劉濤 許穎妍 熊青 趙金星 陳建軍 陳桂信 佘文琴

摘要[目的]克隆夜香樹（Cestrum nocturnum L.）萜類香氣物質(zhì)代謝途徑關(guān)鍵限速酶DXS2（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 2）基因全長cDNA，并對該基因進行生物信息學(xué)分析，檢測該基因在開花不同時間及葉片中表達量的動態(tài)變化。[方法]采用RT-PCR與RACE相結(jié)合的技術(shù)，獲得夜香樹DXS2的全長核苷酸序列，并進行生物信息學(xué)分析，qRT-PCR分析其在盛花期不同時間花和葉中的表達量。[結(jié)果]獲得CnDXS2基因全長序列2 370 bp，其中ORF 2 145 bp，編碼714個氨基酸，含DXP-synthase-N、TPP-PYR-DXS-TK-like和Transketolase-C等保守結(jié)構(gòu)域，與絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis L.）DXS2蛋白同源性達93%，推測屬于Ⅱ類DXS蛋白；qRT-PCR分析表明，CnDXS2在葉中表達量總體高于花，花中22∶00表達量最高，14∶00表達量最低，具有節(jié)律性。[結(jié)論]萜類MEP代謝途徑基因CnDXS2的克隆與表達分析為從分子方面揭示CnDXS2基因在萜類香氣代謝途徑中的功能提供了依據(jù)，有助于夜香樹花香萜類代謝途徑基因功能和花香基因工程的研究。

關(guān)鍵詞夜香樹；DXS2；表達分析

中圖分類號S188文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）10-0132-05

Cloning and Expression Analysis of DXS2 Gene in Cestrum nocturnum L.

LIU Tao，XU Yingyan，XIONG Qing，CHEN Guixing*，SHE Wenqin* et al

（Institute of Storage Science and Technology of Horticultural Products， Fujian Univesity of Agriculture and Forestry， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract[Objective] To clone the fulllength cDNA of a critical rate limiting enzyme gene DXS2 in terpenoids pathway from Cestrum nocturnum L.， analyse bioinformation and qRTPCR of flowers and leaves of different time at blooming stage of the gene. [Method] The fulllength of DXS2 gene was isolated using RTPCR and RACE（rapidamplification of cDNA ends） technology， then analyzed by bioinformatics.The expression of the gene in flower and leaves of different time from blooming stage was analyzed by qRTPCR.[Result] The fulllength of CnDXS2 was 2 370 bp and contained a 2 145 bp open reading frame（ORF） encoding a protein of 714 amino acid， including conserved domains such as DXPsynthaseN， TPPPYRDXSTKlike and TransketolaseC，etc.The homology between CnDXS2 and DXS2 protein from Nicotiana tomentosiformis L. was 93%， maybe a Class Ⅱ DXS protein；qRTPCR analysis showed that the expression level of CnDXS2 in leaves was generally higher than flowers， reached the peak at 22∶00 and lowest at 14∶00 in flowers， with rhythm.[Conclusion] Cloning and expression analysis of CnDXS2 form terpenoid metabolic pathway of MEP can provide the basis to reveal molecular function of CnDXS2 in terpene aroma metabolic pathway， promote the study on the gene function and the floral genetic engineering of terpenoid pathway in C. nocturnum L..

Key wordsCestrum nocturnum L.；DXS2；Expression analysis

夜香樹（Cestrum nocturnum L.），茄科（Solanaceae）夜香樹屬（Cestrum）植物，灌木，廣泛種植于我國南方各地。夜香樹花量大，花期長且花香濃郁，具有一定的防蚊蟲效果；其管理粗放，繁殖速度快，易于成活；各個部位均可食用或藥用，有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等功效，在園藝、藥用等方面具有較高的潛力[1-4]。在花期，夜香樹18∶00至次日6∶00左右完成開花、放香、花瓣閉合等一系列生理活動，濃郁的花香及其不開不香的特性為夜香樹等植物所特有。揮發(fā)性萜類物質(zhì)芳樟醇（linalool）、金合歡烯（α-Farnesene）等作為夜香樹第二大類花香物質(zhì)，對于特征香氣的構(gòu)成具有重要作用[5-6]。

