劉晶　張鶴婷　殷悅　陳惠萍

摘要：【目的】探討外源硫化氫（H2S）對干旱脅迫下萌發(fā)水稻種子抗氧化代謝的影響及水稻抗旱性內(nèi)在機(jī)制，為提高水稻抗旱能力提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?.75 mmol/L硫氫化鈉（NaHS）為外源H2S供體，用聚乙二醇（PEG）為干旱脅迫模擬劑，以羥胺（HA）為H2S合成抑制劑，檢測干旱脅迫下外源H2S處理后水稻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）、可溶性蛋白、過氧化氫（H2O2）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性?！窘Y(jié)果】干旱脅迫下，經(jīng)NaHS處理的水稻種子發(fā)芽率為82.30%、發(fā)芽勢為43.10%，均顯著高于未經(jīng)NaHS處理的種子（P<0.05）；可有效阻止水稻種子可溶性蛋白含量減少，降低滲透勢，緩解干旱脅迫引起的傷害；可有效緩解水稻種子中H2O2的累積，有利于減緩細(xì)胞衰老和解體；可較好地維持水稻種子萌發(fā)過程中質(zhì)膜的穩(wěn)定性，有利于減輕干旱引起的傷害；可有效降低水稻種子的MDA含量，降低質(zhì)膜透性；可促進(jìn)水稻種子萌發(fā)過程中SOD、POD、CAT和APX活性的增加，提高萌發(fā)水稻種子應(yīng)對干旱的能力。【結(jié)論】經(jīng)外源H2S供體NaHS處理可顯著提高水稻種子的抗氧化酶活性，有效清除活性氧，降低質(zhì)膜透性，緩解氧化傷害，提高水稻種子的抗旱性，最終有效促進(jìn)干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)。

關(guān)鍵詞： 水稻種子；干旱脅迫；萌發(fā)；硫化氫（H2S）；抗氧化代謝

中圖分類號(hào)： S511.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）01-0031-07

Abstract：【Objective】The effects of exogenous hydrogen sulfide（H2S） on antioxidant metabolism of rice seeds germinated under drought stress and intrinsic mechanism of rice drought resistance were explored，so as to provide reference for improving drought resistance of rice. 【Method】0.75 mmol/L hydrosulfide sodium was used as exogenous H2S donor，polyethylene glycol（PEG） as the drought stress simulated agent， and hydroxylamine（HA） as H2S synthesis inhibitor. Germination rate，germination potential，relative conductivity，malondialdehyde（MDA），soluble protein content，hydrogen peroxide content（H2O2）， superoxide dismutase（SOD） activity，catalase（CAT） activity，peroxidase（POD） activity and ascorbate peroxidase（APX） activity of rice seeds treated with exogenous H2S under drought stress were determined. 【Result】The germination rate and germination potential of rice seeds treated with NaHS were 82.30% and 43.10% respectively， which were significantly higher than those of untreated seeds（P<0.05）. Exogenous H2S could effectively prevent the soluble protein content of rice seeds under drought stress from decreasing， lower osmotic potential， alleviate the harm caused by drought stress. It could effectively alleviate H2O2 accumulation in rice seeds， which helped to slow down cell senescence and disintegration. It also better maintained the stability of plasma membrane of rice seed during germination and alleviate the damage caused by drought. Exogenous H2S effectively reduced MDA content in rice seed， decreased permeability of plasma membrane； it also promoted the increase of SOD activity， POD activity， CAT activity and APX activity of rice during germination， and improved the ability of germinated rice seed countering drought. 【Conclusion】The treatment with exogenous H2S donor NaHS can significantly improve the activity of antioxidant enzymes in rice seeds， effectively remove reactive oxygen， reduce permeability of plasma membrane， alleviate oxidative damage， improve drought resistance of rice seeds， and effectively promote rice seed germination under drought stress finally.

