanense， mycorrhizal fungi， dominant gunes， Tulasnella

云南杓蘭（Cypripedium yunnanense）為蘭科（Orchidaceae）杓蘭屬地生型多年生植物，主要分布在滇西北高海拔的山坡上，其花色艷麗，極具觀賞和藥用價值（于永福，2004；陳麗飛等，2012）。近年來，杓蘭屬植物的野生種群數(shù)量急劇下降，已處于瀕危狀態(tài)，亟待保護(hù)（趙國英等，2013）。但是，由于杓蘭屬植物多數(shù)自花不育導(dǎo)致自然結(jié)實率較低，人工繁育過程中種子無胚乳難以萌發(fā)、幼苗生長緩慢、死亡率高等問題極大地限制了杓蘭的保育工作（楊穎婕，2016；鄭桂靈等，2013）。如何實現(xiàn)杓蘭屬植物資源的保護(hù)與再生，已成為重要而急切的課題。

菌根是自然界中一種普遍的共生現(xiàn)象，所有蘭科植物都與真菌共生形成蘭科菌根（Orchid Mycorrhizae， OM）（蓋雪鴿等，2014）。自然條件下，其種子萌發(fā)到開花結(jié)果的整個生活史對菌根真菌有絕對的依賴性（Dearnaley，2007）。蘭科植物種子僅有原胚，自身貯存的營養(yǎng)物質(zhì)有限，自然條件下萌發(fā)困難，需依靠真菌的侵染提供營養(yǎng)才能萌發(fā)（鄭超文和肖婭萍，2014）。蘭科菌根的形成是通過種子和根的侵入兩條途徑（周玉杰等，2009）。Harley等（1983）首次證實杓蘭和真菌是互利共生的關(guān)系。Huynh et al（2009）研究發(fā)現(xiàn)杓蘭的不同生長階段與不同真菌類型共生。一些蘭科植物在萌發(fā)期所需要的真菌多樣性要比成年之后的需要更高（Bidartondo & Read，2008）。臧穆等（2004）研究發(fā)現(xiàn)黃花杓蘭的根際和根皮層細(xì)胞內(nèi)具有不同階段的小型菌核。高倩等（2009）研究發(fā)現(xiàn)杓蘭屬植物菌根真菌的新近入侵、開始被消解、消解后的殘余及消解后的物質(zhì)4個階段在杓蘭的生活周期中周而復(fù)始地進(jìn)行。趙欣宇等（2014）、權(quán)嬌嬌等（2015）和繆?？〉龋?015）研究發(fā)現(xiàn)杓蘭屬植物根部存在豐富多樣的真菌類型。鄧蓮等（2012）通過培養(yǎng)基優(yōu)化及添加激素能使大花杓蘭種子獲得無菌萌發(fā)。黃家林和胡虹（2002）也通過培養(yǎng)基、激素和種子預(yù)處理后使黃花杓蘭的種子無菌萌發(fā)。杓蘭屬植物與真菌存在較強的互作規(guī)律，菌根系統(tǒng)中存在多種內(nèi)生真菌類型，其種子都能實現(xiàn)無菌萌發(fā)，但萌發(fā)進(jìn)程相當(dāng)緩慢，對于杓蘭屬植物種子和幼苗的無菌和不同真菌類型共生的效果對比方面研究的報道較少。本研究通過對云南杓蘭不同內(nèi)生真菌菌群、野外授粉、種子采集及活力檢測、種子共生萌發(fā)、幼苗共生等進(jìn)行系統(tǒng)研究，首次分析云南杓蘭種子共生萌發(fā)和無菌萌發(fā)的進(jìn)程階段，掌握野生云南杓蘭不同內(nèi)生真菌類型對種子和幼苗的共生促進(jìn)效果，旨在為深入研究杓蘭與內(nèi)生真菌的共生關(guān)系提供可利用的菌種資源，為杓蘭屬植物的保育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 采樣地概況及樣品采集

