程雙妮 葉迦寧 金東寧 桂雪琴 張彥潔 劉旦梅

摘要[目的]研究硫化氫（H2S）在番茄耐受鎘脅迫中的作用。[方法]采用5.0 mmol/L的鎘溶液配合H2S和H2S生成抑制劑來處理番茄幼苗，研究H2S在番茄幼苗耐受鎘脅迫的過程中對MDA、植物螯合肽編碼基因、金屬轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因以及H2S生成基因表達(dá)的影響。[結(jié)果]鎘脅迫促進(jìn)番茄幼苗根尖細(xì)胞的死亡，鎘濃度越高，其對番茄幼苗的氧化損傷越大；外源施加H2S會減輕鎘脅迫所產(chǎn)生的氧化脅迫；同鎘處理組相比，在同時施加H2S的處理組中，植物螯合肽編碼基因、金屬轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因以及H2S生成基因的表達(dá)上調(diào)。 [結(jié)論] H2S可能通過提高植物螯合肽、金屬轉(zhuǎn)運蛋白以及H2S生成酶的表達(dá)來減輕重金屬對番茄幼苗的損害。

關(guān)鍵詞硫化氫；番茄；鎘脅迫

中圖分類號S601文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0140-04

Abstract[Objective] To study the function of hydrogen sulfide（H2S） in tomato under cadmium stress.[Method] We treated the tomato seedlings with cadmium solution （ 5.0 mmol/L） ， H2S and H2S generated inhibitors， then detected the content of MDA， as well as the expression levels of genes encoding andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S. [Result] Cadmium promoted the death of cells in root tips of tomato seedlings， the degree of damage improved as the concentration of cadmium increased. The oxidative stress was alleviated when H2S was applied. The expression of genes encoding andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S was upregulated when H2S was added to the treatments. [Conclusion] H2S can enhance the cadmium resistance of tomato seedlings by promoting the expression of andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S.

Key wordsHydrogen sulfide；Tomato；Cadmium stress

基金項目國家自然科學(xué)基金青年基金項目（31501772）。

作者簡介

程雙妮（1985—），女，山西晉城人，本科生，專業(yè)：生物工程。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物分子生物學(xué)研究。

收稿日期2017-01-03

在生物體和細(xì)胞內(nèi)存在著復(fù)雜多樣的信號途徑，在這些信號途徑中，用來在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)傳遞信息的化學(xué)分子稱為信號分子。而在這些信號分子當(dāng)中，氣體信號分子在動植物正常生理和抵御逆境反應(yīng)中起著非常重要的作用，并且由于其具有可連續(xù)發(fā)生、迅速傳播以及快速彌散等特點而受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注[1]。硫化氫（H2S）是近年來發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子，雖然其研究起步較晚，但發(fā)展迅速[2]。人們發(fā)現(xiàn)在植物生長發(fā)育中，H2S能夠促進(jìn)種子的萌發(fā)和不定根的生成[3-4]；提高光合效率，促進(jìn)植物的生長發(fā)育[5]；還可以延長切花的觀賞期[6]。而在抵御非生物脅迫方面，H2S可以幫助植物抵抗干旱脅迫；增強植物對熱脅迫的耐受性[7-9] ?，F(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，在給人類帶來大量便利的同時，也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染。這其中，重金屬污染是危害較大的一類。在眾多重金屬當(dāng)中，鎘（Cd）是土壤污染中具有較大毒性的一類。當(dāng)植物生長在鎘污染的土壤中時，其生長發(fā)育會受到很大影響[10]。為應(yīng)對重金屬脅迫，植物在進(jìn)化過程中已經(jīng)馴化出一套靈敏且復(fù)雜的處理機制，這其中包括：①通過金屬轉(zhuǎn)運蛋白來控制重金屬的轉(zhuǎn)入和外排[11]；②通過金屬硫蛋白和植物螯合肽的絡(luò)合作用來減輕重金屬的毒性[11-13]；③通過激活氧化還原系統(tǒng)來減輕重金屬脅迫帶來的氧化損傷[14-15]。已有研究表明，在植物遭遇重金屬脅迫的同時對植物外源施加H2S可減輕重金屬對植物的損傷[16]，但此類研究在番茄中鮮有報道。筆者通過H2S和Cd配合處理番茄幼苗，觀察幼苗的氧化損傷并檢測幼苗中H2S生成酶編碼基因、金屬轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因以及植物螯合肽和金屬硫蛋白編碼基因的表達(dá)水平，探討了H2S在番茄耐受鎘脅迫過程中的作用。

