楊正安 周麗英 付忠 高婷 趙凱 張杰 丁玉梅

摘 要 為探究白皮、綠皮、花皮3種黑籽南瓜對枯萎病菌抗病能力差異，本研究測定枯萎病菌脅迫下3種黑籽南瓜的氣體交換參數、葉綠素熒光參數、抗氧化系統(tǒng)、丙二醛（MDA）的變化。結果表明：當受到枯萎病菌侵染后，3種黑籽南瓜的氣體交換參數均出現不同程度的降低，白皮黑籽南瓜呈現大幅下降；花皮黑籽南瓜的Fv′/Fm′和綠皮黑籽南瓜ΦPSII、qP上升，而白皮黑籽南瓜均表現下降，同時白皮黑籽南瓜qN和NPQ顯著下降，綠皮黑籽南瓜下降幅度最??；在抗氧化系統(tǒng)中白皮黑籽南瓜過氧化物酶（POD）活性增大，花皮黑籽南瓜減小，但花皮黑籽南瓜超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著增大；綠皮和白皮黑籽南瓜MDA含量升高，而花皮黑籽南瓜顯著下降。研究發(fā)現：正常生長的白皮黑籽南瓜具有較高的光合能力，但其對枯萎病菌的抵抗力較弱，綠皮和花皮黑籽南瓜的抗病性強于白皮黑籽南瓜。

關鍵詞 枯萎?。缓谧涯瞎?；光合參數；抗氧化酶活性；MDA

中圖分類號 S642.1 文獻標識碼 A

Response of Three Cultivated Varieties of Cucurbita

ficifotia to Fusarium Wilt

YANG Zhengan1， ZHOU Liying1， FU Zhong2， GAO Ting1，

ZHAO Kai1， ZHANG Jie1， DING Yumei3，4 *

1 College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agriculture University， Kunming， Yunnan 650201， China

2 Kingenta Ecological Engineering Group Co. Ltd.， Linyi， Shandong 276700， China

3 Biotechnology and Germlasm Institue， Yunnan Academy of Agriculture Science， Kunming， Yunnan 650223， China

4 School of Horticulture and Landscape Architecture， Southwest University， Chongqing 400715， China

Abstract The disease resistance of the Fusarium wilt in three cultivated varieties of Cucurbita ficifolia Bouche named‘WhitePpeel，‘Green Peel，‘Green Peel with Whitewas studied. This study measured the gas exchange parameters， chlorophyll fluorescence parameters and antioxidant system， malondialdehyde（MDA）of the three varieties by inoculating the pathogen of the Fusarium wilt. The results showed that the gas exchange parameters of the three varieties reduced with varying degrees， and‘White Peelfell sharply. Fv′/Fm′ of‘Green Peelwith‘White Peeland ΦPSII， qP of‘Green Peelincreased， but‘White Peeldecreased. qN and NPQ of‘White Peeldropped significantly， while‘Green Peelreduced least. Peroxidase（POD）activity of‘White Peelincreased， while that of‘Green Peel with Whitedecreased， but the superoxide dismutase（SOD）activity of‘Green Peel with Whiteincreased significantly. MDA of‘Green Peeland‘White Peelincreased， while that of‘Green Peel with Whitedropped significantly. The study revealed that the normal growth of‘White Peelhad a high photosynthetic capacity， but its resistance to Fusarium wilt was weak， and the resistance to Fusarium wilt of ‘Green Peeland‘Green Peel with Whitewere stronger than‘White peel.