Key words： rice seed； drought stress； germination； hydrogen sulfide（H2S）； antioxidant metabolism

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa L.）是世界第二大糧食作物，全球有近50%的人口以稻米為糧食（Li et al.，2011；劉笑然，2014）。隨著人口的日益增多，全球糧食供不應(yīng)求，提高水稻產(chǎn)量迫在眉睫。干旱是制約水稻生長和產(chǎn)量提高的最主要因素之一，全球作物由于干旱等影響導(dǎo)致減產(chǎn)額超過50%（Riadh et al.，2010）。硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮（Nitric oxide，NO）和一氧化碳（Carbonic oxide，CO）后被發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號(hào)分子（Delledonne，2005），雖在作物體內(nèi)濃度不高，但能有效地提高作物的抗旱性且不會(huì)對作物產(chǎn)生較大毒性（胡樹立，2012；丁會(huì)納等，2016），可利用其作為一種新的農(nóng)業(yè)調(diào)節(jié)手段培育較強(qiáng)抗旱性糧食品種，最終提高糧食產(chǎn)量。因此，研究干旱脅迫下外源H2S對水稻種子萌發(fā)、質(zhì)膜透性、過氧化氫（H2O2）含量及抗氧化酶活性影響的動(dòng)態(tài)變化，對探究增強(qiáng)水稻抗旱性及提高水稻產(chǎn)量的途徑意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來的研究表明，H2S參與調(diào)控植物根的發(fā)育（李東波等，2010）、促進(jìn)光合作用（Chen et al.，2011）、誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉（Liu et al.，2011）和延長保鮮期（Hu et al.，2012）等多重生理過程。在逆境脅迫下，H2S還可提高植物在非生物脅迫下的抗性。逆境脅迫導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）過量產(chǎn)生、滲透壓增大和細(xì)胞損傷，而H2S可通過降低丙二醛（MDA）含量，誘導(dǎo)抗氧化酶活性增強(qiáng)，通過積累脯氨酸和可溶性糖等途徑來緩解脅迫導(dǎo)致的損傷（Shi et al.，2013）。于立旭（2012）研究發(fā)現(xiàn)，外源H2S可緩解逆境脅迫導(dǎo)致的黃瓜生長緩慢狀況，其原因可能是H2S通過改變抗氧化能力和淀粉酶活性來緩解逆境對胚根和胚芽的抑制作用。劉計(jì)允（2014）研究發(fā)現(xiàn)，外源H2S可誘導(dǎo)鹽脅迫下水稻某些抗氧化酶活性上調(diào)表達(dá)，緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化脅迫。Li等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，外源H2S與水楊酸相似，可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性來抵抗高溫脅迫。此外，王燕琴（2011）研究發(fā)現(xiàn)，H2S在鹽脅迫引起苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長過程中通過增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)代謝、維持細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)途徑來削弱鹽害導(dǎo)致的抑制作用，與NO具有相似的緩解效應(yīng)。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對外源H2S處理干旱脅迫下萌發(fā)水稻種子抗氧化能力的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究外源H2S對干旱脅迫下水稻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及MDA含量等抗逆指標(biāo)的影響，為了解水稻抗旱生理機(jī)制及提高水稻抗旱能力提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

水稻雜交種紅泰優(yōu)589由海南南繁種子基地有限公司提供。干旱脅迫模擬劑聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）、H2S合成抑制劑羥胺（Hydroxylamine，HA）及外源H2S供體硫氫化鈉（NaHS）購于Sigma公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2015年10月在海南大學(xué)植物逆境生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇無病蟲害且大小均勻的水稻種子，用0.1%高錳酸鉀進(jìn)行消毒，10 min后用純凈水沖洗多遍至干凈。外源H2S的使用參照肖曼（2012）的方法進(jìn)行。設(shè)5個(gè)培養(yǎng)液處理：處理1以水為對照（CK）；處理2為20% PEG（簡稱PEG，下同）；處理3為20% PEG+0.75 mmol/L NaHS（簡稱PEG+NaHS，下同）；處理4為20% PEG+0.75 mmol/L NaHS+0.50 mmol/L HA（簡稱PEG+ NaHS+HA，下同）；處理5為20% PEG+0.50 mmol/L HA（簡稱PEG+HA，下同）。將種子平均分為5份（每份約1000粒），放入墊有雙層濾紙、直徑12.5 cm的培養(yǎng)皿中擺放整齊，分別加入以上5種培養(yǎng)液10 mL后，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，光照周期16/8 h（晝/夜），光照強(qiáng)度400 μmol/m2·s。每天更換1次培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱時(shí)計(jì)時(shí)為0 d。

