李艷波 史懷

摘 要 應(yīng)用9種殺菌劑來(lái)處理尖孢鐮刀菌，通過(guò)HPLC/Q-TOF方法進(jìn)行代謝輪廓分析。結(jié)果表明：不同菌劑處理后的尖孢鐮刀菌代謝組顯著差異，PCA分析可將其分為6組。將6組殺菌劑作為訓(xùn)練樣本集，建立殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌機(jī)理的PLS-DA模型。以枯萎病生防菌短短芽胞桿菌為測(cè)試樣本，利用該模型對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)行了抑菌機(jī)理的分析判別，發(fā)現(xiàn)其作用方式與嘧菌酯、氰霜唑類似，即通過(guò)抑制病原菌的呼吸作用而發(fā)揮抑菌功能，說(shuō)明利用該模型判別生防菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌機(jī)理是可行的。

關(guān)鍵詞 代謝組學(xué)；殺菌劑；PLS-DA模型

中圖分類號(hào) Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Establishment of a Analysis Method for Antifungal Modes of

Biocontrol Strains on Cucumber Fusarium

Wilt by Metabonomics

LI Yanbo1， SHI Huai2 *

1 Department of Biotechnology， Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350119， China

2 Agricultural Bioresources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract In this investigation， the antifungal modes of action of nine fungicide with different targets or modes-of-action on Fusarium oxysporum were studied. Metabolic profiles of cultures treated with nine different fungicide were acquired by LC/Q-TOF MS， significant metabolic markers were used for classification by PCA analysis， and the fungicide could be divided into six groups. Using the six groups as training sample set， PLS-DA prediction model were established. Confirmed with the model， the conclusion could be drawn that the antifungal mode of action of Brevibacillus brevis， a biocontrol strain of Cucumber Fusarium Wilt， is similar to that of azoxystrobin and Cyazofamid， which act as respiratory inhibitor.

Key Words metabonomic； fungicide； PLS-DA prediction model

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.027

利用環(huán)境中一些對(duì)植物病原菌具有拮抗、抑制、競(jìng)爭(zhēng)、寄生及誘導(dǎo)植物抗性等作用的有益微生物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行植物病害防治，是現(xiàn)代植物病害控制的一個(gè)重要手段[1]。然而，盡管中國(guó)在植物病害生物防治方面取得了一批研究成果，但仍存在諸多問(wèn)題，尤其是許多生防菌功能物質(zhì)及其作用機(jī)理尚不明確[2]。這對(duì)提高生防菌抑菌活性，充分發(fā)揮其作用，以及基于作用靶標(biāo)的新藥物分子生物合成設(shè)計(jì)研究造成了嚴(yán)重制約。

代謝組學(xué)（metabonomics）作為系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分，顯示的是生物系統(tǒng)對(duì)基因以及環(huán)境變化的最終應(yīng)答，代表著“組學(xué)”層次上的結(jié)束[3]。近年來(lái)，代謝組學(xué)研究取得了長(zhǎng)足發(fā)展，在生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究中發(fā)揮了重要的作用[4-10]。利用代謝組學(xué)研究外源物質(zhì)引起的病原菌內(nèi)源性代謝物變化，能更直接地了解病原菌體內(nèi)生物化學(xué)過(guò)程和狀態(tài)變化，從而更高效地探索外源物質(zhì)作用靶標(biāo)及作用機(jī)制。如Yu等[11]利用LC-MS比較了金果欖（Tinospora capillipes）提取物和已知作用機(jī)理的9種天然抗生素處理后金色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）代謝輪廓變化，明確了提取物的作用機(jī)理類似于利福霉素（rifampicin）和諾氟沙星（norfloxacin）。易智彪[12]以金黃色葡萄球菌為靶標(biāo)，建立已知抗生素的抗菌模式圖，進(jìn)行了4種抑菌中草藥活性成分的代謝組學(xué)研究，確認(rèn)桔皮黃酮提取物的抑菌機(jī)理是完全有別于現(xiàn)有已知機(jī)理的抗生素。這些藥物作用機(jī)理的代謝組學(xué)研究主要集中于醫(yī)藥方面，而在農(nóng)藥，尤其是生物源天然活性抑菌物質(zhì)的作用機(jī)理上，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用基于HPLC/Q-TOF MS的代謝組學(xué)分析方法，以黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）為研究對(duì)象，通過(guò)分析已知?dú)⒕鷦?duì)尖孢鐮刀菌代謝組的影響，建立PLS-DA預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究相關(guān)抑菌物質(zhì)的作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 Agilent 1260/6520 Q-TOF LC/MS，配ESI電噴霧離子源；Eppendorf高速冷凍離心機(jī)；Sanyo超低溫冰箱；甲醇、乙腈、乙酸銨，均為色譜純，生產(chǎn)廠家為默克。供試殺菌劑原藥均購(gòu)自百靈威科技有限公司。