Key words Fusarium wilt； Cucurbita ficifotia； photosynthetic parameters； antioxidant enzyme activity； MDA

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.025

我國是黃瓜、西瓜和甜瓜等葫蘆科瓜類生產和消費大國，在世界瓜類種植中占有十分重要地位[1]。瓜類枯萎病是由鐮孢屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）寄生引起的一種真菌性土傳病害，病原菌從根部侵染植物，通過堵塞導管和分泌有毒物質為害寄主，造成葉片萎蔫和全株枯萎死亡。一般減產20%～30%，嚴重時可達50%～60%，甚至絕收[2]?？菸∫殉蔀橛绊懭蚬项惼焚|和產量的重要病害且被國際社會所關注[3-4]。對于枯萎病的防治措施有輪作、嫁接及藥劑防治等。由于土地資源限制輪作方法實施不易；化學藥劑防治產生農藥污染、抗藥性及殘留等，因此，選擇優(yōu)良的嫁接砧木，是目前最行之有效的方法之一[5-7]。黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia）是南瓜屬的一年或多年生草本藤蔓性植物，其對低溫、干旱、貧瘠土壤尤其是瓜類枯萎病等逆境有較強的抗性，是嫁接黃瓜、西瓜等的良好砧木[8]。近年來，種用黑籽南瓜總產量達萬余噸，總產值也達3.2億元，生產上的用種也從野生狀態(tài)變?yōu)榱巳斯ぴ耘?，由于不注意提純復壯，致使黑籽南瓜品種退化，降低或失去原有的抗性[9-10]。

黑籽南瓜田間有3種表現類型，即“綠皮”、“白皮”、“綠皮花紋”3種（以下簡稱：綠皮南瓜、白皮南瓜、花皮南瓜），并且通過調查發(fā)現田間表現抗病能力不同。目前關于黑籽南瓜的研究很少，本實驗首次系統(tǒng)比較了枯萎病菌脅迫下3種不同抗性的黑籽南瓜氣體交換參數、葉綠素熒光參數、抗氧化系統(tǒng)、丙二醛（MDA）等生理生化的變化，為高抗材料的篩選和利用提供參考，同時為開發(fā)和利用黑籽南瓜中優(yōu)異的基因資源提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試黑籽南瓜品種 綠皮南瓜、白皮南瓜、花皮南瓜3種黑籽南瓜種子來自云南省昆明市呈貢區(qū)王家營村，對枯萎病抗性由強至弱依次是：花皮南瓜、綠皮南瓜>白皮南瓜。

1.1.2 供試基質 實驗營養(yǎng)土，廣州市生升農業(yè)有限公司。

1.1.3 供試營養(yǎng)液 采用日本園試通用配方[11]。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法

（1）病原菌孢子懸浮液配制。實驗供試菌株從蒙自市黃瓜主生產區(qū)枯萎病株上得到，由本實驗室分離純化保存。將枯萎病菌種接種到含50 mg/L鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d后取出已培養(yǎng)好的平板菌種，加無菌水配置孢子懸浮液，濃度為1×l06個/mL[12-14]。

（2）接種。供試幼苗準備：將黑籽南瓜種子，浸泡在10%的過氧化氫中處理2 h，然后栽入裝有滅菌營養(yǎng)土的塑料營養(yǎng)缽中種植，放置于28 ℃溫箱中，待出芽后移入溫室大棚中[13-15]。浸根法接種：當3種黑籽南瓜長到兩葉一心時，挑選長勢一致的幼苗，用配制好的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液浸根處理30 min，對照組用等量滅菌水浸根處理30 min，然后栽回營養(yǎng)缽中繼續(xù)培養(yǎng)，每處理重復10次。黑籽南瓜植株用自來水與營養(yǎng)液澆灌。

1.2.2 測定方法

（1）氣體交換參數的測定。選擇晴天上午外界環(huán)境相對穩(wěn)定的9 ： 00～11 ： 30，采用Li-6400XT（Li-cor， Lincoln， USA）便攜式光合測量系統(tǒng)測定葉片氣體交換參數。測定前，利用儀器自帶的光源設定PFD為1 000 μmol/（m2·s），控制參比室CO2濃度為（400±0.5）μmol/mol，葉溫（25±1）℃；測定時，先將葉片夾入葉室，在所設置條件下穩(wěn)定10 min，而后記錄所測葉片的凈光合速率（Pn），同時記錄對應氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr），為消除時間上的誤差，每個處理測量7株，且每次重復測定時各處理間采取隨機測定方法，測定后將測量的葉片做好標記。

