陳俊杰 劉曉云 肖猛 鮑雪銀 劉忠寬 劉慶輝 郭曉葉

摘要[目的]篩選適合河北壩上寒冷、干旱和半干旱特殊環(huán)境下的紫花苜蓿-根瘤菌菌株高效共生體。[方法]采用5株分離自河北壩上地區(qū)紫花苜蓿的根瘤菌菌株對(duì)敖漢和阿爾岡金紫花苜蓿品種分別進(jìn)行田間接種試驗(yàn)，測(cè)定2種紫花苜蓿品種的平均株高、地上部分干重和結(jié)瘤數(shù)等性狀。[結(jié)果]菌株HBU75002和HBU03701在各方面表現(xiàn)較為優(yōu)良，菌株HBU75002與其他菌株相比，具有顯著的增產(chǎn)效果，比對(duì)照增產(chǎn)26.6%。接種根瘤菌對(duì)2種苜蓿品種生物量也產(chǎn)生了不同影響，敖漢苜蓿產(chǎn)量較阿爾岡金增產(chǎn)幅度略大，最高達(dá)36.8%，而阿爾岡金則為35.6%；2株根瘤菌菌株對(duì)苜蓿品種也表現(xiàn)出不同的增產(chǎn)效果，菌株HBU03701對(duì)阿爾岡金苜蓿的增產(chǎn)效果最佳；菌株HBU75002對(duì)敖漢苜蓿的增產(chǎn)效果最佳。 [結(jié)論]該研究為苜蓿牧草生產(chǎn)提供高效優(yōu)良的根瘤菌菌株。

關(guān)鍵詞紫花苜蓿；根瘤菌；共生體；田間篩選；干重

中圖分類號(hào)S541+.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）10-0110-03

Screening the RhizobiaAlfalfa Symbiont in Bashang Region of Hebei

CHEN Junjie， LIU Xiaoyun*，XIAO Meng et al

（College of Life Sciences，Hebei University，Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province， Baoding， Hebei 071002）

Abstract[Objective] To screen the highlyeffective symbiotic strains for alfalfa cultivars in a cold， arid and semiarid environment. [Method] Five rhizobia strains were inoculated two alfalfa cultivars （Aohan and Algonquin） respectively in the field experiments，which located in Bashang region， Hebei Province. [Method] Two nitrogen fixing effective strains （HBU75002 and HBU03701） were found better than others by analyzing total nodule number， plant height and plant dry weight. Comparing with other rhizobia strains， HBU75002 could significantly increased the plant yield， raising 26.6%. Two alfalfa cultivars showed differences in biomass after inoculated with rhizobia strains， the yield of Aohan was better than Algonquin， raising 36.8% for best， and 35.6% for Algonquin. Moreover， the two strains showed different results in improving yield， HBU03701 could significantly improved the yield of Algonquin while HBU75002 for Aohan. [Conclusion] The study provides efficiant and fine strains for producing rhizobial inoculants.

Key wordsAlfalfa；Rhizobia；Symbiont；Field screening；Dry weight

生物固氮是指固氮微生物在常溫常壓下將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨的過(guò)程。生物固氮與化學(xué)合成氮肥相比具有能耗低、生產(chǎn)過(guò)程安全等優(yōu)勢(shì)，其中根瘤菌與豆科植物的共生固氮是最強(qiáng)的固氮體系，每年固氮量占全球生物固氮總量的65%以上。高效根瘤菌菌株進(jìn)行人工接種是增強(qiáng)豆科植物結(jié)瘤固氮能力的有效措施。接種根瘤菌不僅能促進(jìn)苜蓿根系發(fā)達(dá)，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，而且還能改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力[1]，促進(jìn)其他植物生長(zhǎng)，并減少化學(xué)氮肥使用量，減少對(duì)環(huán)境的污染，改變中西部地區(qū)草地退化的現(xiàn)狀[2-4]。

河北張家口壩上草原屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，高寒、干旱、多風(fēng)、無(wú)霜期短、光照充足、晝夜溫差大。土壤母質(zhì)以風(fēng)沙土為主，表土層薄，極易遭風(fēng)力、流水的侵蝕，自然植被稀疏。近年來(lái)由于過(guò)渡放牧和干旱等因素的影響，該地區(qū)草地退化嚴(yán)重、草地生產(chǎn)力下降和物種多樣性降低[5]。紫花苜蓿（Medicago sativa）是兼具生產(chǎn)和生態(tài)功能的飼草之王，素有“牧草之王”之稱，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，同時(shí)也是干旱、半干旱地區(qū)重要的植物資源。

