崔云華 沈文賓 吳煥淦 周次利 雷 菲 黃立師 趙 琛 李 璟

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海,200030; 2 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203; 3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海,200437)

實(shí)驗(yàn)研究

艾灸對(duì)亞急性衰老大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)的影響

崔云華1沈文賓1吳煥淦1周次利1雷 菲1黃立師1趙 琛2李 璟3

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海,200030; 2 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203; 3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海,200437)

目的:通過(guò)觀察IL-2及相關(guān)受體蛋白水平的變化情況,探討艾灸對(duì)亞急性衰老大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞的影響。方法:采用D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型。24只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為:正常組,模型組和艾灸組。艾灸組溫和灸雙側(cè)腎俞穴5 min/次,共計(jì)40 d。采用免疫磁珠法分離胸腺CD4+T細(xì)胞,并再用Western Blot方法檢測(cè)各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:模型組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB蛋白的表達(dá)量較正常組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);艾灸組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB蛋白表達(dá)量升高,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:艾灸腎俞穴可上調(diào)胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB的表達(dá)。

亞急性衰老；IL-2；IL-2Rα；NF-κB；I-κB；艾灸

衰老是自然界中廣泛發(fā)生的一種自然規(guī)律,是生命體伴隨年齡增長(zhǎng)整個(gè)機(jī)體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能逐步衰退的總現(xiàn)象[1]。隨著社會(huì)的發(fā)展,生活水平得以提高,醫(yī)療條件大有改善,人類的平均壽命不斷延長(zhǎng),老年人口所占的比例也隨之?dāng)U大。目前,我國(guó)已經(jīng)步入了老齡化社會(huì)[2],據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局于2016年2月29日發(fā)布的《2015年國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》數(shù)據(jù)顯示截至2015年底,中國(guó)60歲及以上人口數(shù)為22 200萬(wàn)人,占全國(guó)總?cè)丝诘?6.1%;65周歲及以上人口數(shù)為14 386萬(wàn)人,占比10.5%。衰老及衰老相關(guān)的疾病成為了全世界范圍內(nèi)越來(lái)越重視的問(wèn)題,因此研究衰老機(jī)制,探討有效延緩衰老的方法成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

Walford于1969年提出免疫系統(tǒng)功能衰退是導(dǎo)致衰老的重要因素,免疫系統(tǒng)在機(jī)體的衰老中起著根本性的作用[3]。免疫系統(tǒng)功能衰退包括胸腺增齡性退化,T細(xì)胞表型和功能改變及細(xì)胞因子分泌改變等。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本,與人體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老密切相關(guān),《素問(wèn)·上古天真論》認(rèn)為人體整個(gè)生命過(guò)程其實(shí)是腎氣逐漸充盛、衰減、枯竭的過(guò)程。腎氣有余,則能體健長(zhǎng)壽,腎氣不足,則發(fā)生衰老,從而確立了“腎”在中醫(yī)衰老學(xué)說(shuō)中的地位。正如《醫(yī)學(xué)正傳·命門主壽夭》中所說(shuō):“人之壽夭不齊,何輿？……是故腎元盛則壽延,腎元衰則壽夭”。因此,通過(guò)補(bǔ)腎達(dá)到延年益壽的目的成為了歷代醫(yī)家的首要選擇。

艾灸療法是中醫(yī)學(xué)中固本培元,保健延年的重要方法之一。艾灸療法在古人預(yù)防保健的方法中占有非常重要的地位,例如在《扁鵲心書·住世之法》中就有“保命之法,灼艾第一,丹藥第二,附子第三”之說(shuō),《醫(yī)學(xué)入門》則認(rèn)為“凡一年四季各要熏一次,元?dú)鈭?jiān)固,百病不生”。有研究表明艾灸腎俞穴可以提高免疫系統(tǒng)功能[4],起到延年益壽的作用。