1.1.2 供試菌株 尖孢鐮刀菌FJAT-9728菌株，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 供試殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

菌株活化后接種于察氏培養(yǎng)基（蔗糖3 g/L，NaNO3 0.3 g/L，K2HPO4 0.1 g/L，KCl 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，F(xiàn)eSO4 0.001 g/L，瓊脂2 g）上，25 ℃培養(yǎng)3 d，用直徑5 mm的打孔器切取菌落外緣制備成菌餅。將9種殺菌劑分別制成含0.1、1、10、100、200 μg/mL的察氏平板，以不加殺菌劑的平板為對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)3次。將菌餅置于含藥培養(yǎng)基中央，25 ℃培養(yǎng)3 d后測(cè)定菌落直徑，以平均數(shù)代表菌落大小，計(jì)算各殺菌劑的相對(duì)抑制率、毒力回歸方程、EC50值。

1.2.2 菌株培養(yǎng) 菌株于察氏培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)7 d，用0.03%吐溫80沖洗菌落，孢子懸液經(jīng)滅菌的脫脂棉過(guò)濾后計(jì)數(shù)并稀釋至1×106 spores/mL，取200 μL均勻涂布在分別內(nèi)含各供試殺菌劑以及枯萎病生防菌短短芽胞桿菌（Brevibacillus brevis）活性代謝產(chǎn)物并鋪有玻璃紙的察氏培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3次重復(fù)，另設(shè)空白對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)7 d。殺菌劑的使用濃度根據(jù)測(cè)得的EC50值設(shè)定，短短芽胞桿菌活性代謝產(chǎn)物的提取參照黃素芳等[13]的方法。

1.2.3 樣品制備 參照羅飛飛等[14]的方法并稍加改進(jìn)：菌株培養(yǎng)7 d后將菌落刮入50 mL離心管，加入20 mL 0.03%吐溫80渦旋3 min，經(jīng)20 μm無(wú)菌濾布過(guò)濾后蒸餾水沖洗，菌絲裝入5 mL離心管，液氮冷凍淬滅，凍干48 h后將菌絲粉碎。各處理分別稱取10 mg凍干的菌絲，加入2 mL 80% 甲醇渦旋30 s，超聲提取1 h后4 ℃靜置12 h。提取物5 600 ×g離心10 min，取1.5 mL上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-MS分析。

1.2.4 液相色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（2.1×50 mm，1.8-Micron）；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫35 ℃；流動(dòng)相A=10 mmol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B=乙腈，梯度洗脫程序：0～8 min 10% A，8～15 min 10%～50% A，15～30 min 50% A；30～40 min 50%～10% A，40～55 min 10% A。

質(zhì)譜條件：ESI源；正離子模式；毛細(xì)管電壓20 V；噴霧器壓力30 psi；干燥氣流量10 L/min，干燥氣溫度300 ℃；碰撞電壓230 V；椎體孔電壓65 V；質(zhì)量范圍100～1 000 m/z；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量121.050 873、922.009 798[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

