陳灼娟

摘要： 對(duì)不同栽培區(qū)的25種普通枇杷品種以及7種枇杷屬野生種的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，采用鄰接法和最大簡(jiǎn)約法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建并對(duì)枇杷屬內(nèi)不同種間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：枇杷屬植物ITS序列ITS1+5.8S rDNA+ITS2總長(zhǎng)度為592 bp或594 bp，長(zhǎng)度變化發(fā)生在ITS2。所有樣本的ITS1和5.8S rDNA長(zhǎng)度一樣，都是223 bp和168 bp；而ITS2為201 bp或203 bp。5種枇杷屬野生種的ITS序列長(zhǎng)度為594 bp，包括櫟葉枇杷、大渡河枇杷、南亞枇杷、南亞枇杷窄葉變種和大瑤山枇杷；其余2種枇杷屬野生種（麻栗坡枇杷、小葉枇杷）和普通枇杷栽培種的ITS序列長(zhǎng)度都為592 bp。所有樣本ITS序列的GC含量為64.2%～64.5%，其中ITS1為64.1%～65.5%，ITS2為68.1%～72.6%。對(duì)所有樣本的ITS序列比對(duì)產(chǎn)生44個(gè)可變位點(diǎn)，其中38個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，其中11個(gè)位于ITS1，5個(gè)位于5.8S rDNA，22個(gè)位于ITS2。最大的種間序列差異為7.7%，最小的種間差異發(fā)生在麻栗坡枇杷和小葉枇杷之間，僅為0.2%。普通枇杷種內(nèi)的ITS序列差異很低，25種普通枇杷栽培種之間的序列差異為0～1.5%。所研究的枇杷屬植物可分為3個(gè)分支。分支Ⅰ包括所有普通枇杷品種，分支Ⅱ包含5種野生枇杷種，包括櫟葉枇杷、大渡河枇杷、南亞枇杷、南亞枇杷窄葉變種和大瑤山枇杷；分支Ⅲ由2個(gè)野生枇杷種（麻栗坡枇杷、小葉枇杷）組成。該研究結(jié)果表明ITS序列對(duì)枇杷種間鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析具有一定意義，但對(duì)普通枇杷栽培種間的鑒定作用不大。

關(guān)鍵詞： 枇杷屬， ITS序列， 變異位點(diǎn)， 系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)： Q781，Q949

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）11144708

Abstract： Internal transcribed spacer （ITS1， 5.8S rDNA and ITS2） regions of seven wild Eriobotrya species and twentyfive loquat （E. japonica） cultivars were cloned and sequenced. The phylogenetic tree was constructed by the Neighborjoining method and the maximum parsimony method， and phylogenetic relationships of different species of were studied in this work. The size of the ITS1+5.8S rDNA+ITS2 sequences was 592 bp or 594 bp. The length variation was found in ITS2. The length of ITS1 and 5.8S rDNA for all sample were identical， with a value of 223 bp and 168 bp. While ITS2 was 201 bp or 203 bp. The experimental data obtained from five wild Eriobotrya plants（E. prinoides， E. prinoides var. daduheensis， E. bengalensis， E. bengalensis f. angustifolia， E. dayaoshanensis） showed the same sequence length of 594 bp， while the others were 592 bp. Variation of GC contents has been also observed and scored as 64.1%-65.5% and 68.1%-72.6% for ITS1 and ITS2. The alignment of all the ITS sequences from Eriobotrya plants produced 44 variable sites with 38 parsimony of informative sites （ 11 in ITS1， 5 in 5.8S rDNA and 22 in ITS2 ）. The greatest interspecific sequence divergence was 7.7%. The lowest value （0.2%） occurred between E. malipoensis and E. seguinii showed the similar ITS sequence. We found that divergence among loquat （E. japonica） cultivars sequence was very low. The intraspecific sequence variabilities between twentyfive loquat （E. japonica） cultivars were 0-1.5%. All phylogenetic trees， by the Neighborjoining method and the maximum parsimony method， confirmed these Eriobotrya plants could be divided into three major clades. Clade Ⅰ contained all loquat （E. japonica） cultivars. Clade Ⅱ contained five wild species of Eriobotrya （E. prinoides， E. prinoides var. daduheensis， E. bengalensis， E. bengalensis f. angustifolia， E. dayaoshanensis）. Clade Ⅲ consisted of E. malipoensis and E. seguinil formed a basel clade. ITS data failed to resolve internal relationship within the Clade Ⅰ， an important clade since all loquat （E. japonica） cultivars analysed were in this clade. Our results strongly supported the efficiency of ITS sequence for the genetic diversity among Eriobotrya species， but use ITS sequence to identify the variety of loquat （E. japonica） cultivars did not appear to help.