1. 3 指標(biāo)觀測

1. 3. 1 發(fā)芽勢和發(fā)芽率測定 各處理發(fā)芽勢以第1 d露白種子所占百分比表示；發(fā)芽率以第6 d累計(jì)露白種子所占百分比表示。

1. 3. 2 生理指標(biāo)測定 取各處理萌發(fā)1～5 d的水稻種子（約25粒），分別測定可溶性蛋白、MDA和H2O2含量及抗氧化酶活性等生理指標(biāo)。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法（侯福林，2004）測定；H2O2含量采用硫酸鈦分光光度法（Patterson et al.，1984）測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法（Fazeli et al.，2007）測定；相對電導(dǎo)率采用浸泡法（李合生，2000）測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法（黃智等，2010）測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法及王成章等（2007）的方法測定，并略有改動(dòng)；過氧化氫酶（CAT）活性參照Nakono和Aasad（1980）的方法測定；抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）活性采用王靜璞等（2008）的方法測定。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0和Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖，用LSD極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同培養(yǎng)液處理干旱脅迫下水稻種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的變化

由表1可知，各處理水稻種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢排序?yàn)镃K>處理3>處理4>處理5>處理2，以CK最高，顯著高于其他處理（P<0.05，下同）；處理3水稻種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著高于處理2、處理4和處理5。說明培養(yǎng)液中加入H2S可顯著促進(jìn)干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)，一定程度上緩解PEG對水稻種子萌發(fā)的抑制作用，而HA對H2S的緩解作用產(chǎn)生抑制作用。

圖1為不同培養(yǎng)液處理后第3 d水稻種子的萌發(fā)生長情況，各處理的萌發(fā)效果依次為CK>處理3>處理4>處理5>處理2，與發(fā)芽率和發(fā)芽勢的排序一致。

2. 2 不同培養(yǎng)液處理干旱脅迫下水稻種子可溶性蛋白含量的變化

從圖2可看出，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，不同培養(yǎng)液處理萌發(fā)水稻種子的可溶性蛋白含量均呈下降趨勢；同一處理時(shí)間均以CK的可溶性蛋白含量最高，處理3次之，二者均顯著高于處理2、處理4和處理5，處理2、處理4和處理5間差異不顯著（P>0.05，下同）。說明培養(yǎng)液中加入外源H2S可有效阻止干旱下水稻種子可溶性蛋白含量減少，而HA能抑制H2S對干旱的緩解作用。

2. 3 不同培養(yǎng)液處理干旱脅迫下水稻種子H2O2含量的變化

從圖3可看出，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，不同培養(yǎng)液處理萌發(fā)水稻種子積累的H2O2含量均呈上升趨勢，其中，處理后第1 d各處理的H2O2含量間差異不顯著；處理后第2 d開始處理2的H2O2含量明顯或顯著高于其他處理，第5 d達(dá)最高值，顯著高于其他處理，說明干旱脅迫可使水稻種子H2O2含量明顯或顯著增加；處理后第4～5 d，處理3的H2O2含量雖然顯著高于CK，但均顯著低于處理2、處理4和處理5，說明外源H2S可有效地緩解干旱脅迫水稻種子中H2O2的累積，有利于減緩細(xì)胞衰老和解體。

2. 4 不同培養(yǎng)液處理干旱脅迫下水稻種子相對電導(dǎo)率和MDA含量的變化

從圖4-A可看出，同一處理時(shí)間萌發(fā)水稻種子的相對電導(dǎo)率均以CK最低，處理3次之，處理2最高，三者間存在顯著差異，而處理2、處理4和處理5間差異不顯著，說明干旱條件下加入外源H2S處理的水稻種子相對電導(dǎo)率較低，可較好地維持干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)過程質(zhì)膜的穩(wěn)定性，有利于減輕干旱傷害。

