劉景坤 賈明明 武春媛 鄧曉 鄒雨坤 李怡 李勤奮

摘 要 為殺滅甘蔗葉殘留病原菌且不對(duì)農(nóng)田土壤造成藥害，實(shí)現(xiàn)甘蔗葉的健康安全還田，開(kāi)展了甘蔗葉堆肥中常用3種殺菌劑殘留動(dòng)態(tài)研究。選擇多菌靈、戊唑醇、吡唑醚菌酯3種常用殺菌劑添加到甘蔗葉堆肥中，設(shè)置3個(gè)濃度5、20、50 μg/g，分別在40、50、60 ℃下進(jìn)行堆肥；首先優(yōu)化液質(zhì)聯(lián)用參數(shù)，建立3種殺菌劑同時(shí)檢測(cè)的方法，然后對(duì)降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，3種殺菌劑在0.005～0.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2>0.999，0.1、2.0、40.0 μg/g 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率均在80%～105%之間，RSD<10%，方法準(zhǔn)確性和精密度良好。相同初始添加濃度時(shí)，3種殺菌劑在40 ℃時(shí)降解最快，表現(xiàn)為40 ℃>50 ℃（60 ℃）；同等溫度下，當(dāng)初始添加量增加時(shí)，降解速率減慢，相同初始添加濃度下降解速率隨溫度變高先減慢后加快；改變初始添加量對(duì)降解速率的影響更大。多菌靈降解速率明顯快于其他兩種殺菌劑，初始添加濃度20 μg/g時(shí)半衰期為18 d左右，可以添加用來(lái)堆肥殺菌；戊唑醇和吡唑醚菌酯初始添加濃度20 μg/g時(shí)半衰期大于50 d。

關(guān)鍵詞 甘蔗葉堆肥；殺菌劑；降解動(dòng)態(tài)；液質(zhì)聯(lián)用

中圖分類(lèi)號(hào) S481.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

The Degradation Dynamics of Three Types of

Common Fungicides in Sugarcane

Leaves Composting

LIU Jingkun1，2， JIA Mingming1，3， WU Chunyuan1，2， DENG Xiao1，2，

ZOU Yukun1，2， LI Yi1，2， LI Qinfen1，2 *

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Danzhou Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan， 571737， China

3 Huazhong Agriculture University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract The degradation dynamic of three types of common fungicides in sugarcane was researched in order to return sugarcane leaves to soil safely after the pathogen in the leaf was killed. Three concentration levels of the pesticides including carbendazim， tebuconazole and pyraclostrobin 5 μg/g， 20 μg/g and 50 μg/g were added in the compost and incubated at the temperature 40 ℃， 50 ℃ and 60 ℃， repeated three times. The degradation dynamics were researched after the detection method was developed. The results showed that the standard calibration curves with R2 more than 0.999 were developed， which showed good linear relationship from 0.005 μg/mL to 0.2 μg/mL. The results of spiked recovery in the range 80%-105% with the RSDs less than 10% in the level 0.1 μg/g，2.0 μg/g and 40.0 μg/g showed the good accuracy and precision. At the same initial concentrations， the pesticides at 40 ℃ had the most rapid degradation than that under 50 ℃ and 60 ℃. At the same temperature the higher concentration pesticides had a less rapid degradation rate and at the same concentration， there was a slower degradation rate at first and more rapid later on with the temperature rise from 40 ℃ to 60 ℃. The change of initial concentration gave the degradation greater effects. The carbendazim with the shortest half-life in the sugarcane leaves composting left half only 18 days later under 50 ℃， which was suitable for killing pathogens. On the other hands， the half-life of tebuconzole and difenoconazole was more than 50 days when the initial concentration was 20 μg/g.

Key words sugarcane leaves composting； fungicide； degradation dynamic； LC-MS/MS

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.023

甘蔗（Saccharum officenarum L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是重要的糖料和能源作物，在南方熱區(qū)廣泛種植。甘蔗收獲后葉子通常是丟棄或者焚燒處理，不僅造成資源浪費(fèi)和污染環(huán)境，還易引發(fā)火災(zāi)，存在安全隱患。將甘蔗葉堆肥后還田是一種節(jié)約資源，改善土壤質(zhì)地的有效方式，但還田蔗葉中的多種病原菌有利于病害的傳播和爆發(fā)，因此有必要采取適當(dāng)?shù)姆绞皆谶€田之前對(duì)病原菌進(jìn)行殺滅，實(shí)現(xiàn)健康還田。在甘蔗葉堆肥中添加適量的常用殺菌劑能夠殺滅病原菌，減輕甘蔗病害發(fā)生，實(shí)現(xiàn)甘蔗葉的健康安全還田。