CD4+T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中一類重要的免疫細(xì)胞,根據(jù)表面標(biāo)志的不同可分為不同亞群,各個(gè)亞群均能分泌多種細(xì)胞因子,參與細(xì)胞免疫。正常情況下,各個(gè)亞群之間分化狀態(tài)保持動(dòng)態(tài)平衡。研究表明白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)是調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化平衡狀態(tài)的關(guān)鍵因子之一[5]。T細(xì)胞只有在活化后才能合成并分泌IL-2,分泌的IL-2能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2受體(Interleukin-2 receptor,IL-2R)α鏈的表達(dá),而IL-2/IL-2R信號(hào)環(huán)路可以進(jìn)一步活化T細(xì)胞,促進(jìn)T細(xì)胞的增殖,進(jìn)而增加IL-2表達(dá)?？梢奍L-2的表達(dá)調(diào)控可決定T細(xì)胞活化程度,影響CD4+T細(xì)胞分化,進(jìn)而影響機(jī)體免疫功能。

核因子-κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)是一種能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的核因子,在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)NF-κB被激活后,發(fā)生核易位,與IL-2基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,IL-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)得以啟動(dòng)。有研究顯示,糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)可引發(fā)CD4+T細(xì)胞亞群極化分布,CD4+T細(xì)胞亞群極化分布又反饋性引起下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)功能的異常[6]。其機(jī)制可能是糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后,通過(guò)蛋白-蛋白相互作用直接結(jié)合NF-κB,或通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB抑制蛋白κB(Inhibitor Protein κB,I-κB)表達(dá),NF-κB入核受阻[7],活性抑制,下調(diào)IL-2基因表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察IL-2及其受體蛋白水平的變化情況,研究艾灸對(duì)亞急性衰老大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 24只清潔級(jí)雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(合格證編號(hào):2008001635133),體質(zhì)量(200±20)g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(滬)2009-0069)提供。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜節(jié)律交替,室溫保持在18～22 ℃,相對(duì)濕度55%～65%。24只大鼠分裝于6只等大(50 cm×35 cm×20 cm)動(dòng)物籠中,每周消毒籠具及房間1次。給予自由進(jìn)食,進(jìn)水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn),本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及監(jiān)督。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基,Hyclone;Running buffer,Miltenyi Biotec,德國(guó);LS柱,Miltenyi Biotec,德國(guó);CD4 MicroBeads,Miltenyi Biotec,德國(guó);淋巴細(xì)胞分離液,北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-2Rα Antibody,Abcam,英國(guó);IL-2 Antibody,Santa Cruz,美國(guó);Phospho-NF-κB p65 Antibody,Cell Signaling Technology;Phospho-IκBα Antibody,Cell Signaling Technology。QuadroMACS磁珠分選器,Miltenyi Biotec,德國(guó);通用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),ST16R,Thermo Fisher,美國(guó);通用臺(tái)式離心機(jī),ST16,Thermo Fisher,美國(guó);漩渦振蕩器,Scientic Industries,美國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,無(wú)不良反應(yīng),飲食飲水正常者,即納入實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 18.0 for Windows軟件生成隨機(jī)數(shù)字表,完全隨機(jī)分成3個(gè)組:正常組,模型組和艾灸組,每組8只。本研究采用D-半乳糖致亞急性衰老模型,按125 mg/(kg·次)的劑量每天在大鼠頸背部皮下注射,正常組大鼠注射等量生理鹽水,連續(xù)注射40 d。

1.2.2 干預(yù)方法 采用特制艾條(直徑0.3 cm,長(zhǎng)20 cm),點(diǎn)燃艾條一端,燃端距離穴位的垂直高度約3～5 cm(根據(jù)大鼠是否掙扎調(diào)整高度),1次/d,雙側(cè)腎俞穴同時(shí)艾灸,灸5 min/次,連續(xù)治療40 d。艾灸組進(jìn)行艾灸治療,正常組和模型組只做相同的抓取固定動(dòng)作,不做艾灸。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胸腺,去除結(jié)締組織,制備胸腺單細(xì)胞懸液,免疫磁珠法分離純化CD4+T細(xì)胞,待測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠IL-2蛋白的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而艾灸組大鼠IL-2蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量

