于東明 李筱雨 孫申領(lǐng) 孫炎鋒 王偉 呂東 苗琛

摘要 [目的]查找水稻 RSSG58 在擬南芥中的同源基因并觀察其組織表達模式。[方法]利用相關(guān)基因信息學(xué)網(wǎng)站構(gòu)建水稻 RSSG58 的基因進化樹，構(gòu)建其同源基因 ATG58：：GUS定位載體轉(zhuǎn)入擬南芥，觀察分析ATG58 的組織表達模式。 [結(jié)果]進化樹和序列對比發(fā)現(xiàn)ATG58與RSSG58 具有較高的序列相似性，GUS定位遺傳材料顯示 ATG58在多種組織都有表達，在生長發(fā)育早期的根、子葉、下胚軸、胚芽表達量相對較高，在生殖發(fā)育階段的花苞和花藥內(nèi)優(yōu)勢表達，ATG58與RSSG58具有相似的GUS 定位組織表達模式。[結(jié)論] ATG58 是水稻 RSSG58 的同源基因，二者組織表達模式一致，這些結(jié)果為深入研究擬南芥 ATG58 和水稻 RSSG58 在雄配子發(fā)育過程中的作用及機制提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞水稻；RSSG58；ATG58；β-葡萄糖苷酸酶（GUS）；組織表達；進化樹分析

中圖分類號S501文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）10-0126-03

Evolutionary Analysis of Rice RSSG58 and Tissue Expression Pattern Analysis of Its Arabidopsis Homologous Gene ATG58

YU Dongming，LI Xiaoyu，SUN Shenling，MIAO Chen* et al（Henan Provincial Key Laboratory of Plant Stress Biology，State Key Laboratory of Cotton Biology ，Henan University，Kaifeng，Henan 475001）

Abstract[Objective] To find the homologous gene of rice RSSG58 in Arabidopsis thaliana and observe its tissue expression pattern.[Method] The phylogenetic tree of rice RSSG58 was constructed by using the related gene informatics website.The homologous gene ATG58：：GUS locus was constructed into A.thaliana to observe and analyze the tissue expression pattern of ATG58.[Result] The phylogenetic tree analysis and sequence comparison showed that ATG58 had a highest sequence similarity with RSSG58.GUS locating genetic material showed that ATG58 was expressed in various tissues.The expression of ATG58 was relatively higher in root，cotyledon，hypocotyl and embryo of seedling stage，and it was superior to the buds and anthers in the reproductive development stage.ATG58 had similar GUS localization expression pattern with RSSG58.[Conclusion] ATG58 is the homologous gene of rice RSSG58，which is consistent with RSSG58 in the tissue expression pattern.These results provide a basis for further study of the role and mechanism of A.thaliana ATG58 and rice RSSG58 in the development of male gametes.

Key wordsOryza saliva L；RSSG58；ATG58；Betaglucuronidase（GUS）；Tissues expression；Phylogenetic tree analysis

水稻（Oryza saliva L）是一種重要的糧食作物，由于它具有較小的基因組（430 Mb），以及與其他禾本科植物較高的共線性，已經(jīng)成為研究植物發(fā)育生物學(xué)和功能基因的重要單子葉模式生物[1]。模式植物水稻和擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組測序工作的完成為植物基因功能的研究提供了極大的便利。雙受精作用是被子植物自然分類群的獨有特征，精細胞（Sperm cells）在被子植物生殖發(fā)育過程中擔負著受精、識別以及遺傳物質(zhì)傳遞等重要使命。前期已成功地分離出了批量的水稻生活精細胞[2]，并用抑制差減雜交（SSH）技術(shù)從水稻精細胞文庫中篩選到一些在精細胞中表達的基因[3-4]。其中

RSSG58 基因在精細胞中優(yōu)勢表達，且其推測蛋白與擬南芥的肌球重鏈蛋白同源性較高，相關(guān)的研究也暗示了其可能在精細胞發(fā)育和受精過程中起關(guān)鍵作用。

筆者首先通過基因信息學(xué)分析找到水稻 RSSG58 的擬南芥同源基因 ATG58，并構(gòu)建GUS 組織表達遺傳材料，觀察了 ATG58在不同組織的表達模式，以期為深入研究水稻 RSSG58 及其擬南芥同源基因 ATG58 在雄配子發(fā)育過程中的作用及機制提供有價值的線索。

1材料與方法

1.1植物材料和培養(yǎng)