采樣地位于云南省香格里拉縣納帕村（99°37′56″ N，27°51′34″ E，海拔3 303 m）。云南杓蘭生于林緣，樣地中分布數(shù)量每100 m2為23株，為腐殖質(zhì)土壤生境。云南杓蘭毛根采集：2015年6月20日隨機(jī)選取30株，每株根分布的不同方向選取10個毛根段（3～5 cm），放入冰盒；云南杓蘭種子采集：2015年10月25日采集蒴果，經(jīng)表面滅菌后用脫脂棉將其密封在無菌的小瓶中。將樣品帶回實驗室置于4 ℃冰箱保存。

1.2 云南杓蘭菌根真菌分離與純化

采用組織塊分離方法，以馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基進(jìn)行真菌的分離與純化。PDA培養(yǎng)基的配方及制作：馬鈴薯200 g，洗凈后去皮切成小塊，開水煮30 min，紗布過濾后取濾液加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加熱至完全溶解，蒸餾水定容1 L，121 ℃滅菌20 min。

將云南杓蘭毛根段切成1 cm的小段后進(jìn)行消毒（70%酒精浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉浸泡消毒3～5 min，無菌水沖洗3～5次）。用無菌濾紙吸干水分后切成5 mm小塊，接種含有硫酸鏈霉素（50 mg·L1）的PDA培養(yǎng)基中。每皿9塊，重復(fù)3次。并對分離的真菌進(jìn)行DNA提取和ITS擴(kuò)增測序，將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析，對真菌進(jìn)行初步的分類。

分離頻率（%）=a/b×100

式中，a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數(shù)量，b為分離的真菌菌株數(shù)量。

分離率（%）=a/b×100

式中，a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數(shù)量，b為分離樣品組織塊總數(shù)。

1.3 云南杓蘭種子活性檢測

采用TTC（Triphenyl tetrazolium chloride）染色法檢測云南杓蘭種子活性，在顯微鏡下統(tǒng)計有胚種子數(shù)目和染色數(shù)目，染成紅色或淺紅色代表有活力的種子。

種子胚活力%=有活力種子數(shù)/有胚種子數(shù)×100%

1.4 云南杓蘭種子萌發(fā)試驗

無菌萌發(fā)試驗： 將云南杓蘭種子溶于無菌水中制備成懸浮液，取等量的種子懸浮液（200 μL）均勻地散布在改良過的Harvais培養(yǎng)基 （去除NH4NO3，

添加甘氨酸、谷氨酸、KT、BA激素等），3瓶一組，3次重復(fù)。以不做預(yù)處理（種子不在NaClO溶液中浸泡，培養(yǎng)基用Harvais，不加激素）做對照，3瓶。

共生萌發(fā)試驗：取等量的種子懸浮液（200 μL）均勻地散布在Harvais培養(yǎng)基上。觀察1周，去除有污染的三角瓶。從分離得到的每個菌屬中選取2株菌株作為供試菌株，共6株。6株供試菌株的菌塊（0.5 cm × 0.5 cm）分別放入三角瓶中，每種菌做3個重復(fù)，以不接菌的6瓶做對照組，培養(yǎng)觀察。

萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/（播種數(shù) × 有胚率） × 100%

1.5 云南杓蘭幼苗共生生長試驗

選取已培養(yǎng)好的云南杓蘭無菌幼苗（由云南省林業(yè)科學(xué)院組培室提供）進(jìn)行挑選并準(zhǔn)確稱量后移入到三角瓶中（采用Harvais培養(yǎng)基），每瓶6株。觀察一周后，去除有污染的瓶，分別接入6株供試菌株的菌塊（1 cm × 1 cm），每個菌株做3個瓶的重復(fù)。以不接菌的10瓶作為對照實驗。每10 d進(jìn)行生長情況觀察，60 d后進(jìn)行生物量相關(guān)數(shù)據(jù)測定。

鮮重增長率=（接種60 d后的重量-初始重量）/初始重量×100%。

全氮含量：H2SO4H2O2蒸餾法；全磷含量：H2SO4H2O2消煮鉬銻抗比色法；全鉀含量：H2SO4H2O2消煮火焰光度計法。

2結(jié)果與分析

2.1 云南杓蘭菌根真菌菌群組成分析

如表1所示，云南杓蘭的毛根中分離獲得多種真菌，共分離獲得126株，經(jīng)ITS測序結(jié)果與GenBank中比對分析，將其初步歸屬至3個菌屬。其中，分離率最高的為膠膜菌屬，共有73株、分離率最少的為角擔(dān)菌屬，共有17株。3個菌屬中膠膜菌屬為優(yōu)勢菌群，分離頻率高達(dá)57.94%。