甘蔗種植過(guò)程中常見(jiàn)的病害主要有黑穗病、鳳梨病、梢腐病等[1-2]，多菌靈、戊唑醇、吡唑醚菌酯等殺菌劑是防治甘蔗病害的常用藥[3-6]，這幾種農(nóng)藥在其他作物病蟲(chóng)害防治中的降解動(dòng)態(tài)已有報(bào)道[7-10]，但在甘蔗葉堆肥中的殘留動(dòng)態(tài)研究未見(jiàn)報(bào)道，而且農(nóng)藥殘留在土壤以及作物中的降解動(dòng)態(tài)相比于堆肥中，光照、溫度、濕度、與外界氣體交換等各種條件均差異較大，可以參考的文獻(xiàn)較少，因此，筆者對(duì)3種常用殺菌劑在甘蔗葉堆肥中的殘留動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究，以期為甘蔗葉堆肥安全還田提供可行的技術(shù)方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及試劑 98%多菌靈原藥、98%吡唑醚菌酯購(gòu)自百靈威公司，乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，99%戊唑醇原藥、氨水和甲酸購(gòu)自阿拉丁公司，固相萃取（SPE）柱、PSA凈化管購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂等均為分析純購(gòu)自國(guó)藥公司化學(xué)試劑廠，超純水為自制，甘蔗葉收集自實(shí)驗(yàn)基地曬干打碎后使用。

1.1.2 儀器 液質(zhì)聯(lián)用儀（TQS-Micro，美國(guó)Waters公司），超聲波清洗器（T18，德國(guó)IKA公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-215，瑞士Buchi公司）。

1.2 方法

1.2.1 3種殺菌劑檢測(cè)方法 采用超聲提取、PSA凈化管的方法進(jìn)行凈化，優(yōu)化液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法參數(shù)建立同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵甘蔗葉中3種殺菌劑含量的方法。

（1）3種殺菌劑定量、定性離子的選擇及參數(shù)優(yōu)化。采用直接進(jìn)樣方式選擇3種殺菌劑響應(yīng)值最強(qiáng)的離子為定量離子，次強(qiáng)的為定性離子，多菌靈、戊唑醇、吡唑醚菌酯的定量離子分別為160、308、296，定性離子分別為192、70、194；并對(duì)其進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，使相應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最高值水平，結(jié)果如表1所示。

（2）液相及質(zhì)譜條件。3種殺菌劑使用液質(zhì)聯(lián)用同時(shí)檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈和水（0.05%氨水，0.01%甲酸），流速為0.4 mL/min，HSS C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），采用梯度洗脫方式進(jìn)行（表2）；質(zhì)譜采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行，使用電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓均為+3 200 V，霧化氣壓力103.425 kPa，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速800 L/h。

（3）標(biāo)準(zhǔn)校正曲線建立。使用MRM方式進(jìn)行掃描，外標(biāo)法進(jìn)行定量，建立3種殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，標(biāo)液系列濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μg/mL。

（4）提取與凈化。稱(chēng)取10.0 g樣品，加入80.0 mL乙腈為提取溶劑，超聲提取30 min，過(guò)濾至含有6.0 g氯化鈉的具塞試管中，加塞密閉后劇烈震蕩1 min，靜置分層后取上清加入PSA凈化管（PSA+無(wú)水硫酸鎂），搖勻后取上清并加入等體積的水，過(guò)0.22 μm膜，上機(jī)檢測(cè)。

（5）加標(biāo)回收試驗(yàn)。取10.0 g空白樣品，加入3種殺菌劑的母液，根據(jù)降解初始階段和降解率達(dá)到90%時(shí)的理論濃度水平，使其最后濃度分別為0.1、2.0、40.0 μg/g，靜置3 h后按上述步驟提取與凈化步驟處理，最后加入乙腈/水（V/V=1 ∶ 1）進(jìn)行稀釋?zhuān)脴?biāo)曲進(jìn)行標(biāo)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，每個(gè)濃度水平3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 3種殺菌劑在甘蔗葉堆肥中的降解 根據(jù)已有甘蔗葉的碳氮比數(shù)據(jù)，將粉碎的甘蔗葉加入溶解有尿素的純水，使碳氮比達(dá)到30、水分含量為60%有利于發(fā)酵，設(shè)置3個(gè)培養(yǎng)溫度，40、50、60 ℃，3個(gè)初始添加濃度5、20、50 μg/g，進(jìn)行避光培養(yǎng)，定期取樣分析，使降解率在20%～80%之間至少有6個(gè)檢測(cè)點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的建立