培養(yǎng)材料：擬南芥生態(tài)型植株 Columbia（Col-0），種子由河南省植物逆境生物學(xué)重點實驗室提供。擬南芥生長室培養(yǎng)條件為溫度約 22 ℃；光周期為 16 h 光照，8 h 黑暗。1/2 MS 培養(yǎng)基：MS 鹽 2.2 g/L、3% 蔗糖和滅菌蒸餾水，調(diào) pH 到 5.9～6.1，加入 1.5% 瓊脂粉，搖勻后高壓鍋內(nèi)滅菌，在超凈臺內(nèi)倒板。擬南芥的培養(yǎng)：取適量新鮮擬南芥種子，18%次氯酸鈉處理 10 min，無菌水清洗 3～4 次，點種于預(yù)先配制好的 1/2 MS 培養(yǎng)基上。

1.2質(zhì)粒、菌株、試劑和儀器

pEASY-Blunt 克隆載體購自全式金生物技術(shù)有限公司（北京）；表達載體 GUS-pCAMBIA1391 由河南省植物逆境生物學(xué)重點實驗室提供。大腸桿菌感受態(tài)菌株 Trans1-T1 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌 GV3101 由河南省植物逆境生物學(xué)重點實驗室提供。限制性內(nèi)切酶購于 TaKaRa 中國分公司（大連）；聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）試劑購自天根生化科技有限公司（北京）；DNA 提取試劑盒購自TaKaRa 中國分公司（大連）；常規(guī)化學(xué)試劑購自北京化工廠（北京）；引物合成和 DNA 測序主要由金唯智生物科技（北京）有限公司完成（北京）。主要儀器有顯微鏡（Olympus BX51，日本）、PCR儀（BIO-RAD C1000，美國）和數(shù)碼照相機（佳能 60D，日本）。

1.3擬南芥基因組 DNA 的提取

剪取 1～2 片比較幼嫩的擬南芥葉片并用雙蒸水洗凈后放入 1.5 mL 的 EP 管中，加入液氮速凍，用研磨棒研磨充分，使用 DNA 提取試劑盒提取 DNA，晾干，取 30 μL無菌水加入離心管中，使 DNA 充分溶解，離心收集 DNA，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4基因克隆和載體構(gòu)建

組織定位載體構(gòu)建：將 ATG58 基因的 1 610 bp 啟動子序列采用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計兩端帶有 Pst Ⅰ 和BamH Ⅰ 酶切點的引物，將目的基因片段連接到表達載體 GUS-pCAMBIA1391 中，構(gòu)建融合蛋白表達載體 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391。

1.5進化樹分析

利用 Clustal X 和 GeneDoc 進行氨基酸序列比對及同源性分析；利用 http：//www.arabidopsis.org/ 網(wǎng)站提供的 BLAST 程序，把水稻 RSSG58 的蛋白序列輸入進去，比對分析基因的拷貝數(shù)；進化樹采用 Clustal Omega 網(wǎng)站 http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ 在線獲得。

1.6農(nóng)桿菌浸花轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染擬南芥

把 10 μL ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 質(zhì)粒加入到 100 μL 農(nóng)桿菌感受態(tài) GV3101 菌液中，凍融法進行轉(zhuǎn)化；挑取農(nóng)桿菌單菌落分別置于含卡那霉素和利福平抗生素的 YEB 液體培養(yǎng)基中，于搖床中 28 ℃ 200 r/min 過夜搖培 20～24 h；取搖好的菌液進行 PCR 檢測。取 PCR 驗證的上述農(nóng)桿菌單菌液至 30 mL 新鮮的含有抗生素的 YEP 培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，至 OD600=1.2～1.6，5 000 r/min 離心 10 min，收集菌體。重懸于滲入緩沖液（0.5 MS、5%蔗糖、0.03% Silwet L-77），調(diào) OD600 至 0.8。待擬南芥Columbia生態(tài)型（Col-0）植株生長至開花期，把配好的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液倒進一個大培養(yǎng)皿中，淹沒材料浸染 30～40 s，然后用保鮮膜包盤，水平放置，室溫避光放置 24 h 后，正常置于材料室。

1.7β-葡萄糖苷酸酶（GUS）組織化學(xué)分析

將 ATG58：：GUS 轉(zhuǎn)基因植株的不同組織分別置入配制好的GUS染色液中（調(diào)pH=7.2），37 ℃ 保溫過夜。將染色好的植物組織置于固定液（乙醇∶乙酸=3∶1）中固定脫色 2 h，然后用透明劑進行透明處理，將透明好的植物材料置于顯微鏡下觀察和拍照。

2結(jié)果與分析

2.1RSSG58 進化樹分析

首先利用水稻相關(guān)網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml）獲得水稻 RSSG58 的基因號（LOC_Os12g41810）和蛋白序列，利用擬南芥 Tair 網(wǎng)站 BLAST 工具， 輸入 RSSG58 蛋白序列，WU-BLAST[5-6]查找其在擬南芥的同源蛋白。根據(jù)P值選取相關(guān)基因建立 NJ 樹（圖 1），這個系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系總體是合理的，支系間支持率都大于 50，所以基因間關(guān)系是可信的。從進化樹結(jié)果分析擬南芥 At2g34730（稱為 ATG58）與 RSSG58 同屬一支，具有最高的相似度，并且二者序列有較高的相似度（圖 2）。綜合相關(guān)基因信息學(xué)分析顯示：擬南芥 ATG58 可能與水稻 RSSG58 有著相同或相近的生物學(xué)功能。