2.2 云南杓蘭種子活力分析

云南杓蘭在野外自然授粉條件下結(jié)實率很低，僅3.33%。經(jīng)人工授粉后其結(jié)實率顯著提高，為46.67%，并收集蒴果后進(jìn)行了種子活力分析。由表2

可知，云南杓蘭種子有胚率為91.33%，發(fā)育較好，種子完全成熟。經(jīng)過TCC法檢測，云南杓蘭種子胚活力為53.66%，滿足后期種子萌發(fā)實驗要求。

2.3 云南杓蘭種子預(yù)處理和真菌共生對其萌發(fā)的影響

云南杓蘭種子在不經(jīng)任何預(yù)處理的情況下，其種皮開始慢慢皺縮，不能成功萌發(fā)。然而，在經(jīng)過種子預(yù)處理及培養(yǎng)基優(yōu)化后，促進(jìn)了種子萌發(fā)，其萌發(fā)率為18.05%。由表3可知，6株供試菌株中，能促進(jìn)云南杓蘭種子萌發(fā)的有4株，并對其促進(jìn)效果不同。其中，菌株CY18對云南杓蘭種子的萌發(fā)具有較強的共生促進(jìn)萌發(fā)效果。

為了進(jìn)一步研究菌根真菌和種子預(yù)處理兩種方法對種子萌發(fā)的促生效果，將供試菌株回接和種子預(yù)處理后萌發(fā)階段進(jìn)行了對比分析，結(jié)果見圖1?；亟泳旰罂娠@著提高種子的萌發(fā)進(jìn)程，不同菌株的共生萌發(fā)促進(jìn)效果不同。4株菌株中，CY18菌株表現(xiàn)出較強的共生萌發(fā)效果，在第10周時，種子開始出現(xiàn)葉原基，而預(yù)處理無菌的種子還處于未萌發(fā)狀態(tài)，第15周時促使第一片葉子長出。表明云南杓蘭的種子萌發(fā)對菌根真菌具有較高的依賴性。該菌株有希望成為蘭科繁殖的促進(jìn)種子萌發(fā)的真菌。

2.4 菌根真菌對云南杓蘭幼苗的促生效果分析

6株供試菌株過回接培養(yǎng)后，均能與云南杓蘭幼苗形成共生體系，且在其根內(nèi)檢測到相應(yīng)的菌株。如表1所示，6株菌株均不同程度的促進(jìn)了云南杓蘭幼苗的鮮重增長率，不同的菌株表現(xiàn)出的促生效果不同。其中，能顯著促進(jìn)幼苗生長為膠膜菌屬的2株（CY18和CY2），鮮重增長率和N、P、K含量分別顯著高于對照。3個菌屬對云南杓蘭幼苗的促生效果大小依次為膠膜菌屬>伏革菌屬>角擔(dān)菌屬。從6株供試菌株中篩選得到一株高效促生菌株CY18。

3討論

本研究采用組織塊分離法對云南杓蘭毛根中內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離，其毛根系統(tǒng)中存在豐富多樣的真菌類型，涉及3個菌屬的真菌，均與幼苗建立共生體系。目前研究已知，與蘭科植物形成共生的主要真菌類型約有10個屬（蓋雪鴿等，2014）。本研究獲得的3個菌屬在蘭科其它植物菌根中已報道，屬擔(dān)子菌亞門，菌株數(shù)量在屬水平上高于前人。膠膜菌屬是蘭科植物的常見菌群和優(yōu)勢菌群（繆?？〉龋?015），本研究也證實了膠膜菌屬在上個菌屬中分離頻率最高，推斷膠膜菌屬菌根真菌對云南杓蘭可能具有一定的寄主專一性。