參照史懷等[6]的方法，原始LC-MS數(shù)據(jù)利用Agilent MassHunter工作站軟件（含Qualitative Anlysis和Mass Profiler Professional模塊）進(jìn)行處理，包括分子特征提取（MFE）、背景扣除、數(shù)據(jù)篩選。9個(gè)殺菌劑及空白共10個(gè)處理3次重復(fù)30組數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，以檢測(cè)到的代謝物及其相對(duì)豐度值為指標(biāo)，以各處理為樣本，構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分（PCA）分析，選取對(duì)代謝輪廓變化影響最大的2個(gè)PC值作得分散點(diǎn)圖；以不同殺菌劑處理樣品為訓(xùn)練樣本集，通過(guò)PLS-DA算法建立預(yù)測(cè)模型，并將生防菌活性代謝物處理樣品作為未知樣品導(dǎo)入模型預(yù)測(cè)其殺菌機(jī)理。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

室內(nèi)毒力測(cè)定的結(jié)果表明，供試的9種殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌均有抑制作用，其毒力回歸方程及EC50值見(jiàn)表1。

根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，試驗(yàn)殺菌劑的使用濃度設(shè)置為：多抗霉素6 μg/mL、尼柯霉素8 μg/mL、腈菌唑0.25 μg/mL、氟硅唑0.3 μg/mL、甲霜靈100 μg/mL、嘧菌胺200 μg/mL、多菌靈0.12 μg/mL、嘧菌酯150 μg/mL、氰霜唑75 μg/mL。

2.2 不同殺菌劑處理后的尖孢鐮刀菌代謝物

圖1為部分尖孢鐮刀菌樣品的總離子流色譜圖，其中A、B、C分別為控制樣本、多抗霉素處理以及嘧菌胺處理。由圖1可知，控制樣本與殺菌劑處理后得到的代謝物譜圖輪廓相似，其代謝物的出峰時(shí)間主要集中在0～8、14～32、38～52 min 3個(gè)時(shí)間段。每個(gè)處理的代謝物集中出現(xiàn)區(qū)域波譜形態(tài)與強(qiáng)度并不完全一致，尤其在38～52 min區(qū)間有明顯差異。

2.3 不同致病性尖孢鐮刀菌代謝組學(xué)PCA分析

由圖2可知，各殺菌劑處理后的樣本均能與對(duì)照樣本清晰的區(qū)分開(kāi)來(lái)，而具有相同作用機(jī)理的殺菌劑其投影聚集在一起（殺菌劑的作用模式見(jiàn)表2[16]）。多菌靈（●）的作用靶標(biāo)是微管蛋白組，影響真菌的有絲分裂，其集群明顯與其他作用方式的殺菌劑分離開(kāi)來(lái)，甲霜靈（▲）和嘧菌胺（△）也是如此。而多抗霉素（■）和尼柯霉素（□）都是作用于幾丁質(zhì)合成酶，干擾病原菌的細(xì)胞壁生成，被聚為一組，同樣，具有相同作用靶標(biāo)的腈菌唑（◆）與氟硅唑（◇）也被聚集在同一組。相對(duì)于其他殺菌劑，嘧菌酯（○）和氰霜唑（×）對(duì)抑制呼吸作用位點(diǎn)不同，但其作用機(jī)理相似，所以腈菌唑（◆）與氟硅唑（◇）在圖2中十分接近。說(shuō)明尖胞鐮刀菌受到殺菌劑影響后，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，相同或相似作用位點(diǎn)的殺菌劑具有相同的代謝信息，而不同作用模式的殺菌劑的代謝信息完全不同。

