陳奕鵬 楊揚(yáng) 時(shí)濤 蔡吉苗 黃貴修

摘 要 HND5是從健康的臂形草葉片中分離得到的一株頂孢霉屬（Acremonium sp.）內(nèi)生真菌，可通過產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制病原菌生長。采用頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPME）提取富集了內(nèi)生真菌HND5的揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs），利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進(jìn)行了揮發(fā)性物質(zhì)的組分分析，共分離鑒定得到14個(gè)單體化合物?；钚苑治霭l(fā)現(xiàn)，石竹烯（Caryophyllene）和4-乙烯基-1，2-二甲氧基苯（Benzene，4-ethenyl-1，2-dimethoxy-）具有抑菌活性，對(duì)峙試驗(yàn)表明2種物質(zhì)均對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）具良好的抑制作用，其中石竹烯的有效中濃度（EC50）分別為2 916.07、729.54和404.23 μL/L，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯的有效中濃度（EC50）分別為62.72、27.60和23.54 μL/L。

關(guān)鍵詞 內(nèi)生真菌；揮發(fā)性有機(jī)物；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；抑菌作用

中圖分類號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Endophytic fungi HND5 which was isolated from healthy leaves of Brachiaria sp. could inhibit many plant pathogens with volatile substances. In this article，solid phase micro-extraction（SPME）was used to collect volatile organic compounds（VOCs）produced by HND5 from the head space. And GC-MS was used to analyzed the volatile compounds of HND5. At last， 14 compounds were identified from VOCs produced by HND5. Within these compounds， Caryophyllene and Benzene， 4-ethenyl-1，2-dimethoxy- were found antagonistic against growth of Fusarium oxysporum， Colletotrichum gloeosporioides and Corynespora cassiicola. EC50 values of Caryophyllene were 2 916.07， 729.54 and 404.23 μL/L， respectively. And EC50 values of Benzene， 4-ethenyl-1，2-dimethoxy were 62.72， 27.60 and 23.54 μL/L， respectively.

Key words endophyte； volatile organic compounds； GC-MS； fungistasis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.016

使用化學(xué)藥劑是控制農(nóng)作物病害的有效方法，但化學(xué)殺菌劑污染環(huán)境，誘導(dǎo)病菌抗性增強(qiáng)，破壞生態(tài)平衡及化學(xué)殘留問題亦令人擔(dān)憂，因此植物病害的生物防治研究越來越受到人們的重視。植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙，并在植物組織內(nèi)不引起明顯組織變化的真菌[1]。研究表明內(nèi)生菌可與宿主的長期共處，二者可形成互利的共生關(guān)系[2]。部分內(nèi)生真菌可以在植物體內(nèi)產(chǎn)生多種生物學(xué)反應(yīng)，可以提供植物生長所需化學(xué)物質(zhì)及激素[3]，參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)[4]，促進(jìn)植物快速增長[5]，增強(qiáng)植物抗逆、抗病害、抗蟲害的能力[6]。近年來，利用有益內(nèi)生真菌進(jìn)行植物病害的防治已成為研究熱點(diǎn)，內(nèi)生菌可以通過產(chǎn)生抗生素或其他次級(jí)代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)或增加宿主防御機(jī)制或者直接抑制甚至殺死病原菌[7-8]。HND5是本實(shí)驗(yàn)室從珊狀臂形草中分離獲得的一株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，該菌屬枝頂孢屬（Acremoniu sp.）真菌[9]，體外抗性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)多種重要病原真菌具有明顯的抑菌活性，并能誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生耐鹽堿性[10]。且研究發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）對(duì)多種重要病原真菌同樣具有抑制作用[11]，但關(guān)于VOCs種類及其具體活性物質(zhì)等方面未見相關(guān)研究報(bào)道。

本研究采用頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPME）萃取了HND5產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進(jìn)行了其揮發(fā)性物質(zhì)的組分分析，并以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）3種常見的植物病原真菌為靶標(biāo)菌，測(cè)定了石竹烯和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯2種單體化合物對(duì)這3種病原菌菌絲生長的熏蒸抑制作用，為今后HND5應(yīng)用于植物病害的生物防治以及相關(guān)農(nóng)藥制品的研發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生真菌HND5及植物病原真菌香蕉尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）Foc4、節(jié)瓜膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）T43和橡膠樹多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）CC01均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 菌株培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），配方參照方中達(dá)的方法[12]。石竹烯（98.5%）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（工業(yè)純）購自Sigma-Aldrich公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 氣相色譜Agilent 7890A、質(zhì)譜Agilent 5975均為Agilent（Palo Alto，CA）公司產(chǎn)品；SPME探頭（100 umol/L，PDMS）均購自Supelco（Bellefonte，PA）；石竹烯（98.5%）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（工業(yè)純）均購自Sigma-Aldrich（Vienna，Austria）。