（2）葉綠素a熒光參數的測定。葉綠素a熒光參數用Li-6400XT（Li-cor， Lincoln， USA）便攜式光合熒光測量系統(tǒng)進行測定。為使葉片充分暗適應，在天氣晴朗的凌晨4 ： 00～6 ： 00，測量所做標記葉片的PSⅡ暗適應最小熒光（Fo）、暗適應最大熒光（Fm）和最大光化學效率（Fv/Fm）。隨后，在當天上午9 ： 00～11 ： 30，儀器設置與氣體交換參數相同的條件，記錄所做標記葉片的光適應最小熒光（Fo′）、光適應最大熒光（Fm′）、穩(wěn)態(tài)熒光（Fs），參照Demmig-Adams[16-17]的方法計算熒光動力學參數：

（3）POD、SOD、MDA的測定。過氧化物酶（POD）活性的測定參照Chen等[18]的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定參照Giannopolitis等[19]的方法， 丙二醛（MDA）含量測定參照Hodges等[20]的方法。

1.3 數據分析

數據通過Microsoft Excel 2003軟件處理；用SPSS 19.0（SPSS， Chicago， USA）做統(tǒng)計分析，同一品種不同處理間采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析，對照組的不同品種間采用單因素方差分析進行差異顯著性分析，當p<0.05時視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 枯萎病菌脅迫對黑籽南瓜氣體交換參數的影響

受到枯萎病菌處理的3種黑籽南瓜品種在氣體交換參數上表現出明顯的下降趨勢（圖1，p<0.05），除綠皮南瓜的Ci外均表現為顯著下降（p<0.05）。處理后的綠皮南瓜的氣體交換參數較其他品種下降幅度相對較小，其Pn、Gs、Ci和Tr的降幅分別為21.29%、24.95%、0.59%和13.09%；而白皮南瓜在處理后其Pn、Gs、Ci和Tr均下降幅度最高，分別達到了43.89%、79.53%、29.75%和65.41%，降幅較大。

2.2 枯萎病菌脅迫對黑籽南瓜葉綠素a熒光參數的影響

2.2.1 PSⅡ光化學效率參數 枯萎病菌對3種黑籽南瓜的光化學效率參數有明顯影響（圖2）。比較不同品種的Fv/Fm發(fā)現，在未經枯萎病菌處理前，3種黑籽南瓜品種均處于0.80以上；當處理后都表現出顯著下降（p<0.05），均降至0.80以下，且綠皮黑籽南瓜降至0.79，降幅相對較小，而白皮降至0.78，降幅較大。3種黑籽南瓜處理后其Fv′/Fm′和ΦPSII上沒有顯著差異，但在數值上，經過處理后花皮南瓜的Fv′/Fm′和綠皮南瓜ΦPSII上升。

2.2.2 熒光淬滅參數 經過枯萎病菌處理的黑籽南瓜在熒光淬滅參數上的規(guī)律明顯（圖3）。當受到枯萎病菌感染后，綠皮南瓜的qP上升，花皮和白皮南瓜小幅下降；3種黑籽南瓜在受到處理后qN和NPQ都出現大幅下降，且白皮南瓜顯著下降，綠皮南瓜下降幅度最小。

2.3 枯萎病菌脅迫對黑籽南瓜POD、SOD和MDA的影響

2.3.1 抗氧化酶 不同黑籽南瓜品種的POD和SOD活性在受枯萎病到菌侵染后有著不同的響應（圖4，p<0.05）。在經過枯萎病菌侵染后3種黑籽南瓜的POD活性增大，且白皮南瓜增大幅度最大，增幅達到26.49%，花皮南瓜POD活性增大幅度較小，增幅為6.88%；3種黑籽南瓜的SOD活性變化并不一致，花皮南瓜顯著增大，綠皮和白皮南瓜顯著減小，且處理后花皮南瓜的SOD活性最高。

2.3.2 氧化傷害物質 當不同品種黑籽南瓜受到枯萎病菌侵染后，其氧化傷害物質MDA含量有著顯著變化（圖5，p<0.05）。處理后綠皮和白皮南瓜的MDA升高，增幅分別為12.56%和15.60%，但花皮南瓜的MDA顯著下降，降幅為12.96%。