Key words： Eriobotrya， ITS sequence， variation point， phylogeny

枇杷屬（Eriobotrya Lindl.）屬于薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果亞科（Maloideae），有27～30種，主要分布在東亞和東南亞地區(qū)。普通枇杷（Eriobotrya japonica）由于其可食性而廣為人知。在中國(guó)，關(guān)于枇杷的記載可追溯到2000年前，中國(guó)擁有豐富的枇杷種質(zhì)資源，種類多、分布廣。在古代，枇杷就被引種到國(guó)外，現(xiàn)在枇杷已在世界其他地區(qū)普遍種植（Soriano et al，2005）。為理解枇杷屬植物的分布和分類情況，學(xué)術(shù)界進(jìn)行了大量的研究工作。在中國(guó)有大量的野生枇杷種質(zhì)資源，并不斷有新的枇杷種被發(fā)現(xiàn)（Lin，1999）。但由于對(duì)野生枇杷的研究較少以及缺乏快速有效的鑒定工具，造成枇杷屬內(nèi)種類的一些混亂（楊向暉等，2005）；而普通枇杷由于長(zhǎng)期以來(lái)不同區(qū)域間經(jīng)常相互引種栽培，果農(nóng)自行定名推廣，導(dǎo)致枇杷品種出現(xiàn)同物異名和同名異物的混亂現(xiàn)象。所以，枇杷屬內(nèi)植物的遺傳評(píng)價(jià)和物種鑒定對(duì)于資源的保護(hù)和利用尤為重要。

傳統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育分析基于形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些生物學(xué)標(biāo)志如同工酶（方德秋和章恢志，1989）、等位酶（蔡禮鴻等，2005）、RAPD（Vilanova et al，2001）、AFLP（吳錦程等，2006）、SSR（Soriano et al，2005）等已被用于枇杷遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定研究中。ITS序列具有進(jìn)化速率快、穩(wěn)定性好和測(cè)序方便的優(yōu)點(diǎn)，成為研究植物系統(tǒng)發(fā)育及分子進(jìn)化的有效工具和重要標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于植物屬間、種間以及種內(nèi)各栽培種間分類研究（Alvarez & Wendel，2003）。本研究測(cè)定了25種普通枇杷栽培種及7種枇杷屬野生種的ITS序列，并進(jìn)行枇杷屬系統(tǒng)發(fā)育分析，研究枇杷屬內(nèi)分類學(xué)關(guān)系，為枇杷屬物種多樣性保護(hù)、種質(zhì)鑒別和栽培育種提供分子生物學(xué)工具和依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

植物材料均采自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)福州枇杷資源圃，包括25種普通枇杷栽培種，代表國(guó)內(nèi)外不同的枇杷栽培區(qū)，還采集了7種枇杷屬野生種，采集時(shí)均采集樹(shù)上嫩葉，并立即保存于液氮中備用， 品種名稱、原產(chǎn)地詳見(jiàn)表1。本研究選取了與枇杷屬親緣關(guān)系近的蘋(píng)果屬的Malus fusca（GenBank No：AF186514）和李屬的Pyrus ussuriensis（GenBank No：EU150058）作為外類群。

OMEGA E.Z.N.A HP plant DNA Kit、OMEGA E.Z.N.A Gel Extraction Kit購(gòu)自福州博鴻生物科技有限公司；即用PCR擴(kuò)增試劑盒及部分藥品購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。ITS引物采用White et al（1990）設(shè)計(jì)的通用引物ITS1和ITS4，引物ITS1和引物ITS4分別位于18S和28S rDNA片段上，可擴(kuò)增全長(zhǎng)ITS1、5.8S rDNA和ITS2序列。