1材料與方法

1.1材料

野生型番茄（Ailsa Criag）由番茄遺傳資源中心（加州大學(xué)戴維斯分校）提供，選用發(fā)芽后培養(yǎng)5 d的番茄幼苗作為試驗材料。番茄種子消毒過程如下：取適量種子置于20 mL離心管中，用1.5 mL 95%的乙醇洗2 min后倒去乙醇；加入1.5 mL 20%次氯酸鈉溶液（有效氯含量8%），搖床搖20 min；用無菌水清洗種子4～6次，每次清洗5 min；將消毒后的種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿里，然后置于培養(yǎng)間發(fā)芽。

1.2方法

1.2.1

脅迫處理。番茄種子消毒洗滌之后置于濕潤濾紙上發(fā)芽，待種子發(fā)芽后，轉(zhuǎn)移至含有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中生長5 d，挑選長勢一致的幼苗進(jìn)行處理，用10 mL處理液（20 mmol/L CdCl2、100 μmol/L HT、1 mol/L NaHS，以及它們的稀釋液或組合液）替換培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。其中H2S處理采用熏蒸法，即將NaHS母液至于小蓋子中并將該蓋子至于培養(yǎng)皿中完成H2S處理。所有處理進(jìn)行24 h后取樣，分析數(shù)據(jù)。

1.2.2

MDA含量的測定。MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定。取0.15 g不同處理后的谷子幼苗，加入1.5 mL 5% TCA，研磨成漿，3 000 r/m離心5 min；取1 mL上清液，加1 mL 0.67% TBA沸水煮30 min，冷卻；取1 mL上清液，分別在波長450、532和600 nm 處測上清液的吸光值并計算 MDA濃度。MDA含量（μmol/g）=MDA濃度（μmol/L）×提取液體積（L）/植物組織鮮重（g）。

1.2.3

內(nèi)源H2S產(chǎn)率的測定。稱取組織材料約0.2 g，按1〖DK〗∶10的比例加入提取液（0.05 mol/L PBS），充分研磨得到勻漿，4 ℃13 000 r/min離心10 min，取上清，用考馬斯亮藍(lán)法測定上清蛋白量；將L-Cys，Tris-HCl和DTT混合溶液置于小三角瓶中，放入加有500 μL的1%ZnAC的去蓋EP管，將蛋白粗提液加入反應(yīng)液中；空白對照用提取樣液代替樣品勻漿，其余條件不變，置于37 ℃搖床120 r/min反應(yīng)15 min；將小三角瓶中的EP管拿出，分別在離心管中先后加入20 mmol/L DPD和30 mmol/L FeCl3各100 μL，顛倒混勻，置于室溫暗處反應(yīng)15 min；吸光度測定：在670 nm處測定吸光值，依據(jù)H2S產(chǎn)率標(biāo)準(zhǔn)曲線得到H2S濃度。H2S產(chǎn)率[nmol/（mg·min）]=H2S產(chǎn)生濃度（nmol/L）×0.7 L/[1.5 min×蛋白含量（mg）]。

1.2.4RNA提取和Real-time PCR。

取各處理中的番茄幼苗，利用RNAiso Plus試劑（TaKaRa）提取RNA，具體提取步驟按照試劑的使用說明。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Oligo（dT）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以番茄ACTIN基因作為內(nèi)參，分析各處理中相關(guān)基因的表達(dá)變化。用于Real-time PCR的引物見表1。每個試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理參見文獻(xiàn)[17]。