表1 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.01。

2.2 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠IL-2Rα蛋白的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而艾灸組大鼠IL-2Rα蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠NF-κB蛋白的表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而艾灸組大鼠NF-κB蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較，#P<0.01;與模型組比較，▲P<0.01。

圖3 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量

表2 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05。

圖4 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

圖5 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量

表3 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.05。

圖6 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較,#P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05。

圖7 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量

表4 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.05。

圖8 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較，#P<0.01;與模型組比較，▲P<0.05。

2.4 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠I-κB蛋白的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而艾灸組大鼠I-κB蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

3.1 D-半乳糖致衰老模型 D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型制備方法是短時(shí)間內(nèi)將大劑量的D-半乳糖連續(xù)注射到動(dòng)物體內(nèi),加速動(dòng)物衰老,最終形成與自然衰老相似的動(dòng)物模型,通過(guò)此種方法制備的衰老動(dòng)物模型是目前使用最為廣泛的[8]。D-半乳糖是體內(nèi)的一種正常代謝產(chǎn)物,正常情況下可以轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟菂⑴c體內(nèi)糖代謝的過(guò)程,但在過(guò)量的情況下能夠引起機(jī)體代謝紊亂[9]。D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型正是利用了這一點(diǎn),具體機(jī)制可能是動(dòng)物體內(nèi)的D-半乳糖短期內(nèi)大量快速累積,在醛糖還原酶的催化作用下,D-半乳糖大量轉(zhuǎn)變成半乳糖醇,但此種物質(zhì)不能被細(xì)胞繼續(xù)代謝,故而堆積在細(xì)胞內(nèi),影響細(xì)胞的正常滲透壓,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)腫脹并喪失原有的功能,最終使機(jī)體出現(xiàn)衰老[10]。這種方法能夠引起與自然衰老相似的生化改變、免疫功能低下、基因表達(dá)與調(diào)控異常、細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖能力下降、細(xì)胞退行性變及認(rèn)知障礙等表現(xiàn)[11]。劉克明[12]等比較了D-半乳糖致衰老模型鼠和自然衰老鼠的多種衰老指標(biāo)的不同,發(fā)現(xiàn)自然衰老小鼠和D-半乳糖模型小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)低于正常對(duì)照組,D-半乳糖模型小鼠體液免疫功能較正常對(duì)照組有所降低,自然衰老組和D-半乳糖模型組SOD活性均低于對(duì)照組(P<0.01)。自然衰老組和D-半乳糖模型組MDA含量均高于其對(duì)照組(P<0.05)。張常娥[13]等發(fā)現(xiàn)D-半乳糖致衰老模型大鼠的一般情況同自然衰老大鼠癥狀相似,提示半乳糖組大鼠出現(xiàn)明顯的衰老體征,D-半乳糖組雄性大鼠體重比青年對(duì)照組的體重顯著性減輕(P<0.05),D-半乳糖組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力比青年對(duì)照組顯著降低(P<0.05),且與老年組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D-半乳糖注射組大鼠的胸腺指數(shù)較青年對(duì)照組有非常顯著的降低(P<0.05),而脾臟指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高希言[14]等證實(shí)D-半乳糖致衰老模型小鼠的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+的比值較空白組均降低,CD8+T細(xì)胞的比例上升,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示D-半乳糖致衰老模型小鼠的T細(xì)胞亞群比例失調(diào)。

本課題所采用的衰老動(dòng)物模型即是在大鼠頸背部皮下連續(xù)注射D-半乳糖所造成的亞急性衰老模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力較正常組大鼠顯著降低,模型組大鼠的一般情況不如正常組,且體重增長(zhǎng)速度較慢,脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)較正常組也有所降低,提示本次實(shí)驗(yàn)所造成的亞急性衰老大鼠模型是成功的。

3.2 艾灸改善免疫功能延緩衰老 艾灸療法具有簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、無(wú)不良反應(yīng)、不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用于延緩衰老具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn),艾灸延緩衰老是通過(guò)艾灸的溫?zé)嶙饔?、藥物作用與腧穴的特殊作用相結(jié)合而產(chǎn)生一種“綜合效應(yīng)”起作用的[15]。