根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的建立是根瘤菌、植物及環(huán)境三方面相互作用的結(jié)果。無(wú)論在植物原產(chǎn)地還是引種地，豆科植物都需要與適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的根瘤菌種建立共生關(guān)系[6]。近幾十年來(lái)，我國(guó)人工接種根瘤菌的效果并不十分理想，其主要原因是未篩選到適合當(dāng)?shù)貧夂颉⑼寥拉h(huán)境并與紫花苜蓿有效共生的高效根瘤菌菌株。筆者從河北張家口和山西北部干旱、半干旱地區(qū)采集根瘤，并分離、純化根瘤菌菌株，在河北壩上沽源牧場(chǎng)進(jìn)行田間接種根瘤菌試驗(yàn)，旨在篩選適合當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境，并能進(jìn)行實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用的高效共生根瘤菌菌株，為苜蓿牧草生產(chǎn)提供高效優(yōu)良的根瘤菌菌株。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

對(duì)采自河北張家口和山西大同等地區(qū)的苜蓿根瘤進(jìn)行根瘤菌分離、保存，并進(jìn)行生理生化、抗逆性以及結(jié)瘤能力測(cè)試，最終選取5株根瘤菌菌株進(jìn)行紫花苜蓿田間接種試驗(yàn)，菌株編號(hào)及采集地見(jiàn)表1。田間接種試驗(yàn)的供試苜蓿為紫花苜蓿，A品種為阿爾岡金（Algonquin），B品種為敖漢苜蓿（Aohan）。

1.2試驗(yàn)地概況

田間接種試驗(yàn)地為河北張家口市北部壩上沽源牧場(chǎng)，地理坐標(biāo)為115.8°E，41.8°N。其屬于溫帶干旱、半干旱草原農(nóng)牧交錯(cuò)地帶，土壤pH 7.8～8.2；氣候特點(diǎn)是冬季寒冷，最低氣溫-38 ℃；夏季雨熱同季，年降水量300～400 mm，全年蒸發(fā)量1 870 mm，70%降水集中在7—9月；全年日照時(shí)數(shù)達(dá)2 200 h，年均日照率66%。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1根瘤菌菌株的培養(yǎng)。

將供試菌株分別接種至克氏瓶YMA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d；用100 mL無(wú)菌水洗滌菌體，裝入無(wú)菌三角瓶中搖床振蕩15 min，分光光度計(jì)測(cè)定其OD600 nm，計(jì)算其含菌量。

1.3.2根瘤菌田間接種試驗(yàn)。

試驗(yàn)設(shè)3組處理，分別為紫花苜蓿品種、根瘤菌菌株、不接種。小區(qū)面積為4 m2，每個(gè)處理重復(fù)5次，隨機(jī)排列，共36個(gè)小區(qū)，各小區(qū)間隔離帶寬1 m。2010年7月7日播種，播種前對(duì)草地土壤進(jìn)行輕度翻耙（5～8 cm）并鎮(zhèn)壓；采用條播方式播種，播種量11.25 kg/hm2，行間距30 cm，播種后覆土2～3 cm，然后進(jìn)行鎮(zhèn)壓。

植物生長(zhǎng)至70 d左右，可觀察到植物開(kāi)花，當(dāng)開(kāi)花植物接近總種植量的50%時(shí)，進(jìn)行第1次刈割，測(cè)定植物結(jié)瘤數(shù)和根長(zhǎng)；2011年5月18日對(duì)試驗(yàn)小區(qū)添加相應(yīng)根瘤菌菌劑；2011年7月18日對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行第2次刈割，對(duì)植物株高和地上部分干重（植物樣品先在烘箱中105 ℃殺青15 min，后于65 ℃烘干至恒重）進(jìn)行測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素和雙因素方差分析（Oneway or Twoway ANOVA）；在滿足方差齊性的情況下，再利用Duncans檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，確定各因子內(nèi)部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1根瘤菌菌株對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)性狀的影響

方差分析結(jié)果表明，菌株之間的結(jié)瘤率、株高和干重具有顯著差異（P<0.05），而根長(zhǎng)在各個(gè)菌株之間無(wú)顯著差異。由表2可知，從結(jié)瘤率看，接種5株根瘤菌菌株的植物結(jié)瘤率均高于對(duì)照組，菌株HBU75002結(jié)瘤率為100%，與對(duì)照具有顯著差異；菌株HBU03701、HBU75035和HBU03725結(jié)瘤率也顯著高于對(duì)照，說(shuō)明接種根瘤菌對(duì)植物結(jié)瘤具有顯著的促進(jìn)作用。除菌株HBU75076根長(zhǎng)與對(duì)照差異顯著外，接種其他菌株的苜蓿根長(zhǎng)均與對(duì)照無(wú)顯著差異；除菌株HBU03701和HBU75002株高與對(duì)照差異顯著外，其他菌株與對(duì)照均無(wú)顯著差異。除菌株HBU75002地上部分干重顯著高于對(duì)照外，其他菌株與對(duì)照均無(wú)顯著差異，菌株HBU75002地上部分干重比對(duì)照增加26.6%，菌株HBU03701和HBU75035干重僅次于該菌株。

