黃聰亮 鄒蘭 胡月英 黎智明 陳文學(xué)

摘 要 用乙醇作為溶劑，提取出金線蓮中的有效抑菌物質(zhì)，采用二倍稀釋法確定金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibition concentration， MIC）為5.000 mg/mL；并經(jīng)介質(zhì)pH、熱處理和紫外線處理提取物，發(fā)現(xiàn)其抑菌圈直徑在pH9.0和30 ℃下最大；分析金線蓮乙醇提取物對(duì)供試菌蛋白質(zhì)和還原糖的利用能力，表明金線蓮乙醇提取物通過減弱蛋白質(zhì)和還原糖的代謝來抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。

關(guān)鍵詞 金線蓮；抑菌機(jī)理；最小抑菌濃度；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Antibacterial Activity of the Ethanol Extract of Anoectochilus

roxburghii on Staphylococcus aureus

HUANG Congliang1， ZOU Lan2， HU Yueying3， LI Zhiming2，CHEN Wenxue2*

1 Department of Food and Biological Engineering， Zhangzhou Institute of Technology， Zhangzhou， Fujian 363000， China

2 College of Food Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Material and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Anoectochilus roxburghii was extracted by ethanol. The minimal inhibition concertation（MIC）was detected by the broth two-fold agar dilution method and Staphylococcus aureus MIC was 5 mg/mL. Besides， the inhibitory zone diameters of the ethanol extract on A. roxburghii was up to the maximum at pH9 and 30 ℃， respectively. The protein and sugar concentrations in the bacterium were determined， and the results showed that the ethanol extract of A. roxburghii could inhibit the metabolism of the two substances， which affected the growing of the bacterium.

Key words Anoectochilus roxburghii； antibacterial activity； MIC（minimal inhibition concentration）； antibacterial stability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.026

中藥材金線蓮為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus BL）多年生地生草本植物，一般認(rèn)為包括2種原植物，一種是金線蘭[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl.]，又名花葉開唇蘭，另一種是臺(tái)灣銀線蘭（Anoectochilus formosanus Hayata），又名金線蓮。金線蓮在中國主要分布于亞熱帶地區(qū)，即福建、廣東、廣西、浙江、江西、海南、云南、四川、貴州以及西藏南部等省區(qū)[1-2]，其中以閩、浙、贛為主產(chǎn)地，臺(tái)灣省亦產(chǎn)，但植物種不同，為臺(tái)灣開唇金線蓮是中國傳統(tǒng)的珍貴藥材，全草均可入藥，在民間治療范圍較廣，素有“藥王”、“神藥”的美稱[3]。其味甘微苦，性平微寒，具有非常強(qiáng)的藥用價(jià)值，其不僅能降血壓、解毒、止痛、鎮(zhèn)咳，且在民間還被用于治療支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，均有很好療效[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮中主要活性成分是生物堿、糖類、有機(jī)酸、黃酮類化合物、苷類化合物、甾體類和揮發(fā)油類化合物[6-9]。其中，黃酮類化合物中含有的槲皮素以及有機(jī)酸中的阿魏酸、綠原酸等成分被證明與抗菌活性有關(guān)[10-11]。然而，目前大多研究?jī)H針對(duì)金線蓮的栽培及組織培養(yǎng)，或是針對(duì)其中的成分進(jìn)行分析、提純和分離，而對(duì)其在微生物方面的抑制作用及抑菌機(jī)理方面的研究較少。筆者以金黃色葡萄球菌作為目標(biāo)菌，研究金線蓮乙醇提取物對(duì)供試菌的抑菌作用，并對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行初步研究，為其在食品防腐保鮮中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金線蓮，試驗(yàn)所用細(xì)菌為金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，（ATCC6538）]均由海南大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。乙醇試劑均購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，均為分析純；牛肉膏、瓊脂均購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖購自廣州化學(xué)試劑廠；牛血清蛋白和考馬斯亮藍(lán)G-250購于sigma公司；蒽酮購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；WF-300EH型超聲清洗機(jī)（寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；ZHWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程有限公司）；722型可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 金線蓮的提取 將金線蓮干燥并粉碎后，按料液比1 ∶ 10（g ∶ mL），用80%（V/V）乙醇浸泡120 min，抽濾后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出溶劑，而后用50 ℃水浴鍋蒸干，置4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌種的活化及培養(yǎng) （1）菌種活化：將金黃色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中活化后保存?zhèn)溆谩２捎名準(zhǔn)媳葷岱╗12]，用NaCl（0.9%）將培養(yǎng)后的細(xì)菌從斜面上洗脫下來，并將菌懸液的濃度稀釋至含菌量約為106～107 cfu/mL，用于金線蓮乙醇提取物最小抑菌濃度的測(cè)定和其抗菌穩(wěn)定性的測(cè)定。