2結(jié)果與分析

2.1鎘脅迫對番茄幼苗的損傷分析

為研究鎘脅迫對番茄幼苗的影響，利用不同濃度的鎘來對番茄幼苗進(jìn)行處理，并利用伊文思藍(lán)染色來觀察根尖細(xì)胞的死亡情況。結(jié)果表明，鎘會導(dǎo)致番茄根尖細(xì)胞的死亡，并且隨著鎘濃度的升高，伊文思藍(lán)染色越來越重（圖1），說明死亡細(xì)胞的數(shù)目越來越多。同時對不同濃度處理的MDA含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明隨著鎘濃度的增加，各處理番茄幼苗的氧化損傷也逐漸加大（圖2）。鎘濃度為5.0 mmol/L時毒害作用已經(jīng)很明顯，故后續(xù)試驗鎘濃度選擇5.0 mmol/L。

2.2H2S參與番茄幼苗對鎘脅迫的應(yīng)答

為研究H2S在番茄幼苗耐受鎘脅迫中的作用，對不同濃度鎘處理下番茄幼苗中的H2S產(chǎn)率進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鎘濃度的升高，H2S產(chǎn)率也逐漸增高，說明當(dāng)番茄幼苗面臨鎘脅迫時，H2S的生成被激發(fā)，暗示H2S參與番茄幼苗應(yīng)答鎘脅迫的過程（圖3）。

2.3H2S緩解鎘脅迫對番茄幼苗的損傷

上一步的結(jié)果表明H2S可能在番茄耐受鎘脅迫過程中具有重要作用，為進(jìn)一步證實此結(jié)論，利用外源H2S及其合成抑制劑HA同鎘一起處理番茄幼苗，并對番茄幼苗的氧化損傷程度進(jìn)行了分析，結(jié)果表明H2S處理可顯著減輕番茄幼苗的氧化損傷程度，說明H2S可緩解鎘脅迫對番茄幼苗的損傷，但是鎘和H2S合成抑制劑HA一同處理時，幼苗的氧化損傷程度并沒有增加，這可能是因為HA只抑制了H2S的合成，但番茄幼苗體內(nèi)原來存在的H2S還是在一定程度上起到了保護作用（圖4）。

2.4H2S緩解鎘脅迫的機理分析

為進(jìn)一步解析H2S緩解鎘脅迫的分子機理，進(jìn)一步對各處理中的植物螯合肽、金屬硫蛋白、金屬轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白以及H2S生成酶編碼基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：①鎘處理后，植物螯合肽蛋白編碼基因〖STBX〗SlPCS1的表達(dá)量明顯下調(diào)，而當(dāng)用H2S處理以后，〖STBX〗SlPCS1的表達(dá)量得以恢復(fù)并上調(diào)表達(dá)（圖5）；②鎘處理之后，金屬轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因〖STBX〗CEA、ZIP3和ZIP12的表達(dá)量不變或輕微上調(diào)，H2S處理以后，這些基因的表達(dá)量上調(diào)明顯，但配合HA一起處理時，這些基因皆下調(diào)表達(dá)（圖6）；③同金屬轉(zhuǎn)運蛋白一樣，鎘處理之后，番茄中的H2S生成酶編碼基因輕微上調(diào)，但加入H2S后，這些基因的表達(dá)量上調(diào)明顯，加入HA之后，這些基因的表達(dá)被顯著抑制（圖7）。上述結(jié)果表明，H2S可能通過調(diào)節(jié)番茄幼苗體內(nèi)植物螯合肽、金屬轉(zhuǎn)運蛋白以及H2S生成酶的含量來幫助番茄幼苗抵御鎘脅迫。

3結(jié)果與討論

目前，重金屬污染已經(jīng)成為污染耕地，影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要因素，研究植物耐受重金屬脅迫的分子機理在生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用價值。番茄作為一種具有經(jīng)濟價值的模式雙子葉植物和茄科植物，有著遺傳背景清晰、遺傳轉(zhuǎn)化容易的特點，并且其基因組已被測序，所以在番茄中研究重金屬耐受機制，將為人們帶來更多的分子水平的信息，并且這些工作也為番茄育種奠定了基礎(chǔ)。