2.4 殺菌劑作用機(jī)理模型建立與生防菌作用機(jī)理分析

通過(guò)PCA分析得知不同作用模式的殺菌劑處理后尖胞鐮刀菌的代謝行為不同，為了提高代謝組學(xué)方法鑒定未知物質(zhì)抑菌機(jī)理的能力，本研究進(jìn)一步利用供試殺菌劑處理后的尖胞鐮刀菌代謝物構(gòu)建統(tǒng)計(jì)學(xué)預(yù)測(cè)模型，利用該模型對(duì)未知物質(zhì)進(jìn)行殺菌機(jī)理的預(yù)測(cè)。將不同處理的樣本按殺菌機(jī)理分為影響細(xì)胞壁合成（W）、影響細(xì)胞膜合成（M）、影響核酸合成（N）、影響氨基酸與蛋白合成（P）、干擾有絲分裂（D）以及抑制呼吸作用（R）6個(gè)組，作為訓(xùn)練樣本集，建立基于通過(guò)偏最小二乘判別分析（PLS-DA）算法的預(yù)測(cè)模型。從表3的混淆矩陣中可知，訓(xùn)練樣本集的各樣品預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度均達(dá)到100%，表明該方法具有極高的預(yù)測(cè)能力。

以枯萎病生防菌短短芽胞桿菌（Brevibacillus brevis）的活性代謝產(chǎn)物作為未知樣本，導(dǎo)入模型中進(jìn)行預(yù)測(cè)。3個(gè)重復(fù)樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果均被歸類于R組，即抑制呼吸作用，其置信測(cè)度分別為0.903、0.896和0.915（表4）。

3 討論

用9種已知抑菌機(jī)理的殺菌劑分別處理尖孢鐮刀菌，采用HPLC/Q-TOF方法對(duì)尖孢鐮刀菌代謝輪廓進(jìn)行分析結(jié)果表明，殺菌劑處理以及空白對(duì)照組的尖孢鐮刀菌代謝輪廓有顯著差異，在PCA得分圖中可明顯區(qū)分。把不同殺菌劑處理的樣品分為6種抑菌模式作為訓(xùn)練樣本集，建立殺菌劑作用方式的PLS-DA模型，并利用該模型對(duì)枯萎病生防菌短短芽胞桿菌的活性物質(zhì)進(jìn)行了抑菌機(jī)理的預(yù)判結(jié)果表明，其作用方式與嘧菌酯、氰霜唑類似，即通過(guò)抑制病原菌的呼吸作用而發(fā)揮抑菌功能。

短短芽胞桿菌FJAT-0809-GXL菌株是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)篩選到的一株高效生防菌，該菌株對(duì)作物枯萎病的病原菌尖孢鐮刀菌具有很好的抑制作用[17-18]。車建美等[19-20]對(duì)其抑菌功能成分進(jìn)行了分析，認(rèn)為活性成分是多種物質(zhì)的混合物，但對(duì)尖孢鐮刀菌起生防作用的主要成分為羥苯乙酯。羥苯乙酯屬于尼泊金酯類防腐劑，能夠破壞生物氧化過(guò)程中電子傳遞鏈的完整性，抑制病原菌的呼吸作用，從而抑制病原菌生長(zhǎng)[21]。這與本研究通過(guò)建立殺菌劑作用機(jī)理判別模型預(yù)測(cè)的結(jié)果相符，證明該模型預(yù)測(cè)具有可行性。

通常，生防菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、確定以及其作用機(jī)理的研究需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)，采用代謝組學(xué)的方法可以快速的對(duì)活性物質(zhì)作用方式進(jìn)行預(yù)判，避免了繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟，為生防菌的活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)理的研究提供了一條新途徑。當(dāng)然，本研究選取的殺菌劑并不能完全代表所有的已知?dú)⒕饔梅绞?，因此建立的模型尚不完善，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)補(bǔ)充。

參考文獻(xiàn)

[1] Cook R J. Making greater use of introduced microorganisms for biological control of palt pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology， 1993， 31： 53-80.

[2] 邱德文. 我國(guó)植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]. 植物保護(hù)， 2010（4）： 15-18， 35.

