付鵬躍 劉德江 申健 呂明醫(yī) 梁雪瑩 董實偉 程海濤

摘要[目的]篩選軟棗獼猴桃原生質(zhì)體最佳酶解液配方。[方法]以4種配方酶解液在相同條件下處理等量軟棗獼猴桃葉片，比較最后收集的純化原生質(zhì)體量，篩選最佳酶解液配方。[結(jié)果]配方Ⅲ（1.0%纖維素酶、0.5%離析酶、0.3%果膠酶）和Ⅳ（1.0%纖維素酶、05%果膠酶）處理酶解效果要明顯優(yōu)于配方 Ⅰ（2.0%纖維素酶、05%離析酶）、Ⅱ（2.0%纖維素酶、0.3%果膠酶）。[結(jié)論]配方Ⅲ（1.0%纖維素酶、05%離析酶、0.3%果膠酶）為軟棗獼猴桃原生質(zhì)體最佳酶解液配方。

關(guān)鍵詞軟棗獼猴桃；原生質(zhì)體；酶解；配方篩選

中圖分類號S603.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0133-02

Screening of Enzymatic Hydrolysate Formula of Actinidia arguta Protoplast

FU Pengyue，LIU Dejiang，SHEN Jian，CHENG Haitao* et al

（College of Life Sciences， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective]To screen the best enzymatic hydrolysate formula of Actinidia arguta protoplast. [Method]The leaves of A. arguta were treated with four enzymatic hydrolysate formula under the same conditions. The purified protoplast was collected and compared to screen the optimal enzymatic hydrolysate formula. [Result] The amount of protoplast collected by the solution of formula Ⅲ （1.0% cellulase， 0.5% segregation enzyme and 0.3% pectinase） and formula Ⅳ（1.0% cellulase，0.5% pectinase）were significantly higher than the solution of formulaⅠ（2.0% cellulase， 05% segregation enzyme） and formula Ⅱ（2.0% cellulase， 0.3% pectinase）.[Conclusion]Formula Ⅲ（1.0% cellulase， 0.5% segregation enzyme and 0.3% pectinase） is the best enzymatic hydrolysate formula for A. arguta protoplast.

Key wordsActinidia arguta；Protoplast；Enzymatic hydrolysis；Formula screening

基金項目黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新項目（201610222104）。

作者簡介付鵬躍（1993—），男，黑龍江肇源人，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，副教授，碩士，從事植物資源學(xué)與生態(tài)學(xué)研究。

收稿日期2016-12-28

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉木質(zhì)藤本植物，俗名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，是獼猴桃屬中在我國分布較為廣泛的野生果樹之一[1]，其主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、山東、河南、安徽、浙江、云南等省（區(qū)）以及朝鮮、日本等國家，多生長在山坡灌木林中、溝邊、山頂雜木林中、山坡雜木林中。

我國對獼猴桃野生資源開展系統(tǒng)馴化和栽培有近50年的歷史[2]。從20世紀(jì)60年代初開始進(jìn)行軟棗獼猴桃的選育，已選育出一批性狀優(yōu)良的品種，如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所選育的品種‘魁綠和‘豐綠，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所選育的全紅型品種‘天源紅，四川省自然資源科學(xué)研究院選育的‘寶貝星等[3-7]。相較于美味獼猴桃和中華獼猴桃品種，軟棗獼猴桃品種較少，無法滿足產(chǎn)業(yè)對品種多樣化的需求。加強(qiáng)軟棗獼猴桃新品種的研究，選育優(yōu)良品種，對促進(jìn)我國軟棗獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義[8]。

原生質(zhì)體（Protoplast）指通過質(zhì)壁分離，能夠和細(xì)胞壁分開的那部分細(xì)胞物質(zhì)[9]。目前原生質(zhì)體培養(yǎng)已經(jīng)在中華獼猴桃、美味獼猴桃以及毛花獼猴桃3個種中獲得成功，但對軟棗獼猴桃原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究少見報道[10]。該研究以4種配方的酶解液處理軟棗獼猴桃葉片，進(jìn)行原生質(zhì)體的酶解，旨在篩選出效果最為理想的酶解液配方。

1材料與方法

1.1材料

材料為軟棗獼猴桃瓶裝無菌苗葉片。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器。

JD500-3A分析天平（上海力衡儀器儀表有限公司）；筆式pH計（杭州盈傲儀器有限公司）；TD4臺式低速離心機(jī)（上海本昂科學(xué)儀器有限公司）。

1.2.2試劑。

纖維素酶（Cellulase Onozuke R-10，北京明陽科華生物科技有限公司）；離析酶（Macerozyme R-10，上海偉進(jìn)生物科技有限公司）；果膠酶（Pectolyas Y-23，常州市海拓實驗儀器有限公司）；甘露醇。