2.2紫花苜蓿品種對(duì)紫花苜蓿干重及與根瘤菌菌株互作的影響

方差分析結(jié)果表明，苜蓿品種之間的植物干重具有顯著差異（P<0.05），其他性狀均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

紫花苜蓿品種與根瘤菌菌株交互影響不顯著。由表3可知，阿爾岡金苜蓿接種根瘤菌后，其干重明顯高于敖漢苜蓿（除HBU75002外）。在苜蓿品種與根瘤菌菌株之間有一個(gè)最優(yōu)

3討論

3.1不同根瘤菌菌株對(duì)接種植物性狀的影響

河北壩上草原屬于我國(guó)北方重點(diǎn)牧區(qū)，土地資源雖然比較豐富，但耕作生產(chǎn)力和生產(chǎn)率低，過(guò)度墾殖、破壞自然植被以及土地侵蝕越來(lái)越嚴(yán)重[5]。田間試驗(yàn)選擇河北壩上沽源牧場(chǎng)作為試驗(yàn)地，是為了獲得適宜該地區(qū)高效固氮的根瘤菌菌劑，旨在篩選抗寒、抗旱的紫花苜蓿品種和相應(yīng)的高效固氮根瘤菌菌株。該研究從河北壩上和山西右玉的苜蓿根瘤中分離、純化根瘤菌菌株，通過(guò)抗逆性及結(jié)瘤能力測(cè)試選擇了5株供試菌株進(jìn)行研究，結(jié)果獲得了HBU75002和HBU03701 2株較為優(yōu)良的根瘤菌菌株，明顯增加紫花苜蓿的結(jié)瘤率和地上部分干重。其他根瘤菌菌株也能與紫花苜蓿形成有效根瘤，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但與菌株HBU75002和HBU03701相比，產(chǎn)量較低，有些菌株產(chǎn)量甚至低于對(duì)照，可能與土壤不均一化以及菌株自身的遺傳因素有關(guān)。

3.2接種根瘤菌對(duì)不同苜蓿品種生長(zhǎng)的影響

苜蓿作為一種荒漠、干旱、貧瘠地的先鋒植物，能很好地適應(yīng)我國(guó)西北地區(qū)寒冷、干旱和半干旱的惡劣環(huán)境。我國(guó)西北部地區(qū)荒漠化嚴(yán)重，生態(tài)環(huán)境又極其脆弱。在退耕還林還草工程中，大面積種植豆科灌木和牧草并接種根瘤菌，可以解決大面積人工林、草場(chǎng)“氮缺乏”等問(wèn)題，改善生態(tài)環(huán)境，推動(dòng)該地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展。該研究結(jié)果表明，接種根瘤菌可以提高植物地上部分干重，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[7-8]。

苜蓿品種很多，不同品種適合在不同土壤環(huán)境下生長(zhǎng)，而在土壤氮素相同的條件下，不同苜蓿品種對(duì)相同根瘤菌菌株獲得的接種效果差異也較大，對(duì)一個(gè)品種可以產(chǎn)生優(yōu)異表現(xiàn)的菌株，對(duì)另一品種也許只能起誘導(dǎo)反應(yīng)作用[9-17]。馬其東等[18]研究表明，這2種生物之間的交互作用使得根瘤菌與宿主之間需要相匹配，才能使苜蓿獲得最佳生長(zhǎng)效果。張瑞富等[19]在內(nèi)蒙古地區(qū)比較了多個(gè)紫花苜蓿品種，阿爾岡金在株高和產(chǎn)量等方面都優(yōu)于其他品種。海濤等[20]、曹宏等[21]在哈爾濱進(jìn)行苜蓿品種比較試驗(yàn)，阿爾岡金產(chǎn)量高于敖漢苜蓿。該研究中，阿爾岡金品種在根瘤結(jié)瘤率、地上部分干重方面明顯優(yōu)于敖漢苜蓿。研究表明，不同苜蓿品種適合在特定的土壤環(huán)境下生長(zhǎng)；同一根瘤菌菌株對(duì)不同苜蓿品種產(chǎn)生的接種效果不同[18]。而該研究由于試驗(yàn)樣地小區(qū)土壤的不均一化，可能導(dǎo)致2種苜蓿結(jié)瘤率的差異不顯著。

該研究表明，根瘤菌菌株對(duì)苜蓿品種具有一定的匹配性，菌株HBU03701較適合于阿爾岡金苜蓿，而菌株HBU75002對(duì)于2種苜蓿品種的貢獻(xiàn)較為均等。該研究前期通過(guò)對(duì)這2株根瘤菌菌株在山西補(bǔ)播紫花苜蓿的分子標(biāo)記研究，發(fā)現(xiàn)其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力較強(qiáng)[22]。該研究進(jìn)一步說(shuō)明了其具有較強(qiáng)的結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)能力。

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安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年