2.2ATG58 的 GUS 組織定位表達載體構(gòu)建在目的基因 ATG58 的啟動子后連上 GUS 基因作為報道基因，通過其組織定位情況來研究目的基因的表達情況[7]，以便更好地分析目的基因的功能。為了檢測目的基因 ATG58 的組織表達情況，該研究構(gòu)建了 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 載體（圖3），以野生型擬南芥基因組 DNA 為模板擴增目的基因的啟動子，回收后的基因與 GUS-pCAMBIA1391 空質(zhì)粒進行雙酶切及連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行 PCR 驗證。經(jīng)雙酶切驗證鑒定插入片段與質(zhì)粒 PCR 片段大小一致（圖4），測序結(jié)果顯示正確。表明 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 載體構(gòu)建成功。

2.3ATG58的組織表達模式

把 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到野生型植株中產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。對 T3 代轉(zhuǎn)基因純合株系的不同組織進行 GUS 染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATG58 基因在多種組織都有表達，生長發(fā)育早期的根、子葉、下胚軸、胚芽表達量相對較高，生殖發(fā)育階段的花苞、花藥以及雄蕊表達量較高，屬于優(yōu)勢表達。

3討論與結(jié)論

植物雄性不育（Male sterility，MS）作為雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，其遺傳機制一直受到水稻育種學(xué)家的高度重視，目前，已對有關(guān)雄性不育分子機制提出了相應(yīng)的理論和假設(shè)[8-10]。迄今為止人們對植物生殖發(fā)育過程的了解與認識，遠遠不能滿足植物雄性不育的理論和雜種優(yōu)勢利用的需要，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)誘導(dǎo)表達雄性不育基因是創(chuàng)造雄性不育系的有效途徑之一[11]。

前期發(fā)現(xiàn) RSSG58 在精細胞中優(yōu)勢表達，其花粉發(fā)育過程出現(xiàn)異常[3-4]，深入研究將有利于解析植物雄性不育的相關(guān)機制。通過水稻 RSSG58 的基因信息學(xué)分析，在擬南芥中找到一個同源性較高的基因 ATG58，二者蛋白序列有較高的相似性。

生物信息學(xué)分析顯示 RSSG58 基因在第12開花期的雄蕊、花粉粒、幼苗期根、成熟葉片等部位表達量明顯較高（Rice eFP Browser，http：//bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgi），但是該網(wǎng)站（Arabidopsis eFP Browsers，http：//bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）缺乏其同源基因 ATG58 的相關(guān)組織表達信息。擬南芥作為常用的模式植物，具有比水稻生長周期短、構(gòu)建遺傳材料快等優(yōu)點。為了驗證二者組織定位表達模式的差異，構(gòu)建了 ATG58：：GUS定位表達載體轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得了能穩(wěn)定遺傳的純合體。ATG58：：GUS 組織定位結(jié)果顯示花苞、花藥表達較高，這與水稻 RSSG58 的基因表達模式具有較高的一致性，說明擬南芥 ATG58 與水稻 RSSG58 的功能可能存在相似性。這些結(jié)果為進一步解析擬南芥 ATG58 的功能提供了基礎(chǔ)，更為深入研究水稻 RSSG58 在雄配子發(fā)育過程中的作用及機制提供有價值

ALPIZAR E，DECHAMP E，LAPEYREMONTES F，et al.Agrobacterium rhizogenestransformed roots of coffee（Coffea arabica）：Conditions for longterm proliferation，and morphological and molecular characterization[J].Annals of botany，2008，101（7）：929-940.

[12] 劉莉莉，李昌禹.毛狀根發(fā)展現(xiàn)狀研究[J].北方園藝，2014（24）：178-182.

[13] 包京姍，馬海弢，徐大衛(wèi)，等.王不留行毛狀根培養(yǎng)體系建立及其黃酮苷的測定[J].中草藥，2016，47（1）：138-142.

[14] 鄭傳進，吳小勇，王志江.南藥巴戟天毛狀根誘導(dǎo)條件優(yōu)化研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（10）：77-78.

[15] 陳觀水，陳來，林思妮，等.太子參毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的建立[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（8）：2021-2023.

[16] 陳永芳，蘆韋華，王芳，等.新疆紫草毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)[J].西北植物學(xué)報，2008，28（12）：2423-2428.

[17] 孟凡娟，王秋玉，謝立波，等.利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根的研究進展[J].北方園藝，2008（12）：81-83.