1.2 方法

1.2.1 枇杷葉基因組DNA的提取和檢測(cè)液氮中研磨枇杷葉至粉末，應(yīng)用E.Z.N.A HP plant DNA Kit進(jìn)行DNA提取，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取到的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增應(yīng)用上海生工即用PCR試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系包含25 μL 2 × PCR Master （含MgCl2）、1 μL Primer ITS1（20 μmol·L1）、1 μL Primer ITS4（20 μmol·L1）、50 ng枇杷葉基因組DNA。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30 cycles；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收與測(cè)序PCR產(chǎn)物使用OMEGA E.Z.N.A Gel Extraction Kit進(jìn)行回收純化，回收產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序工作委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析ITS1、5.8S和ITS2的邊界由已知Eriobotrya japonica ITS序列（GenBank No：U16192）和近緣種已經(jīng)發(fā)表的ITS序列來(lái)界定，利用CLUSTAL X v.1.81（Thompson et al，1997）進(jìn)行序列排列，并進(jìn)行手工校正。利用MEGA v.4.0.2（Tamura et al，2007）對(duì)ITS1、5.8S和ITS2三個(gè)區(qū)域GC含量和核苷酸替代率進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)Kimura二參數(shù)模型構(gòu)建鄰接樹(shù)。此外，還利用PAUP 4.0 beta 10 win（Swafford，2002）軟件對(duì)所有序列進(jìn)行最大簡(jiǎn)約樹(shù)的構(gòu)建，所有特征狀態(tài)指定為無(wú)序（random），空位作缺失（missing）狀態(tài)分析。最大簡(jiǎn)約樹(shù)的構(gòu)建使用啟發(fā)式（heuristic）搜索（100隨機(jī)添加序列重復(fù)），樹(shù)二等分再連接分支交換（TBR），各種核苷酸替代同等加權(quán)，使用自展法（bootstrap）檢驗(yàn)MP樹(shù)可靠性（重復(fù)1 000次）。

2結(jié)果與分析

2.1序列長(zhǎng)度和GC含量

本研究中所有樣品ITS序列已提交至GenBank，詳見(jiàn)表1。通過(guò)對(duì)序列長(zhǎng)度和GC含量分析發(fā)現(xiàn)，所研究枇杷屬植物整個(gè)ITS序列包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2長(zhǎng)度為592 bp或594 bp（表2）。其中，來(lái)自5種野生枇杷：南亞枇杷（Eriobotrya bengalensis）、南亞枇杷窄葉變種（E. bengalensis f. angustifolia）、櫟葉枇杷（E. prinoides）、大渡河枇杷（E. prinoides var. daduheensis）、大瑤山枇杷（E. dayaoshanensis）的ITS序列長(zhǎng)度都為594 bp。其余2種野生枇杷：麻栗坡枇杷（E. malipoensis）和小葉枇杷（E. seguinii）及25種普通枇杷（E. japonica）栽培種的ITS序列長(zhǎng)度都為592 bp。長(zhǎng)度變異區(qū)域發(fā)生在ITS2區(qū)，變異發(fā)現(xiàn)為一個(gè)GC的插入（圖1）。所研究的枇杷屬植物的ITS序列GC含量在64.2%～64.5%之間，其中ITS1為64.1%～65.5%，ITS2為68.1%～72.6%。

2.2 序列差異性

本研究所采集的枇杷屬植物的ITS序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)存在44個(gè)變異位點(diǎn)，信息位點(diǎn)為38個(gè)，其中11個(gè)位于ITS1，5個(gè)在5.8S，22個(gè)位于ITS2。種間最大的序列差異為7.7%，最小的差異是在麻栗坡枇杷和小葉枇杷之間，僅有0.2%。櫟葉枇杷和大渡河枇杷序列同源率為99.3%，南亞枇杷和南亞枇杷窄葉變種序列同源率為99.2%，序列數(shù)據(jù)差異與其品種分類一致。

研究發(fā)現(xiàn)在普通枇杷各品種間的ITS序列差異較小，差異值在0～1.5%之間；差異位點(diǎn)發(fā)生在ITS2，大部分栽培種表現(xiàn)為相同的ITS序列，表明ITS序列在普通枇杷種內(nèi)具有高度保守性。

2.3 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究基于ITS序列構(gòu)建了枇杷屬內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。鄰接樹(shù)應(yīng)用 Kimura二參數(shù)法構(gòu)建 （圖2）。在應(yīng)用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)過(guò)程中，啟發(fā)性搜索（heuristic searches）產(chǎn)生95棵最大簡(jiǎn)約樹(shù)，其一致性指數(shù)（CI）為0.884 2，保留指數(shù)（RI）為0.938 9（圖3）。這兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)都把本研究所采集的樣品分為3個(gè)分支。第一個(gè)分支（Clade Ⅰ）包含了所有的普通枇杷品種，包括栽培種和一些野生種，處于該分支基部的是栽培種貴州野生，由于普通枇杷種內(nèi)ITS序列差異較小，故系統(tǒng)樹(shù)并沒(méi)有將這些品種完全分開(kāi)。第二分支（Clade Ⅱ）包含櫟葉枇杷、大渡河枇杷、南亞枇杷、南亞枇杷窄葉變種和大瑤山枇杷，這5種枇杷都是枇杷屬內(nèi)的野生種。第三分支（Clade Ⅲ）中包含麻栗坡枇杷和小葉枇杷，這個(gè)分支處于整個(gè)系統(tǒng)樹(shù)的基部。

