朱德全 韓誠(chéng)武 尹紅

摘要[目的]對(duì)枯草芽孢桿菌subtilis str.168雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑（Tat）分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能分析。[方法]從NCBI中選取枯草芽孢桿菌subtilis str.168基因組注釋的蛋白質(zhì)氨基酸序列，然后用SignalP 4.0、LipoP、TatP、TMHMM 2.0軟件分析該基因組中雙精氨酸途徑的分泌蛋白，同時(shí)采用COG功能數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)的分泌蛋白進(jìn)行功能注釋和聚類分析。[結(jié)果]通過分析發(fā)現(xiàn)108個(gè)有motif沒有酶切位點(diǎn)的Tat信號(hào)肽蛋白、25個(gè)有酶切位點(diǎn)沒有motif的Tat信號(hào)肽蛋白、124個(gè)既有酶切位點(diǎn)也有motif的Tat信號(hào)肽蛋白，其中105個(gè)蛋白歸為Tat途徑的分泌蛋白。[結(jié)論]對(duì)枯草芽孢桿菌Tat途徑分泌蛋白的基因組預(yù)測(cè)和功能分析，將為分析該菌胞外蛋白的分泌機(jī)制打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞枯草芽孢桿菌；分泌蛋白；雙精氨酸分泌途徑；功能分析

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）30-0128-03

Abstract[Objective]Prediction and functional analysis of secreted proteins of TwinArginine Translocation （Tat） pathway Bacillus subtilis str.168 were conducted. [Method]The genome sequences of B.subtilis subsp. subtilis str. 168 were used to predict to secretory proteins of Tat pathway and functional analysis. SignalP 4.0， LipoP， TatP， TMHMM 2.0 were used to predict secretory protein of Tat pathway. Function of secretory proteins was also analyzed by COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins） database. [Result]There were 108 Tat signal peptides proteins containing motif without cleavage site of enzyme， 25 proteins containing cleavage site of enzyme without motif， 124 proteins containing cleavage site of enzyme and motif.105 proteins were classified as proteins secreted by Tat pathway in these proteins. [Conclusion]These results will lay the foundation for analyzing the secretion mechanism of extracellular protein in B. subtilis.

Key words Bacillus subtilis；Secreted proteins；Tat secretion pathway；Function analysis

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為革蘭氏陽性菌，它們對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，能抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖，且保濕性強(qiáng)，為土壤的保護(hù)膜，可以防止肥分及水分流失，并能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)及其他容易被環(huán)境利用的養(yǎng)分[1]，適用于有機(jī)肥、堆肥的制作。在環(huán)境和水體凈化、防治水稻稻瘟病以及醫(yī)療中發(fā)揮重要作用。2006年NCBI數(shù)據(jù)庫上收集的芽孢桿菌種名有182個(gè)，有的分類系統(tǒng)將芽孢桿菌分為20多個(gè)屬。

細(xì)菌的分泌蛋白在介導(dǎo)菌體與宿主細(xì)胞黏附定殖、與外界環(huán)境相互作用方面扮演重要的作用[2]。細(xì)菌蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成后，通過不同的途徑跨膜分泌到細(xì)胞外。雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)（ Twinarginine translocation，Tat）途徑是另外一個(gè)蛋白分泌跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的特征是在分泌蛋白的信號(hào)肽中含有一個(gè)高度保守的雙精氨酸基序[3]。Tat途徑的優(yōu)點(diǎn)是它只分泌已正確折疊的蛋白，從而保證了分泌產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上的正確性[4]。該研究從NCBI中選取枯草芽孢桿菌subtilis str.168基因組注釋的蛋白質(zhì)氨基酸序列，然后用SignalP 4.0、LipoP1.0、TatP、TMHMM 2.0軟件分析該基因組中的Tat分泌蛋白及其功能，有助于分析芽孢桿菌對(duì)外界環(huán)境產(chǎn)生相應(yīng)環(huán)境效應(yīng)的機(jī)理，為今后對(duì)其功能的具體研究以及對(duì)環(huán)境管理保護(hù)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

下載美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank公布的芽孢桿菌細(xì)菌基因組序列，GenBank的登錄號(hào)是NC_000964.3。

1.2方法

1.2.1Tat途徑分泌蛋白的分析和統(tǒng)計(jì)。

采用SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）和LipoP1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）軟件分析該菌株的Sec途徑分泌信號(hào)肽的蛋白。利用TatP軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TatP）預(yù)測(cè)Tat途徑分泌信號(hào)肽的蛋白。同時(shí)利用軟件TMHMM 2.0 （http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)分析蛋白的跨膜螺數(shù)。只有TatP軟件預(yù)測(cè)為陽性，同時(shí)SignalP 4.0和LipoP1.0預(yù)測(cè)為陰性，并且跨膜螺旋數(shù)≤1才被歸類為Tat途徑的分泌蛋白。

