胡曉娟 徐創(chuàng)文 李卓佳 文國(guó)棵 楊鏗 許云娜 李莎莎 曹煜成

摘要：[目的]優(yōu)化藍(lán)藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌CZBC1的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，為藍(lán)藻溶藻菌制劑的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)支持。[方法]通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選適合蠟樣芽孢桿菌CZBC1生長(zhǎng)的最適碳源和氮源，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）確定關(guān)鍵因子的最佳數(shù)量水平，并以Desig-Expert8.0.5進(jìn)行回歸分析，通過(guò)響應(yīng)面分析獲得CZBC1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)工藝參數(shù)。[結(jié)果]蠟樣芽孢桿菌CZBC1的最佳碳源、氮源分別為麩皮+糖蜜（1：1）和酵母膏。以麩皮+糖蜜用量（A）、酵母膏用量（B）、pH（C）、培養(yǎng)時(shí)間（D）為因素變量，CZBC1芽孢數(shù)（1gN）為響應(yīng)值，擬合得到二次多元回歸方程為1gN=8.5019-0.2222A+0.0998B-0.1292C+0.3801D+0.2194AB-0.1133AC+0.1350AD+0.2049BC-0.0651BD+0.0638CD-0.1260A²-0.3152B²-0.0380C²-0.2533D²，其中，碳源（麩皮+糖蜜）用量與氮源（酵母膏）用量的交互作用、碳源用量與pH的交互作用、碳源用量與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用、氮源用量與pH的交互作用對(duì)CZBCl芽孢數(shù)的影響均達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同）。響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)：麩皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，培養(yǎng)時(shí)間42h。此條件下，CZBC1芽孢數(shù)的實(shí)際值為5.75×10⁸CFU/mL，與理論值（5.90×10⁸CFU/mL）間無(wú)顯著差異（P>0.05），但極顯著高于優(yōu)化前采用營(yíng)養(yǎng)肉湯發(fā)酵培養(yǎng)的芽孢數(shù)（1.28×10⁷CFU/mL）。[結(jié)論]采用響應(yīng)面法優(yōu)化得出蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發(fā)酵培養(yǎng)工藝能有效提高菌株的芽孢數(shù)量，且模型擬合效果較好，可用于指導(dǎo)藍(lán)藻溶藻菌制劑的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：藍(lán)藻；溶藻菌；芽孢；培養(yǎng)參數(shù)；響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)：S917.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）11-2092-08

0引言

[研究意義]養(yǎng)殖水體富營(yíng)養(yǎng)化日益加劇，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)對(duì)水體生態(tài)環(huán)境和養(yǎng)殖效益造成巨大影響（Caoet a1.，2014），如何有效防控有害藍(lán)藻暴發(fā)已成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點(diǎn)之一（李茂兵等，2016）。目前，生產(chǎn)上主要使用化學(xué)藥品防控有害藻類，但其殺藻專一性差，不利于養(yǎng)殖水體優(yōu)良菌藻環(huán)境的養(yǎng)護(hù)，且易造成藥物殘留，影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全（郗建云等，2016）。溶藻菌（Algae-lvsingbacteria）可通過(guò)直接接觸或釋放某些特異或非特異性的胞外物質(zhì)溶解藻類細(xì)胞，還能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽來(lái)抑制微藻生長(zhǎng)，從而達(dá)到控藻的效果（陳慶麗等，2015）?？梢?jiàn)，溶藻菌制劑的研發(fā)及推廣應(yīng)用為有效防控養(yǎng)殖水體有害藍(lán)藻暴發(fā)提供了新思路。[前人研究進(jìn)展]黏細(xì)菌（Myxcobacteria）是最早被報(bào)道的溶藻菌（吳剛等，2002），其與藍(lán)藻接觸后能導(dǎo)致藍(lán)藻的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞溶解，但對(duì)靜息孢子不產(chǎn)生影響。間接溶藻是溶藻菌作用的主要方式，通過(guò)釋放特異性或非特異性的胞外物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、羥胺、抗生素、多肽等殺死藻類細(xì)胞，常見(jiàn)的溶藻菌有弧菌、假單胞菌、黃桿菌、交替單胞菌和交替假單胞菌等（王麗花等，2012）。黃姿等（2008）從海南洋浦港沉積物中分離出一株具有較強(qiáng)溶藻活性的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)和生理測(cè)試及16SrDNA序列分析，初步鑒定為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.）。顏小丹（2011）從湛江市海濱公園土樣中篩選分離出一株溶藻菌，初步鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacilluslaterosporus），該溶藻菌在黑暗條件下對(duì)顫藻（Oscillatoriaplanctoni-ca）和席藻（Phormidumlucidum）的生長(zhǎng)抑制效果最佳。曹煜成等（2014）篩選獲得一株養(yǎng)殖池塘藍(lán)藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）CZBC1，并證實(shí)該菌株具有廣溫、廣鹽、耐高pH和低耗氧的特性，可通過(guò)直接或間接的方式溶解浮游顫藻、綠色顫藻（O.chlorine）和小顫藻（O.tenuis）等有害藍(lán)藻（王麗花等，2012；王善龍等，2016），但對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦無(wú)不良影響。溶藻菌相對(duì)濃度是影響溶藻效果的關(guān)鍵因素，其濃度越高，溶藻效果越明顯（張俊等，2010；Yangeta1.，2013）。此外，發(fā)酵培養(yǎng)工藝決定了菌劑產(chǎn)品的菌體濃度及品質(zhì)（BehelandJackson，2014）。唐艷斌等（2013）、Mazzucotelli等（2016）利用響應(yīng)面分析法分別對(duì)枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，均有效提高了菌劑產(chǎn)量。[本研究切入點(diǎn)]至今，有關(guān)藍(lán)藻溶藻菌的研究主要集中于菌株分離篩選及其溶藻作用機(jī)理（Tianeta1.，2012；Jiangeta1.，2014），而鮮見(jiàn)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化藍(lán)藻溶藻菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝的相關(guān)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]采用響應(yīng)面分析法對(duì)藍(lán)藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌CZBC1的發(fā)酵培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高菌體有效菌濃度，為藍(lán)藻溶藻菌制劑的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