3 討論

光合作用作為植物最重要的生命活動之一，其變化程度能夠反映植物的抗性[21]。本研究表明，當受到枯萎病菌侵染后，3種黑籽南瓜的氣體交換參數均出現不同程度的降低，而白皮南瓜的下降程度最大，這說明綠皮和花皮南瓜對枯萎病菌具有一定的抵抗能力，白皮南瓜的抵抗力更弱。植物光合能力受到氣孔限制和非氣孔限制的影響，前人研究發(fā)現，當Pn、Gs、Ci和Tr同時降低那么植物光合能力的下降由氣孔限制造成，若Pn下降而Ci升高，說明非氣孔因素限制了光合能力[22]。在本研究中，受到侵染的3種黑籽南瓜的Pn、Gs、Ci和Tr均下降，表明枯萎病菌侵入植株體內是通過降低氣孔的導度來限制植物光合能力，這與李海蓮等[23]對黃瓜枯萎病菌侵染茄子的研究結果一致。本研究結果說明，黑籽南瓜的氣孔導度易于受到枯萎病菌的破壞，而白皮南瓜對病菌的抵抗力更弱。

葉綠素a熒光的變化可以從光合作用內部變化的角度反映環(huán)境因子對植物造成的影響[24]。一般認為，Fv /Fm下降可以作為植物受到環(huán)境脅迫的指標[25-26]，在本研究中，病菌處理后3種黑籽南瓜Fv /Fm均大幅下降，這表明枯萎病菌對植物產生嚴重的環(huán)境脅迫。Fv′/Fm′表示PSⅡ反應中心對激發(fā)態(tài)葉綠素的親和力[27]。ΦPSII反映了PSⅡ反應中心的實際光化學效率[28]，qP表示PSⅡ開放反應中心的比例[29]，本研究中，受到枯萎病菌侵染的花皮南瓜Fv′/Fm′增大，綠皮南瓜的ΦPSII和qP上升，表明病菌侵染促進了花皮和綠皮南瓜光系統(tǒng)對激發(fā)能的捕獲和利用能力，這與前人[30-31]對病菌侵染植物的研究結果相反，可能是因為逆境激發(fā)了這兩種黑籽南瓜光合機構的光能利用潛能。qN和NPQ均能夠反映植物熱耗散的能力[28]，在本研究中，病菌侵染破壞了植株的耗散能力，但白皮南瓜被破壞的更為嚴重，這進一步削弱了植株自身的抗性。

MDA是膜脂過氧化過程的最終產物，它的含量能夠反映細胞膜受損程度[32]。試驗結果中，受到侵染后花皮南瓜的MDA含量下降而綠皮和白皮南瓜含量上升，并且花皮南瓜有著較低的MDA含量。王建明等[33]在研究枯萎病菌侵染西瓜幼苗時發(fā)現抗病品種MDA含量低于感病品種，這說明花皮南瓜有作為抗病品種的潛能。POD和SOD是植物體內抗氧化酶系統(tǒng)中非常重要的兩種酶，它們能夠清除植物體內有害的超氧陰離子自由基進而保護細胞受到破壞[34]，在本試驗中，當黑籽南瓜受到侵染后POD活性均上升，但僅花皮南瓜的SOD活性上升。這些結果說明，遭受侵染的花皮南瓜其POD和SOD的協(xié)同作用有效降低了植株體內細胞膜脂的破壞程度。

綜上可知，正常生長的白皮南瓜具有較高的光合能力，但其對枯萎病菌的抵抗力較弱；病菌侵害能夠激發(fā)綠皮和花皮南瓜光合機構對光的捕獲和利用潛能；在光保護上，綠皮南瓜通過熱耗散途徑消耗過剩光能，而花皮南瓜更依賴抗氧化酶系統(tǒng)消除氧自由基的方式保護自身光合機構。因此，綠皮和花皮南瓜的抗病性強于白皮南瓜。

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