DXS作為萜類物質(zhì)MEP（2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate）代謝途徑的第1個限速酶，以丙酮酸和3-磷酸甘油醛為底物生成DXP，為后續(xù)反應(yīng)提供前體，是萜類物質(zhì)代謝工程的重要靶點[7-8]。DXS基因最先在大腸桿菌（Escherichia coli）中被分離和鑒定出來[9]，隨后，其同源基因相繼在擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.][10]、胡椒薄荷（Mentha × piperita）[10]等植物中被克隆出來。許多細菌基因組中通常只含有1個DXS基因，高等植物則擁有2個以上編碼DXS的基因，在不同組織或者發(fā)育階段起著不同的作用[8，11-12]。目前，DXS基因家族被認(rèn)為有3類[13-16]：Ⅰ 類參與葉綠體中重要萜類的合成；Ⅱ 類位于非光合作用質(zhì)體中，參與萜類次生代謝；Ⅲ 類可能參與植物激素等低表達重要萜類的合成?；蚬こ滔嚓P(guān)研究發(fā)現(xiàn)，超表達DXS基因可提高MEP代謝途徑下游產(chǎn)物產(chǎn)量，在擬南芥[17-18]、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）[19]、辣椒（Capsicum annuum L.）[20]等植物中得到證實，異源DXS基因超表達也有相似作用[21]，并可以遺傳給下一代且無明顯形態(tài)、習(xí)性變化。

目前，關(guān)于夜香樹花香分子機制方面的研究相對較少。該研究以夜香樹盛花期夜間開放且放香的花朵為材料，通過RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，分離了CnDXS2全長cDNA；采用MEGA、WoLF PSORT II 、SignalP等軟件對CnDXS2進行了生物信息學(xué)分析，為后續(xù)試驗提供指導(dǎo)；采用qRT-PCR分析CnDXS2在盛花期花和葉中24 h內(nèi)的表達量變化情況，為弄清CnDXS2在香氣代謝方面的作用奠定分子基礎(chǔ)，有助于花香基因工程方面研究的進行。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為夜香樹盛花期的花和嫩葉，2016年8月取自于福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院前，花和葉從同一側(cè)枝上摘取，18∶00至次日6∶00，每2 h取1次，次日6∶00至次日18∶00每4 h取1次，共9個時間段，每個時間段取3次重復(fù)。

試驗所需Agarose、GelStain、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；6×DNA Loading Buffer、pMD18-T Vector、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、RNAiso Plus、SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）購自寶生物工程（大連）有限公司；SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DH5α感受態(tài)細胞、Universal DNA 純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。其他試劑、耗材均為進口或?qū)嶒炇抑苽?，引物委托上海六合華大公司合成。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成。

總RNA提取參照Invitrogen TRIZOL Reagent 說明書操作，沉淀溶于40 μL RNase Free Water；采用紫外分光光度計確定RNA濃度和質(zhì)量；取800 ng RNA 進行1%瓊脂糖凝膠電泳，驗證完整性與濃度。RNA檢測后立即存于-80 ℃ 備用。cDNA第一鏈合成參照鄭鴻昌[22]、呂恃衡[23]的方法進行。

1.2.2CnDXS2全長的克隆。

根據(jù)茄科煙草（Nicotiana tabacum L.）、土豆（Solanum tuberosum L.）、番茄、絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis L.）等植物已公布的DXS2基因序列設(shè)計簡并引物：CnDXS2_C-F：5′—ATATG（A/C）GGC（A/G）AT（A/G）AAT（A/G）A（C/T）GCAG—3′，CnDXS2_C-R：5′— GCTT（A/C）GTCT（A/C）AT（A/G）GAG（A/G）CAT—3′。PCR擴增體系：10× TransTaq HiFi Buffer Ⅱ 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，TransTaq HiFi DNA Polymerase（5 U/μL）0.25 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，模板0.5 μL，補ddH2O至25 μL；PCR程序參照說明書，設(shè)置退火53 ℃，延伸1 min，擴增35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性后，純化回收，連接pMD18-T載體再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，得到的菌液采用M13引物進行PCR驗證，委托上海六合華大公司進行測序。根據(jù)得到的CnDXS2保守區(qū)序列，采用Oligo 7設(shè)計3′ RACE引物：CnDXS_3RACE-P1：5′—AAGAAGCTGAAATAGACAATAAGA—3′，CnDXS_3RACE-P2：5′—AAGAGGAGTAGATAGCACAGAACG—3′，5′ RACE引物：CnDXS_5RACE-P1：5′—ACCCGACGCGCTAATCATTCC—3′，CnDXS_5RACE-P2：5′—AGGTCCAATTTGCTTTGTTATAC—3′。PCR體系與之前保持不變，PCR程序退火溫度根據(jù)引物所需溫度設(shè)置，延伸2 min，其余保持不變，第1輪RACE后PCR產(chǎn)物稀釋30～50倍后作為第2輪RACE模板使用。得到的序列使用華大基因自助拼接系統(tǒng)拼接后，采用Vector NTI 11 Align X與接頭引物進行比對以去除載體序列。