1.2.2Tat途徑分泌蛋白功能分析。

統(tǒng)計(jì)Tat途徑分泌蛋白，同時(shí)采用COG功能數(shù)據(jù)庫（http：//eggnog.embl.de/）對(duì)分析得到的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1芽孢桿菌Tat途徑分泌蛋白分析

先后使用4種軟件對(duì)枯草芽孢桿菌subtilis str.168基因組4 157個(gè)蛋白進(jìn)行Tat途徑分泌蛋白的預(yù)測(cè)分析[5]。由表1可知，沒有酶切位點(diǎn)的Tat信號(hào)肽的蛋白有108個(gè)，有酶切位點(diǎn)沒有motif的Tat信號(hào)肽蛋白有25個(gè)，有酶切位點(diǎn)也有motif的Tat信號(hào)肽蛋白有124個(gè)，其中有酶切位點(diǎn)也有motif的Tat信號(hào)肽蛋白中跨膜螺旋數(shù)≤1的Tat途徑分泌蛋白為105個(gè)。同時(shí)對(duì)它們的基因編號(hào)、蛋白名稱、蛋白長(zhǎng)度、COG功能以及酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

2.2芽孢桿菌基因組Tat途徑分泌蛋白功能分析

分析結(jié)果表明有酶切位點(diǎn)也有motif的Tat途徑分泌蛋白個(gè)數(shù)為105個(gè)，其中具有COG功能注釋的蛋白有96個(gè)。這些有功能注釋的Tat途徑分泌蛋白，主要與氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白質(zhì)翻譯后修飾，能源產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換，核糖體的結(jié)構(gòu)和生源有關(guān)[6]。

3討論

分泌蛋白是微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、適應(yīng)外界環(huán)境并與宿主發(fā)生相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。盡管Sec途徑是細(xì)菌中蛋白分泌跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要途徑，但是Tat途徑只轉(zhuǎn)運(yùn)折疊正確的蛋白質(zhì)，產(chǎn)物更加穩(wěn)定[5]，具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義，目前一些具有工業(yè)價(jià)值的重組蛋白已通過Tat途徑實(shí)現(xiàn)有效的分泌表達(dá)[7]。

芽孢桿菌是較早完成分泌蛋白預(yù)測(cè)的細(xì)菌，總共發(fā)現(xiàn)301個(gè)分泌蛋白，占基因組總數(shù)的7.3%。芽孢桿菌的分泌蛋白類型和數(shù)量都比較多，可能與適應(yīng)土壤微生物環(huán)境有關(guān)[6，8]。對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168基因組Tat途徑分泌蛋白的預(yù)測(cè)和功能分析有助于了解該菌株適應(yīng)外界環(huán)境的分子機(jī)制，也為該菌株目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)提供新的途徑。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過Tat途徑分泌的含有信號(hào)肽蛋白有258個(gè)，約占全部基因的10.1%，但既有酶切位點(diǎn)又含motif的蛋白為124個(gè)，占基因組編碼蛋白的3.0%，這與其他菌株的比例相似。

對(duì)Tat途徑分泌蛋白的功能分析發(fā)現(xiàn)，這一途徑分泌蛋白的功能主要與氨基酸運(yùn)輸和代謝，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后的修改，能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換，核糖體的結(jié)構(gòu)和生源有關(guān)。這將有利于該菌株適應(yīng)外部環(huán)境。

參考文獻(xiàn)

[1] RANE A N，BAIKAR V V，KUMAR V R，et al.Agroindustrial wastes for production of biosurfactant by Bacillus subtilis ANR 88 and its application in synthesis of silver and gold nanoparticles[J].Front Microbiol，2017，8：492.

[2] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT-407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2289.

[3] BABU M M，PRIYA M L，SELVAN A T，et al.A database of bacterial lipoproteins（DOLOP）with functional assignments to predicted lipoproteins[J].Journal of bacteriology，2006，188（8）：2761-2773.

[4] MLLER M.Twinargininespecific protein export in Escherichia coli[J].Research in microbiology，2005，156（2）：131-136.

[5] TAUBERT J，HOU B，RISSELADA H J，et al.TatBCindependent TatA/Tat substrate interactions contribute to transport efficiency[J].Plos one，2015，10（3）：1-24.

[6] VAN DIJL J M，BOLHUIS A，TJALSMA H，et al.Protein transport pathways in Bacillus subtilis：A genomebased road map[M]//SONENSHEIN A L，HOCH J A，LOSICK R，et al.Bacillus subtilis and its closest relatives：From genes to cells.Washington，DC：ASM Press，2002：1-3.

[7] 向燕，李建光，關(guān)梅，等.好氧氨氧化微生物生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（9）：115-120.

[8] TJALSMA H，BOLHUIS A，JONGBLOED J D H，et al.Signal peptidedependent protein transport in Bacillus subtilis：A genomebased survey of the secretome[J].Microbiology and molecular biology reviews，2000，64（3）：515-547.