從圖4-B可看出，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，不同培養(yǎng)液處理萌發(fā)水稻種子的MDA含量均呈上升趨勢，其中，處理后第1～5 d處理3和CK的MDA含量均較低，二者差異不顯著，處理2的MDA含量最高，處理5和處理4次之，三者均顯著高于處理3和CK；處理后第1 d處理2、處理4和處理5的MDA含量差異不顯著，處理后第2～5 d處理2的MDA含量均顯著高于處理4和處理5，而處理4與處理5差異不顯著。說明干旱脅迫下外源H2S處理可有效降低水稻種子的MDA含量，HA會(huì)抑制外源H2S緩解水稻種子MDA含量升高的作用。

2. 5 不同培養(yǎng)液處理干旱脅迫下水稻種子抗氧化酶活性的變化

從圖5-A可看出，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，不同培養(yǎng)液處理萌發(fā)水稻種子的SOD活性均呈先升后降變化趨勢，但變幅較小；同一處理時(shí)間（除處理后第4 d外）SOD活性的高低依次為CK>處理3>處理2>處理4>處理5。其中，CK的SOD活性顯著高于處理3，二者的SOD活性顯著高于處理2、處理4和處理5；處理后第1～3 d，處理2、處理4和處理5間的SOD活性差異顯著，處理后第4～5 d，處理2與處理4的SOD活性差異不顯著，二者顯著高于處理5。說明培養(yǎng)液中添加H2S能促進(jìn)干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)過程中SOD活性的增加，而HA起抑制H2S促進(jìn)SOD活性增加的作用。

從圖5-B和圖5-C可看出，POD和CAT的活性變化相似，均呈先升高后降低再升高的變化趨勢，分別在處理后第3 d和第2 d達(dá)峰值；處理2～處理5的POD和CAT活性均顯著低于CK；處理3的POD和CAT活性顯著高于處理2、處理4和處理5；處理5的POD和CAT活性顯著低于處理2～處理4。說明外源H2S有助于提高干旱脅迫下萌發(fā)水稻種子中的POD和CAT活性，而HA起抑制H2S促進(jìn)POD和CAT活性提高的作用。

從圖5-D可看出，干旱脅迫后第1～5 d各處理的APX活性均呈下降趨勢，且以CK的APX活性最高，處理3次之，二者差異顯著，但顯著高于處理2、處理4和處理5；處理5的APX活性顯著低于處理2和處理4，處理2與處理4差異不顯著。說明干旱脅迫下外源H2S可提高萌發(fā)水稻種子的APX活性，而HA起抑制H2S促進(jìn)APX活性提高的作用。

3 討論

萌發(fā)是種子生長發(fā)育的起始階段，水分在這個(gè)階段發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫可顯著降低水稻種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，加入外源H2S供體NaHS可顯著緩解干旱脅迫對水稻種子萌發(fā)的影響，發(fā)芽率和發(fā)芽勢得到有效提高；加入NaHS的合成抑制劑HA會(huì)降低水稻種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，說明NaHS可緩解干旱對水稻種子萌發(fā)的抑制作用，促進(jìn)種子萌發(fā)。

可溶性蛋白可幫助調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢，滲透勢隨可溶性蛋白含量的增高而逐步降低，對脅迫引起的傷害起緩解作用。孫國榮等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，白樺實(shí)生苗葉片的可溶性蛋白含量隨著干旱脅迫程度的加深逐步降低；胡樹立（2012）研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2S處理后草莓果實(shí)的可溶性蛋白含量隨貯藏時(shí)間的增加而逐步上升，未經(jīng)任何處理草莓果實(shí)的可溶性蛋白含量隨貯藏時(shí)間的增加逐步下降。本研究結(jié)果與其相似，不同培養(yǎng)液處理水稻種子的可溶性蛋白含量均隨處理時(shí)間延長呈不同程度的下降趨勢，PEG+NaHS處理水稻種子的可溶性蛋白含量降幅較小，且在同一處理時(shí)間經(jīng)外源H2S處理萌發(fā)水稻種子的可溶性蛋白含量下降趨勢有所緩解，證實(shí)NaHS可促進(jìn)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成或減緩蛋白質(zhì)分解，最終減緩蛋白質(zhì)含量的降低速率。