（2）菌種培養(yǎng)：取1 mL的上述菌懸液，置49 mL的液體培養(yǎng)基中。將得到的金線蓮乙醇提取物用80%的酒精溶解后加入三角瓶中一起培養(yǎng)作為試驗(yàn)組，最終液體中提取物的濃度為MIC值；對(duì)照組中加入與金線蓮乙醇提取物相同體積的乙醇。各組均在搖床培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

1.2.3 金線蓮乙醇提取物MIC的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取2.0 g金線蓮的乙醇提取物，用10 mL的80%乙醇將其溶解，配制成200 mg/mL的原液。用試管二倍遞減稀釋法[13]，將提取物原液稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL樣品液。以金黃色葡萄球菌為供試菌，進(jìn)行各提取物MIC的測(cè)定[14]。

每個(gè)平板分別加入上述配制好的7個(gè)濃度樣品液1 mL，與9 mL降溫至45 ℃左右的無菌固體培養(yǎng)基混合均勻，配制成濃度為20.00、10.00、5.000、2.500、1.250、0.625 0、0.312 5 mg/mL的含藥平板，待培養(yǎng)基凝固后吸取100 μL濃度為107～108 cfu/mL的菌懸液加于培養(yǎng)基上，均勻涂布。每個(gè)濃度做3次重復(fù)，同時(shí)做乙醇和無菌水的空白對(duì)照。將各平板于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出觀察結(jié)果，以完全不長(zhǎng)菌的最小稀釋濃度為該金線蓮提取物的MIC。若含藥平板的培養(yǎng)基上有肉眼不易識(shí)別的菌體生長(zhǎng)，可從該板中取一環(huán)接種于新的固體平板上，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。

1.2.4 金線蓮乙醇提取物抑菌穩(wěn)定性的研究 考察提取物對(duì)熱和紫外線處理的穩(wěn)定性，以便為金線蓮乙醇提取物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。采用濾紙片法[15]，取吸水力較強(qiáng)且質(zhì)地均勻的濾紙，用打孔器打成直徑6 mm的圓形濾紙片，置潔凈干燥的培養(yǎng)皿中，干熱滅菌后備用。于超凈工作臺(tái)中，待固體培養(yǎng)基溫度為40 ℃時(shí)，在每個(gè)無菌平板中加入100 μL濃度106～107 cfu/mL的菌懸液，并使菌液均勻的分散在培養(yǎng)基上，制成含菌平板，分別測(cè)定pH、溫度和紫外照射時(shí)間對(duì)金線蓮乙醇提取物抑菌效果的影響，抑菌效果的強(qiáng)弱用抑菌圈直徑來表示[16]。抑菌圈直徑=抑菌直徑-濾紙片紙直徑。

（1）介質(zhì)pH值對(duì)金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響：分別用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，將各菌種最小抑菌濃度下的金線蓮乙醇提取物制成pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培養(yǎng)液，用滅菌后的濾紙片分別浸沒于不同pH的提取物中，浸泡24 h后放在含菌平板上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測(cè)定金線蓮乙醇提取物的抑菌圈直徑。

（2）加熱處理對(duì)金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響：將各試驗(yàn)菌對(duì)應(yīng)最小抑菌濃度下的80%金線蓮乙醇提取物分別在不同溫度（在30～100 ℃中，選取5個(gè)溫度）條件下，熱處理30 min后，將滅菌濾紙片分別浸沒于提取物中，浸泡24 h后放在含菌平板上，每個(gè)處理?xiàng)l件做 3次重復(fù)，并測(cè)定金線蓮乙醇提取物的抑菌圈直徑。