1.1 方法

1.2.1 揮發(fā)性有機(jī)物的吸附和解吸 揮發(fā)性有機(jī)物的吸附和解吸參照張冬靜[13]的方法，并加以改進(jìn)：在帶橡膠塞的100 mL頂空瓶中倒入約30 mL PDA培養(yǎng)基制成斜面；將HND5菌株經(jīng)平板活化后，接種至頂空瓶中，塞緊橡膠塞并用石蠟封口膜封口以保證頂空瓶的密封性，以不接HND5菌餅的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d；將固相微萃取頭在氣相色譜儀進(jìn)樣口經(jīng)250 ℃老化30 min后，將固相微萃取裝置針頭穿透橡膠塞插入試劑瓶?jī)?nèi)HND5菌落上方，固定好萃取裝置的手柄，小心推出纖維頭并計(jì)時(shí)，吸附30 min后取出并隨即插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃下熱脫附3 min。

1.2.2 GC-MS分析 色譜條件：使用的色譜柱為Agilent HP-5MS；色譜程序：60 ℃ 2 min；10 ℃/min升至100 ℃；5 ℃/min升至180 ℃；10 ℃/min升至240 ℃；240 ℃保持5 min。質(zhì)譜條件：EI 70 eV，離子源230 ℃，四級(jí)桿150 ℃，35～800 amu全掃描。

1.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)的熏蒸抑菌作用測(cè)定 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用測(cè)定采用菌絲生長速率法[14]，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的使用劑量分別設(shè)5個(gè)濃度梯度處理，石竹烯每皿分別為10、20、40、80、160 μL（實(shí)際濃度分別為111.11、222.22、444.44、888.89、1777.78 μL/L）；4-乙烯基-1，2-二甲氧基苯每皿分別為1、5、10、20、40 μL（實(shí)際濃度分別為11.11、55.56、111.11、222.22、444.44 μL/L），并以無菌水為空白對(duì)照，重復(fù)3次；5 d后觀察病原真菌菌落生長情況，并采用十字交叉法測(cè)定其菌落直徑，計(jì)算其抑制率。

抑菌率/%=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

進(jìn)行濃度計(jì)算時(shí)，將使用濃度（μL/皿）按以下公式換算成實(shí)際濃度（μL/L）：實(shí)際濃度=（使用濃度×1 000 mL）/培養(yǎng)皿容積90 mL。計(jì)算濃度對(duì)數(shù)（x）與抑制菌落生長百分率的幾率值（y），利用最小二乘法分別求得各殺菌劑對(duì)該菌的毒力回歸方程y=a+bx和EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌HND5揮發(fā)性有機(jī)物GC-MS分析

分別將萃取的含HND5菌株和PDA的揮發(fā)性有機(jī)物和僅有PDA揮發(fā)性有機(jī)物的SPME萃取頭直接進(jìn)樣進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖見圖1。利用色譜峰面積歸一法測(cè)得各組分的相對(duì)含量，質(zhì)譜圖經(jīng)NIST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)并結(jié)合化學(xué)物質(zhì)登錄號(hào)（CAS號(hào)）分析，按照CPS（counts per second）>105，鑒定可信度大于90%的標(biāo)準(zhǔn)，得到14種HND5產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物（表1），可分為烷烴類（2種），烯烴類（4種），酮類（1種），芳香族化合物（3種），氨基丙胺類（1種），萘衍生物（2種），哌啶類（1種）。其中，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯的同系物4-甲氧基苯乙烯曾被報(bào)道具有抗菌活性，萘衍生物的同系物也在Muscodor albus產(chǎn)生的抗菌揮發(fā)性物質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，石竹烯也存在于多種中藥揮發(fā)油中，關(guān)于其他揮發(fā)性物質(zhì)的抗菌活性則少見報(bào)道[15，19，23]。據(jù)此，將對(duì)石竹烯、4-乙烯基-1，2二甲氧基苯和萘衍生物進(jìn)行活性測(cè)定，但由于未能購置到相關(guān)試劑，僅使用石竹烯（Caryophyllene）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯2種物質(zhì)的商品化純品進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 內(nèi)生真菌HND5揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)病原真菌的熏蒸抑制作用

石竹烯（Caryophyllene）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（Benzene，4-ethenyl-1，2-dimethoxy-）對(duì)3種病原真菌菌絲生長的抑制率見表2、表3和圖2。從表2、表3可以看出，2種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)供試菌株菌絲生長均具有一定抑制作用，且抑制作用均隨劑量增加而增強(qiáng)，其中40 μL/皿石竹烯對(duì)膠胞炭疽菌和多主棒孢菌的抑制率即可達(dá)到50%以上；但其對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果相對(duì)較差，在160 μL/皿的劑量下其抑制率為38.16%。4-乙烯基-1，2二甲氧基苯的抑菌效果較石竹烯好，在5 μL/皿的劑量下其對(duì)膠胞炭疽菌和多主棒孢菌抑制率即可達(dá)到60%以上；在10 μL/皿的劑量下其對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率也達(dá)到60%以上；在40 μL/皿的劑量下，該物質(zhì)對(duì)3種病原菌的抑制率均達(dá)到了80%以上，其中對(duì)多主棒孢菌的抑制率達(dá)到了91.32%。