蠟樣芽孢桿菌CZBCl由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所對(duì)蝦健康養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室分離提供，該菌種已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏（保藏編號(hào)為CCTCCNo：M2013130），并獲國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)（曹煜成等，2014）。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，pH7.0-7.5。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨3.0g/L，NaCl1.0g/L，KH₂PO₄0.2g/L，MgSO₄0.2g/L，F(xiàn)eCl₃0.1g/L，3.08%MnSO₄1.0mL/L，CaCO₃0.1g/L，pH7.5-8.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1單因素試驗(yàn) 保藏的蠟樣芽孢桿菌CZBCl以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基活化，在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，選取不同的碳源[葡萄糖、蔗糖、葡萄糖+蔗糖（1：1）、可溶性淀粉、糖蜜、玉米漿、玉米淀粉、麩皮、麩皮+糖蜜（1：1）、可溶性淀粉+玉米漿（1：1）]和氮源[蛋白胨、酵母膏、蛋白胨+酵母膏（1：1）、硫酸銨、豆粕、大豆蛋白、豆粕+大豆蛋白+酵母膏（1：1：1）]，其他成分不變，初始接種濃度×10⁴CFU/mL，30℃下?lián)u床振蕩（200r/min）培養(yǎng)，分別于發(fā)酵培養(yǎng)24和48h后檢測(cè)芽孢數(shù)。

1.2.2中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Centralcompositede-sign，CCD） 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇4個(gè)條件（碳源用量、氮源用量、pH和培養(yǎng)時(shí)間）作為因素，每個(gè)因素