（3）紫外線對(duì)金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響：將各試驗(yàn)菌對(duì)應(yīng)最小抑菌濃度下的80%金線蓮乙醇提取物在紫外燈下進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的照射，將濾紙片分別在不同時(shí)長(zhǎng)紫外照射處理過的提取物中浸泡24 h。然后放在含菌平板上，每個(gè)處理3次重復(fù)，分別測(cè)定金線蓮乙醇提取物的抑菌圈直徑。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定供試菌蛋白質(zhì)含量的變化[17-18]。取1 mL的上述菌懸液，置于49 mL的液體培養(yǎng)基中。將得到的金線蓮乙醇提取物用80%的酒精溶解后加入三角瓶中一起培養(yǎng)作為試驗(yàn)組，最終液體中提取物的濃度為MIC值；對(duì)照組中加入與金線蓮乙醇提取物相同體積的乙醇。各組均在搖床培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。分別于0、4、8、12、24 h取樣后，于6 000 r/min，4 ℃下離心15 min。取上清液于595 nm下檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 還原糖含量的測(cè)定 按照1.2.5方法培養(yǎng)后，取培養(yǎng)后的菌液，于6 000 r/min，4 ℃下離心15 min。采用蒽酮比色法[19]，取上清液于620 nm下測(cè)定各管的吸光度值，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照，計(jì)算經(jīng)金線蓮乙醇提取物處理后供試菌還原糖含量的變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供試菌金線蓮乙醇提取物的MIC

采用2倍稀釋法，測(cè)定提取物對(duì)不同供試菌的MIC，結(jié)果見表1。

由表1可見，金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌作用。金線蓮乙醇提取物金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5.000 mg/mL，可見金線蓮乙醇提取物在較低濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌有較明顯的抑制作用。

2.2 金線蓮乙醇提取物穩(wěn)定性的測(cè)定

2.2.1 介質(zhì)pH值對(duì)金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響 圖1為不同pH條件下，金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。由圖1可看出，提取物在不同pH下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果不同，且隨著pH的增大，抑菌圈直徑逐漸增大，其中pH9.0時(shí)抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到12.50 mm。通過顯著性分析可知，在5%的顯著水平下隨著pH的變化，金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用存在顯著性差異，金線蓮提取物在堿性條件下抑菌效果要優(yōu)于酸性條件。

2.2.2 熱處理對(duì)金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響

由圖2可以看出，隨著處理溫度的升高，提取物抑菌圈直徑逐漸減小，其中，30 ℃時(shí)，抑菌圈直徑最大。通過分析可知，在5%顯著水平下，隨著處理溫度的變化，金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用差異顯著，金線蓮提取物在低溫下抑菌效果更明顯。

2.2.3 紫外線對(duì)金線蓮乙醇提物抑菌活性的影響

由圖3可以看出，隨著照射時(shí)長(zhǎng)的增加，抑菌圈直徑有微弱的減小。通過顯著性分析（p<0.05），不同紫外線照射時(shí)間并不會(huì)對(duì)提取物抑菌活性造成較大影響，差異不顯著。

綜上分析，金線蓮乙醇提取物受到pH值和溫度的影響較為顯著，紫外照射時(shí)間對(duì)其影響效果不明顯，且其在堿性條件和低溫下，抑菌效果最好。

2.3 蛋白質(zhì)含量

圖4為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖5為金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌利用蛋白質(zhì)的影響。由圖5可知，盡管供試菌的對(duì)照組和試驗(yàn)組中蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先上升后下降，但對(duì)照組菌液蛋白質(zhì)濃度顯著低于實(shí)驗(yàn)組。

2.4 還原糖含量

圖6為還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖7為金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌還原糖吸收利用能力的影響。由圖7可知，金黃色葡萄球菌2個(gè)處理組的還原糖含量均出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3 討論

本文分析了金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和抑菌穩(wěn)定性等抑菌性能，同時(shí)還測(cè)定了供試菌內(nèi)蛋白質(zhì)和還原糖的變化情況，揭示了其機(jī)理。結(jié)果表明：金線蓮乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為5.000 mg/mL；而楊敏等[20]研究了胡椒乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為40.00 mg/mL。這說明金線蓮乙醇提取物在較小的濃度下就能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。金線蓮乙醇提取物的抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)表明：分別在pH9和30 ℃時(shí)，抑菌圈直徑最大，提抑菌能力最強(qiáng)；金線蓮提取物抑菌效果受pH和溫度的影響，對(duì)紫外照射時(shí)間不敏感[21]，這可能是不同物質(zhì)的提取物，這3個(gè)因素對(duì)其的作用機(jī)理不同。蛋白質(zhì)和還原糖是生物體內(nèi)基礎(chǔ)的能量物質(zhì)，它們通過代謝可為生物體提供物質(zhì)和能量來源。本研究發(fā)現(xiàn)金線蓮乙醇提取物降低了金黃色葡萄球菌還原糖和蛋白質(zhì)的利用率，說明金線蓮乙醇提取物抑制通過降低還原糖和蛋白質(zhì)的利用率來抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖。彭美芳等[22]也研究了草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)的含量的影響，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低蛋白質(zhì)的消耗量，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。這可能是金線蓮乙醇提取物影響了細(xì)胞膜的通透性所致。細(xì)胞膜通透性增加，既影響菌體對(duì)蛋白質(zhì)和還原糖的吸收，同時(shí)還會(huì)使蛋白質(zhì)和還原糖大量外泄[22]；同時(shí)，由于存活的金黃色葡萄球菌仍進(jìn)行呼吸作用消耗了部分還原糖和蛋白質(zhì)，致使其含量降低[23]。此外，還有可能是金線蓮乙醇提取物影響了供試菌內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而抑制了菌體的生長(zhǎng)[24]。因此，酸堿度及溫度能影響金線蓮乙醇提取物的抑菌強(qiáng)弱；且經(jīng)初步分析，其主要是通過抑制菌體內(nèi)蛋白質(zhì)和還原糖的代謝來抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)