1.2.3CnDXS2生物信息學(xué)分析。

采用NCBI Blast、Blastx對CnDXS2序列進行核酸、氨基酸同源性分析，Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測CnDXS2蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)，SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預(yù)測，WoLF PSORT II（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進行亞細胞定位預(yù)測，TMHMM v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測，采用MEGA 7最大似然法（Maximun Likelihood）進行系統(tǒng)進化分析。

1.2.4qRT-PCR分析。

以得到的序列為模板，利用Beacon Designer 8.14，設(shè)置引物Tm （72±5）℃，其他條件參照qRT-PCR引物設(shè)計原則進行設(shè)置，得到CnDXS2_Q-F：5′— AAGAAGCTGAAATAGACAATAAGA—3′，CnDXS2_Q-R：5′—AAGAGGAGTAGATAGCACAGAACG—3′。

提取9個時間段花和葉的總RNA，根據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書，根據(jù)SYBR Green qPCR法，取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物稀釋20倍后存于-20 ℃；參照說明書設(shè)置體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）5 μL，cDNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），補ddH2O至10 μL，每個樣品3個復(fù)孔；以EF-1A_Q-F：5′—ACTGTTCCTGTCGGTCGTGTTGAGA—3′，EF-1A_Q-R：5′—GGAAGTGCCTCCTGAAGAGCCTCAT—3′為內(nèi)參引物，參照說明書標(biāo)準(zhǔn)兩步法程序，退火溫度統(tǒng)一設(shè)置為60 ℃，在Bio-Rad CFX96 Touch熒光定量儀上進行qRT-PCR分析。

使用Bio-Rad CFX Manager 3.1 分析CnDXS2相對表達量變化情況，Microsoft Excel 2016繪制柱狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA提取與CnDXS2克隆

由圖1可知，使用TRIZOL法提取的RNA，28s、18s條帶完整清晰，5s條帶隱約可見，28s RNA條帶亮度為18s RNA 1～2倍，A260/A230在1.8～2.0，A280/A260在1.9～2.1，符合后續(xù)試驗要求。

使用設(shè)計的簡并引物對CnDXS2保守區(qū)進行擴增，得到大小為927 bp的片段；使用特異引物對CnDXS2 3′和 5′進行擴增，得到大小分別為952 bp和918 bp的片段；經(jīng)拼接去除載體片段和重疊區(qū)后，得到全長序列2 370 bp，命名為CnDXS2（GenBank登錄號：KY628417），Vector NTI 11預(yù)測其ORF大小為2 145 bp，編碼714個氨基酸。

2.2CnDXS2生物信息學(xué)分析

2.2.1序列分析。

由圖2可知，經(jīng)NCBI BlastP在線分析，發(fā)現(xiàn)CnDXS2氨基酸含DXP-synthase-N（72～357aa）、TPP-PYR-DXS-TK-like（400～533aa）和Transketolase-C（573～696aa）3個保守結(jié)構(gòu)域，前2個結(jié)構(gòu)域為DXS蛋白典型特征；ProtParam分析其相對分子量為77 007.37 kD，等電點7.17，分子式C3434H5445N947O1009S27，帶負電氨基酸總和（Asp + Glu）：74，帶正電氨基酸總和（Arg+Lys）：73，穩(wěn)定系數(shù)36.46，屬于穩(wěn)定蛋白，總平均親水性-0.068，屬于親水性蛋白；WoLF PSORT II預(yù)測定位于葉綠體，其次是過氧化物酶體，TaegetP 1.1預(yù)測定位于葉綠體（0.262）和線粒體（0.229），與擬南芥DXS2[16]亞細胞定位結(jié)果一致；具有轉(zhuǎn)運肽，分裂位點包含36個氨基酸殘基，不包含信號肽，這與萜類MEP代謝途徑處于質(zhì)體中的結(jié)論相符合；TMHMM預(yù)測無跨膜結(jié)構(gòu)，非膜蛋白，整個肽鏈位于膜外，與DXS基因定位于質(zhì)體中相符合[24]。

2.2.2系統(tǒng)進化分析。

最大似然法是進行系統(tǒng)進化分析的常用方法之一，在替代模型合適的情況下，ML法擁有較好的效果[25-27]。使用MEGA 7軟件[28]對12種茄科植物DXS2基因編碼的氨基酸進行系統(tǒng)進化分析，多序列比對采用ClustalW，根據(jù)最小BIC（Bayesian Information Criterion）值篩選適合最大似然法的氨基酸替代模型為JTT（Jones-Taylor-Thornton）+G（Gamma distribution），Bootstrap設(shè)置為100。由圖3可知，在茄科內(nèi)，夜香樹與煙草屬植物林煙草、煙草等聚為一支，遺傳距離相對較小，親緣關(guān)系近，而與枸杞屬（Lycium）、茄屬（Solanum）親緣關(guān)系相對較遠；節(jié)點支持率高，結(jié)果具有較高的可信度。