1.3方法

1.3.1CPW培養(yǎng)基配制。

按照文獻(xiàn)[11]方法配制CPW培養(yǎng)基，具體配方如下：30 mg/L KH2PO4、100 mg/L KNO3、1 320 mg/L CaCl2·2H2O、250 mg/L MgSO4·7H2O。配制50 mL CPW培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為5.6～5.8，高溫滅菌后放入冰箱中保存待用。

1.3.2酶解液的制備。

試驗共設(shè)4種酶解液配方，具體配方見表1。取4個10 mL燒杯，在每個燒杯中倒入6 mL CPW培養(yǎng)基，再放入0.728 6 g甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，調(diào)節(jié)pH至5.6，按照各組比例將纖維素酶、離析酶、果膠酶分別放入燒杯中，用CPW培養(yǎng)基定容到10 mL后充分搖勻，分裝到4個錐形瓶中進(jìn)行標(biāo)記。此次試驗葉片與酶解液質(zhì)量比為1〖DK〗∶20。

1.3.3酶解試驗。

配制完酶解液后用分析天平稱量4份05 g葉片，將葉片剪碎到0.25 cm2左右，分別放入各組酶解液中充分搖勻，使每個碎片都浸沒在酶解液中。將錐形瓶放入低速搖床中進(jìn)行黑暗處理，25 ℃，4～8 h。分別于1、4、8 h觀察記錄葉片樣品外觀與酶解液的變化情況。

1.3.4原生質(zhì)體收集與稱重。

將錐形瓶中的葉片通過300目鋼篩進(jìn)行過濾，收集到的濾液分裝入10 mL離心管中離心（300～500 r/min）5 min。離心后棄上清液，加入6 mL CPW培養(yǎng)基，再次離心（300～500 r/min）5 min。棄上清液后，將經(jīng)過離心純化的各組原生質(zhì)體稱重。

2結(jié)果與分析

2.1酶解1 h后觀察結(jié)果

由表2可知，處理1 h后，與配方 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶解情況相比，配方Ⅳ無明顯變化，配方Ⅲ與Ⅳ中可以清楚看到已經(jīng)有部分葉片酶解出現(xiàn)了原生質(zhì)體。配方 Ⅰ、Ⅱ 中的葉片無明顯改變，配方Ⅲ與Ⅳ中葉片已經(jīng)有質(zhì)壁分離的趨勢，葉片顏色開始變淺（圖1）。

錐形瓶中葉片顏色變淺，葉片變軟，葉片邊緣出現(xiàn)毛邊，酶解液較為清澈。配方Ⅲ與Ⅳ錐形瓶中葉片顏色變淺，葉片變軟，頂部有透明白膜，葉片有分離的趨勢，酶解液較為渾濁（表2）。

2.3酶解8 h后觀察結(jié)果

處理8 h后4種酶解液中葉片酶解情況見圖2。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，配方 Ⅰ、Ⅱ 錐形瓶中葉片仍比較完整，具備一定形狀，葉片頂部出現(xiàn)白膜，輕輕晃動白膜仍未脫離，葉片邊緣有比較明顯的毛邊，酶解液比較渾濁，總體上來說酶解效果不理想（表2）。配方Ⅲ錐形瓶中葉片已無固定形狀，酶解液變?yōu)樯罹G色，肉眼可見大量綠色沉淀。配方Ⅳ錐形瓶中葉片也已經(jīng)為游離態(tài)，但仍可見葉片碎片。

3結(jié)論

獼猴桃果富含豐富的VC、礦物質(zhì)和花青苷等營養(yǎng)物質(zhì)[12]，其主要營養(yǎng)成分位居水果的前列，且綜合經(jīng)濟(jì)效益通常比一般水果高出3倍以上[13]。由于獼猴桃是新興果樹，對其遺傳育種的研究時間不長，對軟棗獼猴桃的研究更是有限，對原生質(zhì)體分離工藝的篩選是對其進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。該試驗以4種不同的酶解液配方篩選分離原生質(zhì)體，試驗結(jié)果表明，配方Ⅲ（1.0%纖維素酶、0.5%離析酶、0.3%果膠酶）和Ⅳ（1.0%纖維素酶、0.5%果膠酶）酶解效果要明顯優(yōu)于配方 Ⅰ （2.0%纖維素酶、0.5%離析酶）、Ⅱ （2.0%纖維素酶、0.3%果膠酶），但配方Ⅳ破碎較多。在供試酶解液中配方Ⅲ原生質(zhì)體產(chǎn)量最多，破碎最少，所以配方Ⅲ應(yīng)為軟棗獼猴桃原生質(zhì)體最佳酶解液配方。

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