[3] Vaclavik L， Lacina O， Hajslova J， et al. The use of high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry coupled to advanced data mining and chemometric tools for discrimination and classification of red wines according to their variety[J]. Analytica Chimica Acta， 2011， 685： 45-51.

[4] German J B， Roberts M A， Watldns S M. Personal metabolomics as a next generation nutritional assessment[J]. Journal of Nutrition， 2003， 133（12）： 4 260-4 266.

[5] Widodo， Patterson J H， Newbigin E， et al. Metabolic responses to salt stress of barley （Hordeum vulgare L.） cultivars， Sahara and Clipper， which differ in salinity tolerance[J]. Journal of Experimental Botany， 2009， 60： 4 089-4 103.

[6] 史 懷， 劉 波， 陳 崢， 等. 基于LC/Q-TOF MS的芽孢桿菌代謝組學(xué)分析方法[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 27（10）： 1 112-1 119.

[7] Buchholz A， Hurlebaus J， Wandery C， et al. Metabolomics： quantification of intracellular metabolite dynamics[J]. Biomol Eng， 2002， 19（1）： 5-15

[8] Boersma M G， Solyanikova I P， VanBerkel W J H， et al. 19 NMR metabolomics for the elucidation of microbial degradation pathways of fluorophenols[J]. J Ind Microbiol Biotechnol， 2001， 26（1/2）： 22-34.

[9] Brindle J T， Antti H， Holmes E， et al. Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H NMR-based metabonomics[J]. Nature Medicine， 2002， 8（12）： 1 439-1 442.

[10] Lindon J C， Nicholson J K， Holmes E， et al. Contemporary issues in toxicology the role of metabonomics in toxicology and its evaluation by the COMET project[J]. Toxieol Appl Pharmacol， 2003， 187（3）： 137-146.

[11] Yu Y， Yi Z B， Liang Y Z， et al. Main antimicrobial components of Tinospora capiilipes， and their mode of action against Staphylococcus aureus[J]. FEBS Letters， 2007， 581： 4 179-4 183.

[12] 易智彪. 四種抑菌中草藥活性成分的代謝組學(xué)研究[D]. 長(zhǎng)沙： 中南大學(xué)， 2007.

[13] 黃素芳， 車建美， 劉 波， 等. 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GXL代謝產(chǎn)物活性物質(zhì)提取方法的優(yōu)化[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 26（4）： 528-532.

[14] 羅飛飛， 李淑林， 陳龍?jiān)疲?等. 代謝組學(xué)方法鑒定球孢白僵菌孢子萌發(fā)和殺蟲(chóng)毒力相關(guān)的標(biāo)記物[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2014， 54（1）： 33-41.

[15] 史 懷， 劉 波， 陳 崢， 等. 青枯雷爾氏菌致病性的代謝組學(xué)異質(zhì)性研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 28（4）： 343-352.

[16] FRAC Code List 2015： Fungicides sorted by mode of action （including FRAC Code numbering）[EB/OL]. [2016-06-25]. http： //www.frac.info/publications/downloads.

[17] 葛慈斌， 劉 波， 藍(lán)江林， 等. 生肪菌JK-2對(duì)尖孢鐮刀菌抑制特性的研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2009， 24（1）： 29-34.

[18] 黃素芳， 肖榮風(fēng)， 楊述省， 等. 短短芽孢桿菌JK-2胞外物質(zhì)抗香蕉枯菌病菌的穩(wěn)定性[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2010， 26（18）： 284-288.

[19] 車建美. 短短芽胞桿菌 （Brevibacillus brevis） 對(duì)龍眼保鮮機(jī)理的研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2011.

[20] Che J M， Liu B， Chen Z， et al. Identification of ethylparaben as the antimicrobial substance produced by Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX[J]. Microbiological Research， 2015， 172： 48-56.

[21] 袁海濤， 芮漢明， 寧正祥. 尼泊金酯類和富馬酸酯類抑菌效果的研究[J]. 食品科技， 2001（5）： 43-44.