蘭科植物種子的萌發(fā)必須借助于菌根真菌為其提供營養(yǎng)才能萌發(fā)。那么是否真菌在蘭科植物種子萌發(fā)時的作用能被其它物質(zhì)代替呢？相關(guān)研究表明在培養(yǎng)基中添加一些營養(yǎng)物質(zhì)可促進(jìn)種子的無菌萌發(fā)（鄧蓮等，2012；黃家林和胡虹，2001）。因此可能認(rèn)為真菌在蘭科植物的種子萌發(fā)時并不是必需的。于是前人做了大量研究工作，發(fā)現(xiàn)真菌共生萌發(fā)可顯著提高萌發(fā)率（鄧蓮2012）。菌根真菌侵染種子后，與其建立共生關(guān)系，把胚和基質(zhì)連接起來，菌絲為胚發(fā)育提供養(yǎng)分、水分等物質(zhì)（Liu et al，2010）。本研究首次發(fā)現(xiàn)不同類型的內(nèi)生真菌不但可以顯著提高云南杓蘭種子的萌發(fā)率，還可顯著縮短種子的萌發(fā)進(jìn)程，在改良的培養(yǎng)基中無菌萌發(fā)的云南杓蘭種子萌發(fā)進(jìn)程極其緩慢，需半年至一年多時間。

本研究6株供試菌株中，均能促進(jìn)和云南杓蘭幼苗形成共生體系，不同程度地促進(jìn)幼苗生長。但只有4株菌株能促進(jìn)種子萌發(fā)，說明種子萌發(fā)對菌根真菌種群有特殊選擇，而幼苗階段開始，可與多種真菌建立共生關(guān)系，表現(xiàn)出更強的適應(yīng)性。范黎（1994）研究推測，杓蘭屬植物生長的不同階段所需的真菌類型可能不一樣，而本研究證實了這一推測。在供試的6株菌根真菌中，CY18和CY2表現(xiàn)出較強的共生萌發(fā)及幼苗促生效果，且相比其它菌屬真菌，培養(yǎng)這2株膠膜菌屬的菌株時其生長速度較快，有希望成為杓蘭屬植物種子萌發(fā)和幼苗生長的高效促生菌，其促生機(jī)理仍待深入研究。

參考文獻(xiàn)：

BIDARTONDO MI， READ DJ，2008. Fungal specificity bottlenecks during orchid germination and development [J]. Mol Ecol，17（16）：3707-3716.

CHEN LF，LIU SY，JIANG PD，et al，2012. Research progress on Cypripedium Linn [J]. Hubei Agric Sci，51（9）：1733-1735. [陳麗飛，劉樹英，江鵬道，等. 杓蘭屬植物研究進(jìn)展 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，51（9）：1733-1735.]

DEARNALEY JDW， 2007. Further advances in orchid mycorrhizal research [J]. Mycorrhiza，17（6）：475-486.

DENG L，ZHANG M，WANG MM，et al，2012. Study on nonasymbiotic germination of Cypripedium macrathos seed [J]. Seed，31（6）：31-34. [鄧 蓮，張 毓，王苗苗，等，2012. 瀕危蘭科植物大花杓蘭種子非共生萌發(fā)的研究 [J]. 種子，31（6）：31-34.]

GAI XG，XING XK，GUO SX，2014. Ecological research of orchid mycorrhizae： a review [J]. Mycosystema，33（4）： 753-767. [蓋雪鴿，邢曉科，郭順星，2014. 蘭科菌根的生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展 [J]. 菌物學(xué)報，33（4）： 753-767.]

GAO Q，LI SY，HU H，2009. Structure and annual changing pattern of mycorrhizae of four Cypripedium species [J]. Guihaia，29（2）：187-191. [高倩，李樹云，胡虹，2009. 四種杓蘭的菌根結(jié)構(gòu)及其周年動態(tài) [J]. 廣西植物，29（2）： 187-191.]

HARLEY JL，SMITH SE，1983. Mycorhizal symbiosis [M]. New York： Academic Press： 1-483.