CnDXS2與其他科屬13種植物DXS蛋白的系統(tǒng)進化分析如圖4所示，篩選出的替代模型同上。在雙子葉植物中，夜香樹與煙草DXS2蛋白聚為一支，同屬DXS2分支，與單子葉植物玉米（Zea mays L.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）以及擬南芥、煙草、玉米DXS蛋白區(qū)分開來，說明CnDXS2屬于Ⅱ類DXS蛋白的合理性；進化上，推測其同桂花、芝麻、猿麝香親緣關(guān)系較近，同單子葉植物DXS2蛋白親緣關(guān)系最遠。

2.3qRT-PCR分析

由圖5可知，CnDXS2在夜香樹2種組織中均有表達，花中CnDXS2表達量總體低于葉中表達量，隨時間變化表現(xiàn)出一定的規(guī)律性?；ㄖ邢鄬Ρ磉_量14∶00～22∶00逐漸上調(diào)，22∶00至次日14∶00逐漸下調(diào)，最大相差3.59倍。葉中相對表達量4∶00～10∶00逐漸下調(diào)，10∶00～18∶00迅速上調(diào)，18∶00～22∶00急劇下調(diào)，22∶00至次日4∶00逐漸上調(diào)，最大相差20.8倍。

3討論與結(jié)論

萜類化合物是一類廣泛存在于植物的天然化合物，其參與植物生長發(fā)育、逆境響應(yīng)、吸引傳粉者等多個方面的生理活動，具有特殊的生態(tài)學(xué)意義[29]。萜類代謝途徑產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)，以倍半萜種類居多，二萜類以上物質(zhì)一般不具有揮發(fā)性[30-33]。揮發(fā)性單萜、倍半萜，如芳樟醇、羅勒烯、金合歡烯等，是花香物質(zhì)的主要來源，其中，單萜合成的主要途徑為MEP代謝途徑[7，34-35]。通過超表達代謝途徑上游的基因，增加前體合成量，從而提高目的成分的合成是花香基因工程常用的方式之一，超表達DXS、DXR、HMGR等萜類代謝途徑關(guān)鍵限速酶可以提高萜類物質(zhì)的合成量[7，36-38]，但也存在共抑制、其他代謝途徑產(chǎn)品增加等問題，需要更進一步的研究。

該研究克隆了夜香樹萜類代謝途徑關(guān)鍵酶DXS2基因，命名為CnDXS2。生物信息學(xué)分析顯示，CnDXS2蛋白含有DXS蛋白常見的DXP-synthase-N、TPP-PYR-DXS-TK-like、Transketolase-C保守結(jié)構(gòu)域，說明其在進化中較為保守；理化性質(zhì)方面，CnDXS2蛋白除理論等電點高于7外，分子量、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)等都與楊瀅[39]總結(jié)的范圍相符合，說明不同植物中DXS蛋白的理化性質(zhì)較為接近，為后續(xù)蛋白性質(zhì)的分析、分離、定位等提供指導(dǎo)；系統(tǒng)進化分析表明，在茄科中，CnDXS2與茄科煙草屬DXS2蛋白親緣關(guān)系較近，在植物DXS蛋白中，與雙子葉植物DXS2聚為一類，可能屬于Ⅱ類DXS蛋白，親緣關(guān)系上與同為唇形目桂花、芝麻DXS2等較為接近。從表達量來看，CnDXS2在花中的表達量夜間明顯高于白天，在22∶00表達量最高，與MEP代謝途徑下游基因CnLIS表達高峰以及大致趨勢接近，具有節(jié)律性，同為夜間放香的茉莉[Jasminum sambac（L.）Ait]JsDXS[40]具有相似的表達趨勢，也符合呂恃衡[23]得出的花香在8∶00～11∶00最濃的結(jié)論，推測其變化可能與花香的夜間釋放有關(guān)；葉中表達量總體上高于花中表達量，可能與葉綠體含量高有關(guān)[41]，表達量呈現(xiàn)較為明顯的波動情況，可能存在光[42]、生物鐘[43]等其他控制因素，還有待于進一步研究。

目前，關(guān)于DXS基因家族的研究以DXS1居多，DXS2時間表達及功能、調(diào)控的研究相對較少。表達量在空間上以嫩葉[44-45]、花[46]居多；時間上呈現(xiàn)節(jié)律性，如桂花OfDXS2[46]?；蚬δ苌?，擬南芥DXS2（DXL1）[16]被證明對生長發(fā)育影響不大，番茄DXS2[45]影響腺毛密度，調(diào)節(jié)前體在代謝途徑間的分配等，在不同植物中具有特殊作用。CnDXS2是否具有新的功能以及是否能在花香基因工程中起重要作用，仍需要后續(xù)研究。

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