2.1.1 3種殺菌劑的質(zhì)譜圖 采用梯度洗脫的方式和優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行分析，建立3種殺菌劑在甘蔗葉堆肥中同時(shí)檢測(cè)的方法，定量離子流和定性離子流圖如圖1，分離度高，峰形良好，能準(zhǔn)確積分。

2.1.2 3種殺菌劑的校準(zhǔn)曲線 采用MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式）進(jìn)行掃描，外標(biāo)法進(jìn)行定量，得到3種殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，3種殺菌劑在0.005～0.2 μg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均超過(guò)0.999（圖2）。

2.1.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 0.1、2.0、40.0 μg/g 3個(gè)濃度水平加標(biāo)能夠代表3個(gè)初始添加量及降解過(guò)程中殺菌劑殘留的濃度水平，按照前處理步驟使用優(yōu)化的檢測(cè)方法，所得回收率如表3所示。3個(gè)添加濃度水平的回收率位于80%～100%之間，其中0.1 μg/g添加水平的回收率相對(duì)較高，位于95%～100%之間，方法整體準(zhǔn)確度較高，滿(mǎn)足農(nóng)殘檢測(cè)有關(guān)加標(biāo)回收率的要求。

2.2 降解動(dòng)態(tài)

樣品的不同培養(yǎng)溫度，殺菌劑的不同初始添加濃度下的降解半衰期不同[11-16]（表4）。從表4明顯可以看出，多菌靈較戊唑醇和吡唑醚菌酯的降解周期短，40 ℃時(shí)初始添加量為5 μg/g時(shí)，多菌靈半衰期為7.7 d，吡唑醚菌酯半衰期為17.8 d，而戊唑醇半衰期為26.3 d；初始添加量為20、50 μg/g時(shí)，多菌靈半衰期分別為14.8、17.7 d，吡唑醚菌酯和戊唑醇半衰期均超過(guò)50 d。增加初始溫度到50 ℃時(shí)3種農(nóng)藥半衰期略有增加，增加到60 ℃時(shí)，半衰期比50 ℃略有縮短。增加初始濃度，3種農(nóng)藥半衰期均增長(zhǎng)，增加到20 μg/g以上時(shí)，戊唑醇和吡唑醚菌酯半衰期都超過(guò)了50 d，增加幅度較為明顯。說(shuō)明溫度和初始添加量對(duì)3種殺菌劑的降解周期均有較大影響。

2.2.1 不同溫度下的降解動(dòng)態(tài) 殺菌劑在樣品體系中的降解主要有微生物降解、水解等，受微生物數(shù)量、溫度等因素的影響。多菌靈初始添加量為5 μg/g時(shí)，40 ℃時(shí)半衰期為7.7 d，較50 ℃時(shí)降解快，60 ℃時(shí)半衰期為7.1 d。在較低添加量時(shí)，40 ℃較適宜微生物的生長(zhǎng)繁殖，增加了微生物的數(shù)量，較50 ℃時(shí)降解快，60 ℃時(shí)與50 ℃時(shí)相比，雖然溫度升高微生物生長(zhǎng)受到抑制但水解等化學(xué)因素的降解逐漸加快，使得半衰期變短；戊唑醇和吡唑醚菌酯在添加量較低時(shí)具有相同趨勢(shì)，初始添加量較高時(shí)戊唑醇和吡唑醚菌酯整體降解都很慢。

2.2.2 不同初始濃度下的降解動(dòng)態(tài) 3種殺菌劑在高添加濃度時(shí)明顯較低添加濃度時(shí)降解周期長(zhǎng)。40 ℃時(shí)，多菌靈在初始添加量為5 μg/g時(shí)半衰期為7.7 d，20、50 μg/g時(shí)則分別為14.8、17.7 d；同樣，戊唑醇和吡唑醚菌酯初始添加量為20、50 μg/g時(shí)半衰期過(guò)長(zhǎng)（實(shí)驗(yàn)期限內(nèi)無(wú)法獲得），明顯較添加量為5 μg/g時(shí)半衰期長(zhǎng)。分析是殺菌劑初始添加量增加時(shí)，微生物繁殖受到抑制，微生物降解速率變慢所致。