在該研究中，發(fā)現(xiàn)H2S在番茄耐受鎘脅迫的過程中具有減輕其損傷的作用，其作用機制可能是通過提高金屬螯合肽和金屬轉(zhuǎn)運蛋白的含量，加速鎘在植物體內(nèi)的螯合和轉(zhuǎn)運速率，因而減輕重金屬對植物的毒害作用力。同時在H2S的生成過程中，可能存在一個正向反饋機制，即外源施加H2S會導(dǎo)致內(nèi)源H2S的合成增多，進(jìn)而加快H2S的解毒過程。

參考文獻(xiàn)

[1] WANG R.Gasotransmitters：Growing pains and joys[J].Trends Biochem Sci，2014，39（5）：227-232.

[2] WANG R.Physiological implications of hydrogen sulfide：A whiff exploration that blossomed[J].Physiol Rev，2012，92（2）：791-896.

〖LL〗[3] ZHANG H，DOU W，JIANG C X，et al.Hydrogen sulfide stimulates βamylase activity during early stages of wheat grain germination[J].Plant Signal Behav，2010，5（8）：1031-1033.

[4] ZHANG H，TANG J，LIU X P，et al.Hydrogen sulfide promotes root organogenesis in Ipomoea batatas，Salix matsudana and Glycine max[J].J Integr Plant Biol，2009，51（12）：1086-1094.

[5] CHEN J，WU F H，WANG W H，et al.Hydrogen sulphide enhances photosynthesis through promoting chloroplast biogenesis，photosynthetic enzyme expression，and thiol redox modification in Spinacia oleracea seedlings[J].J Exp Bot，2011，62（13）：4481-4493.

[6] HU L Y，HU S L，WU J，et al.Hydrogen sulfide prolongs postharvest shelf life of strawberry and plays an antioxidative role in fruits[J].J Agric Food Chem，2012，60（35）：8684-8693.

〖HJ*5〗[7] SHEN J J，XING T J，YUAN H H，et al.Hydrogen sulfide improves drought tolerance in Arabidopsis thaliana by microRNA expressions[J].PLoS One，2013，8（10）：77047.

[8] JIN Z P，SHEN J J，QIAO Z J，et al.Hydrogen sulfide improves drought resistance in Arabidopsis thaliana[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，414（3）：481-486.

[9] LI Z G，GONG M，XIE H，et al.Hydrogen sulfide donor sodium hydrosulfideinduced heat tolerance in tobacco（Nicotiana tabacum L）suspension cultured cells and involvement of Ca2+ and calmodulin[J].Plant Sci，2012，185/186：185-189.

[10] RODRGUEZSERRANO M，ROMEROPUERTAS M C，PAZMIO D M，et al.Cellular response of pea plants to cadmium toxicity：Cross talk between reactive oxygen species，nitric oxide，and calcium[J].Plant Physiol，2009，150（1）：229-243.

[11] HALL J L.Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance[J].J Exp Bot，2002，53（366）：1-11.

[12] COBBETT C，GOLDSBROUGH P.Phytochelatins and metallothioneins：Roles in heavy metal detoxification and homeostasis[J].Annu Rev Plant Biol，2002，53（1）：159-182.

[13] SETH C S，REMANS T，KEUNEN E，et al.Phytoextraction of toxic metals：A central role for glutathione[J].Plant，Cell & Environ，2012，35（2）：334-346.

[14] GIANNOPOLITIS C N，RIES S K.Superoxide dismutases：I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol，1977，59（2）：309-314.

[15] PAN L L，LIU X H，SHEN Y Q，et al.Inhibition of NADPH oxidase 4related signaling by sodium hydrosulfide attenuates myocardial fibrotic response[J].Int J Cardiol，2013，168（4）：3770-3778.

[16] LI L，WANG Y Q，SHEN W B.Roles of hydrogen sulfide and nitric oxide in the alleviation of cadmiuminduced oxidative damage in alfalfa seedling roots[J].Biometals，2012，25（3）：617-631.

[17] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.