表4顯示，2種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原真菌的生長均具良好的抑制作用，其中石竹烯對(duì)多主棒孢病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50僅為404.23 μL/L；其次為膠胞炭疽菌，EC50為729.54 μL/L；對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用相對(duì)較弱，EC50為2916.07 μL/L。4-乙烯基-1，2二甲氧基苯對(duì)多主棒孢菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50僅為23.54 μL/L；其次為膠胞炭疽菌，EC50為27.60 μL/L；對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用相對(duì)較弱，EC50為62.72 μL/L。

3 討論

HND5是分離自臂形草的內(nèi)生真菌，根據(jù)形態(tài)與分子鑒定，該菌株屬于頂孢霉屬（Acremonium sp.）。前期的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有促進(jìn)香蕉植株生長、提高香蕉植株耐鹽堿能力，能夠有效抑制多種病原菌的生長，是一株良好的生防菌株。時(shí)濤等[11]發(fā)現(xiàn)HND5可以通過產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制多種植物病原菌的生長，但揮發(fā)性物質(zhì)的具體種類與有效成分尚未明確。固相微萃取是研究菌株揮發(fā)性產(chǎn)物的新方法，由于萃取方法簡(jiǎn)單，時(shí)間短，是目前微生物揮發(fā)性有機(jī)物研究中最常使用的方法之一[15]。在本研究中，使用了頂空固相微萃取的方法收集HND5菌株的揮發(fā)性產(chǎn)物，結(jié)合GC-MS技術(shù)，全面并深入地分析了內(nèi)生真菌HND5揮發(fā)性物質(zhì)的種類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HND5共產(chǎn)生了14種揮發(fā)性物質(zhì)，包括烯烴類芳香族，酚類。由于無法全部購買到商品化的純品，只對(duì)2種物質(zhì)石竹烯（占總物質(zhì)產(chǎn)量8.99%）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（占總物質(zhì)產(chǎn)量26.80%）進(jìn)行了活性鑒定，僅占總揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)量的35.79%，結(jié)果證明這2種物質(zhì)對(duì)3種植物病原真菌均具有較好的抑菌活性。

石竹烯存在于許多具有抗炎、抑菌、抑制哮喘功能的中草藥揮發(fā)油中[16]。同時(shí)，在很多具有抗菌功能的植物提取物中，也存在大量的石竹烯，如降香揮發(fā)油中石竹烯的含量占54.22%，紅葉李莖揮發(fā)油中石竹烯占8.57%，海南黃芩揮發(fā)油中石竹烯占7.92%等等[17-19]，但大多數(shù)研究?jī)H分析了植物揮發(fā)油的抗菌活性，對(duì)其中的單體組分的活性沒有進(jìn)一步分析。本研究發(fā)現(xiàn)石竹烯具備一定的抗菌活性，由此推斷石竹烯可能與一些植物揮發(fā)油的抗菌活性相關(guān)。4-乙烯基-1，2二甲氧基苯是HND5合成的分泌量最大的揮發(fā)性物質(zhì)，占總量的26.80%，其抑菌活性也較石竹烯好，是HND5主要的揮發(fā)性抗菌物質(zhì)。與石竹烯不同，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯僅有少量同系物的相關(guān)抑菌活性報(bào)道。Wu等[20]曾在Streptomyce albulus NJZJSA2菌株中發(fā)現(xiàn)其同系物4-甲氧基苯乙烯具有拮抗尖孢鐮刀菌FOC4的活性，該物質(zhì)能破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致菌絲縊縮和細(xì)胞內(nèi)容物外溢，孢子頂端也出現(xiàn)了穿孔等現(xiàn)象。和4-甲氧基苯乙烯相比，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯抑菌活性更高，并具有更廣的抑菌譜，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的良好前景。在沒有進(jìn)行活性鑒定的物質(zhì)中，萘衍生物是主要的部分，共有2種，占總揮發(fā)性物質(zhì)總量的23.66%。內(nèi)生真菌Muscodor albus能夠產(chǎn)生多種萘衍生物，抑制Pythium ultimum、Ustilago hordei和Fusarium solani等多種病原真菌[21]。衣蘭油烯也是HND5揮發(fā)性物質(zhì)的主要部分，占總量的12.95%，衣蘭油烯經(jīng)常在植物和中草藥揮發(fā)油中被發(fā)現(xiàn)，如藿香、連翹、日本常山等等，但對(duì)其沒有進(jìn)行抑菌活性的相關(guān)研究[22-24]。

綜上所述，本研究從內(nèi)生真菌HND5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中得到了2種對(duì)多種病原真菌具有良好拮抗活性的單體組分，石竹烯和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯，為之后香蕉枯萎病、瓜菜炭疽病、橡膠棒孢霉落葉病等植物真菌病害防治藥劑的研發(fā)提供了前體和理論依據(jù)。此外，微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌防病作用可能是一種或幾種物質(zhì)的單一行為，也可以是眾多揮發(fā)物質(zhì)協(xié)同作用下的群體效應(yīng)。HND5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)具良好的抑菌活性，亦可能是多種抑菌組分協(xié)同作用的結(jié)果，其具體的抑菌機(jī)理，也有待進(jìn)一步研究分析。

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