3討論

3.1 ITS的進(jìn)化

枇杷屬植物的ITS1序列長(zhǎng)度為223 bp，ITS2比ITS1短20 bp或22 bp。得到的枇杷屬植物ITS序列的總長(zhǎng)與其他被子植物特別是薔薇科植物相近（ITS1：187～298 bp，ITS2：187～252 bp）（Campbell et al，1995）。枇杷屬I(mǎi)TS序列比對(duì)的結(jié)果顯示長(zhǎng)度變異發(fā)生在ITS2，表現(xiàn)為1個(gè)GC的插入，這種插入可能是基因滑動(dòng)，一種DNA錯(cuò)配突變過(guò)程的結(jié)果（Gillespie，2004）。

在枇杷屬植物中，ITS2的GC含量比ITS1高2%～5%；ITS2的差異水平比ITS1高出兩倍。這表明ITS2進(jìn)化速度比ITS1快（Torres et al，1990）。在普通枇杷種內(nèi)ITS1幾乎相同而變異位點(diǎn)都處在ITS2區(qū)，也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論。

3.2 ITS序列在枇杷屬系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

ITS序列的變異速率為許多被子植物類群的系統(tǒng)發(fā)育研究提供了較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)。在薔薇科（Rosaceae）植物中，ITS序列已經(jīng)成功應(yīng)用于蘋(píng)果亞科（Maloideae）（Campbell et al，1995）、唐棣屬（Amelanchier）（Campbell et al，1997）、蘋(píng)果屬（Malus）（Robinson et al，2001）、梨屬（Pyrus）（Zheng et al，2008）等植物類群的系統(tǒng)發(fā)育分析中。目前，在分子水平對(duì)枇杷屬系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究還較少。DNA序列比對(duì)可以讓我們深入認(rèn)識(shí)枇杷屬各種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究的主要目的是將ITS序列分析引入到枇杷屬遺傳關(guān)系評(píng)估體系中。本研究所采集枇杷屬植物的ITS序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)比對(duì)矩陣存在44個(gè)可變位點(diǎn)，其中信息位點(diǎn)為38個(gè)，這表明ITS序列在對(duì)枇杷種間的鑒定與關(guān)系評(píng)估具有可觀的價(jià)值。ITS序列分析也顯示了某些枇杷栽培種在形態(tài)學(xué)上差異較大，而在DNA水平上同源性卻很高。ITS序列的分析可以提供給我們一個(gè)方便的評(píng)估枇杷種間關(guān)系的工具。但是，在普通枇杷栽培種之間，ITS序列的差異性很小，表明這些栽培種在遺傳關(guān)系上非常相近。這也可能是因?yàn)檫@些栽培種都來(lái)自同一祖先，而相互之間雜交頻繁。應(yīng)用ITS序列無(wú)法將所有的栽培種分開(kāi)，故ITS序列無(wú)法有效應(yīng)用于普通枇杷栽培種進(jìn)行品種鑒定。通過(guò)ITS序列分析枇杷屬種間遺傳關(guān)系，可以有目的地選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的非栽培種作為親本進(jìn)行雜交育種，使優(yōu)良、獨(dú)特基因得到有效轉(zhuǎn)移。

3.3 普通枇杷的起源

在枇杷屬系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中，普通枇杷的起源是一個(gè)富有爭(zhēng)議的課題。方德積和章恢志（1989）在大渡河流域發(fā)現(xiàn)一種新的枇杷野生種，命名為大渡河枇杷，在研究大渡河枇杷形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)及同工酶后，認(rèn)為大渡河枇杷可能是普通枇杷的祖先之一；而唐蓓（1997）在對(duì)普通枇杷、大渡河枇杷和櫟葉枇杷的核型及過(guò)氧化物同工酶分析后，認(rèn)為大渡河枇杷可能來(lái)源于普通枇杷與櫟葉枇杷的雜交種；楊向暉等（2007）基于RAPD和AFLP對(duì)普通枇杷、大渡河枇杷和櫟葉枇杷進(jìn)行的研究支持了后者關(guān)于大渡河枇杷是櫟葉枇杷和普通枇杷雜交種的觀點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)大渡河枇杷與櫟葉枇杷在ITS序列上同源率非常高，而與普通枇杷的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，故支持大渡河枇杷是櫟葉枇杷一個(gè)變種的觀點(diǎn)。但是，關(guān)于大渡河枇杷是普通枇杷祖先的觀點(diǎn)還需進(jìn)一步論證。

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