1.2.3響應(yīng)面分析 以芽孢數(shù)（1gN）為響應(yīng)值，對(duì)CCD試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，擬合回歸方程；并根據(jù)回歸方程，利用Design-Expert8.0.5繪制響應(yīng)面分析圖進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.2.4響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)響應(yīng)面分析優(yōu)化確定的培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件及預(yù)測(cè)芽孢數(shù)進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證試驗(yàn)，檢驗(yàn)回歸方程的有效性。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用Design-Expert8.0.5對(duì)CCD試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析和響應(yīng)面分析，并以SPSS19.0檢驗(yàn)不同碳源和氮源對(duì)CZBCl芽孢數(shù)影響的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同碳源對(duì)蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數(shù)的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以不同碳源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變，發(fā)酵培養(yǎng)后所得的芽孢數(shù)存在明顯差異（圖1）。以麩皮+糖蜜作為碳源，在發(fā)酵培養(yǎng)24和48h后的芽孢數(shù)可達(dá)3.58×10⁸和2.93×10⁸CFU/mL，顯著高于其他處理組（P<0.05，下同）；采用營(yíng)養(yǎng)肉湯發(fā)酵培養(yǎng)24和48h后的芽孢數(shù)僅為5.58×10⁶和1.28×10⁷CFU/mL。因此，選取麩皮+糖蜜作為CZBC1發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.1.2不同氮源對(duì)蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數(shù)的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以不同氮源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他成分不變，發(fā)酵培養(yǎng)后所得的芽孢數(shù)也存在一定差異（圖2）。以酵母膏作為氮源，在發(fā)酵培養(yǎng)24和48h后的芽孢數(shù)可達(dá)3.60×10⁸和1.72×10⁸CFU/mL，尤其是發(fā)酵培養(yǎng)24h的芽孢數(shù)顯著高于其他處理組。因此，選取酵母膏作為CZBC1發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1CCD試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)CCD設(shè)計(jì)的麩皮+糖蜜用量、酵母膏用量、pH和培養(yǎng)時(shí)間4因素5水平試驗(yàn)，得到30組發(fā)酵培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌CZBCl的芽孢數(shù)據(jù)，其中芽孢數(shù)（1gN）最高值為8.60、最低為6.01（表2）。

2.2.2二次回歸擬合及方差分析結(jié)果 以芽孢數(shù)（1gN）為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.5對(duì)表2進(jìn)行多元回歸分析，得到二次回歸方程：

由表3可知，回歸系數(shù)模型P<0.0001，說(shuō)明二次回歸模型顯著；失擬性的P=-0.0666，說(shuō)明該模型失擬不顯著（P>0.05，下同）；相關(guān)系數(shù)R²=0.9777，說(shuō)明二次回歸模型能較好地反映響應(yīng)值變化，即模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較好，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值問(wèn)具有較高的相關(guān)性，可用于蠟樣芽孢桿菌CZBCl發(fā)酵培養(yǎng)的理論預(yù)測(cè)。

由表3還可看出，碳源（麩皮+糖蜜）用量、氮源（酵母膏）用量、培養(yǎng)時(shí)間的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)、pH的一次項(xiàng)、碳源用量與氮源用量的交互作用、碳源用量與pH的交互作用、碳源用量與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用、氮源用量與pH的交互作用對(duì)蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數(shù)的影響均達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同）。各因素對(duì)蠟樣芽孢桿菌CZBCl芽孢數(shù)的影響順序?yàn)椋篋>B²>D²>A>AB>BC>A²>C>AD>B>AC。

2.2.3各因素間的交互作用 在響應(yīng)曲面圖中，曲面開(kāi)口向下表示響應(yīng)值存在極大值，曲面開(kāi)口向上則表示響應(yīng)值存在極小值；在等高線圖中，等高線呈圓形表示因素問(wèn)的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響不顯著，等高線呈橢圓形則表示因素問(wèn)的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著（韓建軍等，2015；吳存兵等，2016；BhattacharieeandJoshi，2016）。圖3反映麩皮+糖蜜用量與酵母膏用量對(duì)CZBC1芽孢的影響，其響應(yīng)曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即麩皮+糖蜜用量與酵母膏用量的交互效應(yīng)顯著。圖4反映麩皮+糖蜜用量與pH對(duì)CZBC1芽孢數(shù)的影響，其響應(yīng)曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即麩皮+糖蜜用量與酵母膏用量的交互效應(yīng)顯著。圖5反映麩皮+糖蜜用量與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CZBC1芽孢數(shù)的影響，其響應(yīng)曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即麩皮+糖蜜用量與培養(yǎng)時(shí)間的交互效應(yīng)顯著。圖6反映酵母膏用量與pH對(duì)CZBC1芽孢數(shù)的影響，其響應(yīng)曲面圖曲線陡、等高線呈橢圓形，即酵母膏用量與pH的交互效應(yīng)顯著。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)DesignExpert8.0.5分析得出蠟樣芽孢桿菌CZBCl的最佳發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)為：麩皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間42h。在此條件下，CZBCl的理論芽孢數(shù)為5.90×10⁸CFU/mL。發(fā)酵培養(yǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，在最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株CZBC1，其芽孢數(shù)實(shí)際值為5.75×10⁸CFU/mL，與理論值問(wèn)無(wú)顯著差異，但極顯著高于優(yōu)化前采用營(yíng)養(yǎng)肉湯發(fā)酵培養(yǎng)的芽孢數(shù)（1.28×10⁷CFU/mL）。表明擬合得到的二次回歸方程模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確，可用于指導(dǎo)藍(lán)藻溶藻菌CZBC1的發(fā)酵生產(chǎn)。