植物體內(nèi)的活性氧代謝面臨逆境時(shí)會(huì)迅速加強(qiáng)，導(dǎo)致累積大量的H2O2，H2O2氧化細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，損害細(xì)胞膜，從而加速細(xì)胞解體（周春麗等，2011）。Zhang等（2010）研究證實(shí)，H2S可有效減少大豆干旱脅迫下H2O2的累積，本研究結(jié)果與其相似，干旱脅迫下經(jīng)NaHS處理萌發(fā)水稻種子的H2O2含量明顯減少，說明外源H2S處理可降低干旱脅迫下植物體內(nèi)H2O2的累積、保護(hù)細(xì)胞、緩解干旱脅迫帶來的傷害。

柏桂生（2012）研究發(fā)現(xiàn)，H2S可降低Cd脅迫下小麥種子的質(zhì)膜透性。本研究結(jié)果同樣表明H2S可降低干旱脅迫下水稻種子的膜透性。本研究中干旱脅迫下萌發(fā)水稻種子的相對電導(dǎo)率明顯升高，說明細(xì)胞膜透性增大，而經(jīng)外源H2S處理后，其相對電導(dǎo)率有所下降，表明外源H2S在一定程度上可保護(hù)細(xì)胞膜透性，避免細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲。

MDA作為植物器官逆境下的膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量的高低直接反映機(jī)體脂質(zhì)的過氧化程度，間接地反映細(xì)胞的損傷程度（陳正剛等，2014）。前人研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下NaHS處理小麥（吳單華等，2013）、玉米（Li et al.，2013）幼苗中的MDA含量上升幅度始終低于未經(jīng)NaHS處理，且MDA含量隨著高溫脅迫時(shí)間延長而逐漸上升，本研究結(jié)果與其相似，干旱脅迫下各處理水稻種子的MDA含量不斷增加，水稻細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度隨脅迫時(shí)間延長而加深，以PEG+NaHS處理的MDA含量顯著低于PEG處理，說明外源H2S可減弱干旱導(dǎo)致的質(zhì)膜過氧化作用，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生并降低對植物的傷害，緩解干旱脅迫的不利影響。

SOD、POD、CAT和APX是細(xì)胞抵御活性氧傷害的酶保護(hù)系統(tǒng)，可清除植物體內(nèi)多余的活性氧、控制膜脂過氧化作用，從而保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，使植物減輕甚至免受逆境脅迫的傷害，H2S可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性最終清除活性氧（Luo et al.，2015）。本研究通過檢測水稻種子SOD、POD、CAT和APX的活性，證實(shí)外源H2S可顯著提高萌發(fā)水稻種子應(yīng)對干旱的能力。在清除活性氧的整個(gè)系統(tǒng)中，SOD負(fù)責(zé)把超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，但其活性變化不明顯，推測是超氧陰離子的數(shù)量未因?yàn)橥庠碒2S的加入而減少，而參與清除H2O2的CAT和POD活性產(chǎn)生了顯著變化，PEG+NaHS處理的酶活性較高，證明在干旱脅迫下外源H2S能使清除H2O2的酶類活性顯著提高。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，脅迫超出了細(xì)胞承受的程度，所有抗氧化酶的活性均呈下降趨勢。但由于外源H2S的參與，抗氧化酶活性下降的時(shí)間延遲，說明加入外源H2S后細(xì)胞受傷害程度得到一定的緩解。當(dāng)然，對于抗氧化酶在不同情況下的變化規(guī)律還需從分子應(yīng)答的角度，結(jié)合植物體內(nèi)活性氧濃度的變化來進(jìn)行深入探究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，外源H2S供體NaHS處理干旱脅迫下水稻種子的萌發(fā)效果較佳，表明外源H2S在干旱脅迫下可通過提高水稻種子CAT、POD、SOD和APX等抗氧化酶的活性，解除對可溶性蛋白合成的抑制，緩解其分解速度，提高蛋白質(zhì)在種子中的含量，在一定程度上減少H2O2對細(xì)胞的氧化作用，抑制質(zhì)膜透性增加，并降低MDA含量，從而提高水稻種子的抗旱性。

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（責(zé)任編輯 思利華）