3 討論

超聲和勻漿是農(nóng)藥提取時(shí)常用的2種方法，相對(duì)于勻漿提取，超聲法具有能夠一次提取批量樣品，提取效率高；不用人員操作，對(duì)分析檢測(cè)人員毒性較??；不用清洗勻漿器，不會(huì)產(chǎn)生交叉污染等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此，完全能夠取代勻漿提取。PSA凈化相對(duì)于傳統(tǒng)的固相萃取小柱不用經(jīng)過(guò)活化淋洗等諸多步驟、加快了凈化速度、減少了有機(jī)溶劑使用種類(lèi)、降低了對(duì)分析檢測(cè)人員危害，因此，采用超聲提取加PSA凈化方法進(jìn)行前處理。

文獻(xiàn)[17-22]報(bào)道的關(guān)于農(nóng)藥殘留的降解以及在作物中的降解動(dòng)態(tài)，如光解、水解、土壤降解等均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，均是在自然狀態(tài)或接近自然狀態(tài)下進(jìn)行，而且因素之間互作較少；在甘蔗葉中進(jìn)行發(fā)酵，溫度濕度相對(duì)較高，對(duì)微生物生長(zhǎng)和種群數(shù)量產(chǎn)生影響，發(fā)酵空間密閉，空氣消耗和農(nóng)藥添加濃度對(duì)微生物均會(huì)產(chǎn)生不同于降解動(dòng)態(tài)研究中的影響，而且微生物的生長(zhǎng)繁殖和種群數(shù)量的變化也會(huì)對(duì)農(nóng)藥的降解速率產(chǎn)生影響。

相同的農(nóng)藥初始添加量、樣品量及相同的培養(yǎng)條件時(shí)，如果只有熱量和水分等因素的影響，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)隨溫度升高而加快的規(guī)律，幾種殺菌劑理論降解速率應(yīng)為60 ℃>50 ℃>40 ℃，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果為40 ℃>50 ℃（60 ℃）不相符，說(shuō)明除了化學(xué)降解外還存在別的因素，生物因素是其中最重要的一個(gè)方面[22-26]，推測(cè)原因是40 ℃時(shí)微生物代謝繁殖最為旺盛，種群數(shù)量增加加快了降解過(guò)程，50 ℃和60 ℃時(shí)微生物生長(zhǎng)繁殖受到抑制，降解速率變慢。相同溫度下，藥劑初始添加濃度越高降解速率越慢，推測(cè)原因是添加濃度過(guò)大導(dǎo)致微生物的生長(zhǎng)受到農(nóng)藥的抑制，降低了降解速率。與作物生產(chǎn)時(shí)噴施的農(nóng)藥處于自然狀態(tài)下不同[11-16]，堆肥在密閉環(huán)境中，而且溫度與自身體系有關(guān)，與外界不一致，微生物、農(nóng)藥、溫度之間存在相互影響，降解不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

雖然3種藥劑對(duì)甘蔗病害均有較好的防治效果[3-6]，但是降解速率差別較大，甘蔗葉堆肥過(guò)程中溫度一般在50 ℃左右，多菌靈初始添加濃度20 μg/g時(shí)半衰期18 d左右，至堆肥完成農(nóng)藥降解至較低濃度水平，可以添加用來(lái)堆肥殺菌；戊唑醇和吡唑醚菌酯初始添加濃度20 μg/g時(shí)半衰期大于50 d，堆肥中會(huì)有較大濃度的殘留。所以，在堆肥中需要選擇合適的農(nóng)藥種類(lèi)以及添加合適濃度的農(nóng)藥用來(lái)滅菌，才能保證在堆肥完成后肥料中的農(nóng)藥殘留完全降解或者降解到很低水平，以免造成藥害或者加重農(nóng)田環(huán)境污染。

堆肥持續(xù)時(shí)間約50 d，溫度50 ℃左右，使用多菌靈降解最快，至堆肥結(jié)束，肥料中殘留的農(nóng)藥含量水平低，還田不會(huì)造成污染。

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