3討論

從目前已報(bào)道的溶藻菌種類來(lái)看，芽孢桿菌（Bacillussp.）為常見(jiàn)的溶藻菌之一。彭超等（2003）從武漢市某養(yǎng)殖池塘分離獲得3株能溶解藍(lán)藻的溶藻菌，經(jīng)鑒定其中1株屬于芽孢桿菌屬。Li等（2015）分離獲得可溶解銅綠微囊藻（Microcystisaerugino-sa）的菌株Lzh-5也隸屬于芽孢桿菌屬，且證實(shí)其濃度與微藻活性呈正相關(guān)。芽孢桿菌可產(chǎn)生耐高溫的芽孢，既容易存活和繁殖，又適用于生產(chǎn)和劑型加工（王星云等，2007）。因此，在芽孢桿菌的多級(jí)發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注芽孢的數(shù)量，并通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝、有效提高菌株濃度以保證溶藻效果。

碳源既能為微生物的生長(zhǎng)提供原材料，又能為其提供生長(zhǎng)所需的能量，是微生物必需的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；氮源能為微生物合成蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物提供原材料（趙能等，2016）。微生物間通常存在種屬特異性，因不同種菌株生長(zhǎng)代謝所產(chǎn)生的酶種類及活性不同，造成其對(duì)碳、氮的吸收利用也存在一定選擇性（宋瑛瑛等，2016）。因此，篩選適合芽孢桿菌生長(zhǎng)的最佳碳、氮源可有效提高其芽孢產(chǎn)量。目前，常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉等速效碳源，常用的氮源主要有酵母膏和蛋白胨等有機(jī)氮源。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)蠟樣芽孢桿菌CZBC1生長(zhǎng)過(guò)程中的碳源和氮源進(jìn)行篩選優(yōu)化，結(jié)果表明，CZBC1對(duì)有機(jī)碳源麩皮+糖蜜及有機(jī)氮源酵母膏有很好的利用效果，發(fā)酵培養(yǎng)24h后其芽孢數(shù)分別達(dá)5.58×10⁸和4.70×10⁸CFU/mL。碳源麩皮和糖蜜均為飼料級(jí)廉價(jià)易得的天然有機(jī)物，其中麩皮是小麥加工副產(chǎn)物，糖蜜是甘蔗加工副產(chǎn)物。相對(duì)于葡萄糖和蔗糖等速效碳源而言，麩皮和糖蜜的成分較復(fù)雜，不僅含有豐富的碳源，還含有較多的營(yíng)養(yǎng)因子和無(wú)機(jī)元素，是工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中常用的碳源（曹香林和陳建軍，2014；何海燕，2016）。氮源酵母膏是由新鮮酵母乳液經(jīng)酶解、分離、濃縮得到的純天然制品，不僅能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，還有利于細(xì)胞生成代謝產(chǎn)物（許翠等，2015）。

pH是影響芽孢產(chǎn)量的又一重要因素。一方面，pH變化會(huì)影響細(xì)胞膜電荷，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的解離，進(jìn)而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效果（陳令等，2014）；另一方面，pH變化可對(duì)芽孢活性產(chǎn)生影響（劉楓等，2013）。培養(yǎng)時(shí)間則是影響芽孢生產(chǎn)率的關(guān)鍵因素。為此，本研究對(duì)碳源、氮源、pH和培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素的參數(shù)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，最終確定CZBCl的最佳培養(yǎng)參數(shù)為：麩皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，培養(yǎng)時(shí)間42h。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下，CZBCl的芽孢數(shù)實(shí)際值為5.75×10⁸CFU/mL，極顯著高于優(yōu)化前采用營(yíng)養(yǎng)肉湯發(fā)酵培養(yǎng)的芽孢數(shù)（1.28×10⁷CFU/mL）。說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得出蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發(fā)酵培養(yǎng)工藝能有效提高菌株的芽孢數(shù)量，可為工業(yè)化生產(chǎn)藍(lán)藻溶藻菌制劑提供技術(shù)支持。

4結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化得出蠟樣芽孢桿菌CZBC1最佳發(fā)酵培養(yǎng)工藝能有效提高菌株的芽孢數(shù)量，且模型擬合效果較好，可用于指導(dǎo)藍(lán)藻溶藻菌制劑的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

（責(zé)任編輯蘭宗寶）