HUANG JL，HU H，2001. Seed germination requirements of Cypripedium flavum in axenic culture [J]. Acta Bot Yunnan，23（1）：105-108. [黃家林，胡虹，2001. 黃花杓蘭種子無菌葫發(fā)的培養(yǎng)條件研究 [J].云南植物研究，23（1）：105-108.]

HUYNH TT，THOMSON R，MCLEAN CB，et al，2009. Functional and genetic diversity of mycorrhizal fungi from single plants of Caladenia formosa （Orchidaceae） [J]. Ann Bot，104（4）：757-765.

LIU H L， LUO Y B， LIU H， 2010. Studies of mycorrhizal fungi of Chinese orchids and their role in orchid conservation in China—a review [J]. Bot Rev， （76）： 241-262.

MIAO FJ，JIANG H，DING YD，et al，2015. Mycorrhizal fungal diversity of 5 species of Cypripedium plants in ShangriLa County [J]. J W Chin For Sci，44（4）：58-62. [繆?？。Y宏，丁雅迪，等，2015. 香格里拉5種杓蘭屬植物菌根真菌的多樣性分析 [J]. 西部林業(yè)科學(xué)，44（4）：58-62.]

QUAN JJ，YANG B，LI J，et al，2015. Composition of mycorrhizal fungi communities for Cypripedium flavum [J]. J S Agric，46（12）：2163-2167. [權(quán)嬌嬌，楊斌，李潔，等， 2015. 黃花杓蘭菌根真菌菌群組成分析 [J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，46（12）：2163-2167.]

YANG YJ，2016. The study of reproductive biology and ecological adaptation of Cypripedioideae plant in China [J]. Manage Res Sci & Technol Achiev，（9）：77-78. [楊穎婕，2016. 中國杓蘭亞科植物的生態(tài)適應(yīng)及繁殖生物學(xué)研究 [J]. 科技成果管理與研究，（9）：77-78.]

YU YF，2004. The orchids in China [J]. For Humank，（5）： 26-27. [于永福，2004. 中國蘭花狀況調(diào)查 [J]. 森林與人類，（5）：26-27.]

ZANG M，WANG RL，HU H，2004. Bulbils exist in root of Cypripedium flavum [J]. Acta Bot Yunnan， 26（5）： 495-496. [臧穆，王瑞苓，胡虹，2004. 黃花杓蘭根內(nèi)的小型菌核 [J]. 云南植物研究，26（5）：495-496.]

ZHAO GY，XU BP，DONG R，2013. Research status of Cypripedium plants [J]. N Hortic，（8）：185-188. [趙國英，徐寶萍，董然，2013. 杓蘭屬植物研究現(xiàn)狀 [J]. 北方園藝，（8）：185-188.]

ZHAO XY，MIAO FJ，LI L，et al，2014. Mycorrhizal fungus rDNA ITS and specificity of Cypripedium yunnanens and Cypripedium guttatum [J]. J W Chin For Sci，43（3）：57-61. [趙欣宇，繆福俊，李璐，等，2014. 云南杓蘭和紫點杓蘭菌根真菌rDNAITS序列及共生專一性分析 [J]. 西部林業(yè)科學(xué)，43（3）：57-61.]

ZHENG CW，XIAO YP，2014. Summarization of research methods of Orchid mycorrhizal fungal [J]. J Microbiol，34（4）：85-89. [鄭超文，肖婭萍，2014. 蘭科菌根真菌研究方法的概述 [J]. 微生物學(xué)雜質(zhì)，34（4）：85-89.]

ZHENG GL，LI P，TAI YD，et al，2010. Flowering and fruit set dynamics in Cypripedium [J]. Acta Ecol Sin，30（12）：3182-3187. [鄭桂靈，李鵬，臺永東，等，2010. 杓蘭屬植物的開花和結(jié)實動態(tài) [J]. 生態(tài)學(xué)報，30（12）：3182-3187.]

ZHOU YJ，SONG XQ，ZHU GP，et al，2009. Research of prospect for nutrition of orchid mycorrhizae [J]. Chin J Trop Agric，29（2）：83-87. [周玉杰，宋希強，朱國鵬，等，2009. 蘭科植物菌根營養(yǎng)研究與展望 [J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，29（2）：83-87.]