[1] 羅曉青， 吳明開， 查蘭松， 等. 珍稀藥用植物金線蓮研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（3）： 71-74.

[2] 鄭 純， 黃以鐘. 金錢蓮文獻(xiàn)考證、 原植物及商品調(diào)查[J]. 中草藥， 1996（3）： 169-170.

[3] 蔡文燕， 肖華山， 范秀珍. 金線蓮研究進(jìn)展（綜述）[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2003， 32（3）： 68-72.

[4] 朱善嵐. 金線蓮活性成分的分析[D]. 福州： 福建醫(yī)科大學(xué)， 2010.

[5] 吳萍萍. 金線蓮活性物質(zhì)分析及藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)[D]. 福州： 福建醫(yī)科大學(xué)， 2013.

[6] 楊秀偉， 韓美華， 靳彥平. 金線蓮化學(xué)成分的研究[J]. 中藥材， 2007， 30（7）： 797-800.

[7] Ito A， Kasai R， Yamasaki K， et al. Aliphatic and aromatic glucosides from Anoectochilus koshunesis[J]. Phytochemistry， 1993， 33（5）： 1 133-1 137.

[8] 何春年. 福建金線蓮的化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2005， 39（3）： 581-583.

[9] 韓美華， 楊秀偉， 靳彥平. 金線蓮揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2006， 18（1）： 65-68.

[10] Yao X， Zhu X， Pan S， et al. Antimicrobial activity of nobiletin and tangeretin against Pseudomonas[J]. Food Chemistry， 2012， 132（4）： 1 883-1 890.

[11] 王 丹. 益智抑菌特性研究及成分分析[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2014.

[12] 胡開輝. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 2004： 246.

[13] 周邦靖. 常用中藥的抗菌作用及其測(cè)定方法[M]. 重慶： 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社重慶分社， 1987.

[14] Huang C B， Alimova Y， Myers T M， et al. Short-and medium-chain fatty acids exhibit antimicrobial activity for oral microorganisms[J]. Archives of Oral Biology， 2011， 56（7）： 650-654.

[15] 樊銘聰， 孫元軍， 李文香， 等. 天然植物提取液抑菌效果篩選及機(jī)理研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)， 2015（9）： 180-185.

[16] 陳文學(xué)， 胡月英， 張偉敏， 等. 白胡椒抑菌活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)， 2010（12）： 11-15.

[17] 彭美芳. 草果抑菌活性物質(zhì)作用機(jī)制及分離純化的研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2014.

[18] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry， 1976， 72（1-2）： 248-254.

[19] 文赤夫， 董愛文， 李國章， 等. 蒽酮比色法測(cè)定紫花地丁中總糖及還原糖含量[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2005， 21（3）： 122-123.

[20] 楊 敏， 袁佳依， 陳文學(xué). 胡椒提取物抑菌活性研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2013（4）： 125-128.

[21] 王 丹， 陳文學(xué)， 胡月英. 益智提取物的抑菌性能研究[J]. 中國釀造， 2013（3）： 76-78.

[22] 彭美芳， 陳文學(xué)， 李宇真， 等. 草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)制的初探[J]. 食品工業(yè)科技， 2013（24）： 79-82.

[23] 周 磊， 云寶儀， 汪業(yè)菊， 等. 大黃素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 2011（12）： 1 156-1 160.

[24] 張赟彬， 郭 媛， 江 娟， 等. 八角茴香精油及其主要單體成分抑菌機(jī)理的研究[J]. 中國調(diào)味品， 2011（2）： 28-33.