免疫系統(tǒng)的功能會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸衰退,從而使老年人比年輕人更容易遭受疾病的侵襲,尤其是一些免疫缺陷性疾病,例如流感,肺炎,系統(tǒng)性紅斑狼瘡,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,惡性腫瘤,老年癡呆和帕金森病等[16-19]。免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)和衰老的關(guān)系密切,故而改善免疫系統(tǒng)功能可以有效的延緩衰老。高希言等對(duì)不同強(qiáng)壯要穴施灸,可以使衰老小鼠的免疫器官萎縮退化速度顯著降低,失衡的T淋巴細(xì)胞亞群分布恢復(fù)正常,同時(shí)可以調(diào)節(jié)sIL-2R的含量,達(dá)到改善免疫系統(tǒng)功能的目的,從而延緩衰老[20-21]。IL-2是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子,不僅能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化,還能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,對(duì)免疫系統(tǒng)功能影響巨大。而IL-6的主要作用是加速胸腺萎縮,誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生,增強(qiáng)炎性反應(yīng),造成骨質(zhì)疏松等,是導(dǎo)致機(jī)體衰老的重要因子。艾灸能使衰老大鼠血清IL-2水平顯著升高的同時(shí)降低血清IL-6的水平,使衰老引起的免疫功能衰退得以改善[22]。趙粹英[23]等采用隔藥餅灸治療了223例老年人,與治療前比較,治療后細(xì)胞免疫功能明顯增強(qiáng),T淋巴細(xì)胞的總數(shù)有所增加,CD4+/CD8+的比值上升至正常?？梢?艾灸能明顯改善免疫系統(tǒng)功能延緩衰老。

3.3 艾灸調(diào)節(jié)衰老機(jī)體IL-2及其受體延緩衰老的機(jī)制探討

隨著年齡的增長(zhǎng),機(jī)體的免疫功能逐漸衰退,表現(xiàn)為免疫器官萎縮退化,免疫細(xì)胞數(shù)量減少及功能受損和細(xì)胞因子分泌紊亂等。IL-2主要是由T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞)在受到抗原或絲裂原刺激后合成分泌的,是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中起著非常重要的作用。多項(xiàng)研究證實(shí),IL-2及其受體的表達(dá)能力隨著機(jī)體衰老逐漸下降[24-25]。用艾灸進(jìn)行保健強(qiáng)身,延年益壽的方法古已有之,現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn),艾灸可以顯著升高伴隨衰老而降低的IL-2及其受體的表達(dá)能力。

3.3.1 IL-2和IL-2R系統(tǒng) IL-2是一種具有多向性作用的細(xì)胞因子,不僅可刺激輔助性T細(xì)胞增殖,還能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte,CTL)增殖,對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答和抗病毒感染等有重要作用。此外,IL-2還參與了抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視。IL-2的靶細(xì)胞包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞等,這些細(xì)胞表面均可表達(dá)IL-2R,IL-2通過(guò)作用于細(xì)胞膜上的IL-2R來(lái)發(fā)揮其生物活性。IL-2R包含3條多肽鏈:1條為α鏈,分子量55KD;1條為β鏈,分子量75KD;另1條為γ鏈,分子量64KD[26]。3種肽鏈單獨(dú)與IL-2結(jié)合親和力較低,只有同時(shí)表達(dá)才能產(chǎn)生高度親和力,只表達(dá)α鏈的細(xì)胞以低親和力與IL-2結(jié)合,且無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),當(dāng)α鏈與β鏈和γ鏈共同構(gòu)成三聚體型IL-2R時(shí),可以將IL-2R與IL-2結(jié)合的親和力提高10～100倍,β和γ都屬于I型細(xì)胞因子受體超家族,γ亞基不單獨(dú)與IL-2結(jié)合,但與β亞基結(jié)合可構(gòu)成低親和力二聚體型IL-2R,共同成為IL-2R信號(hào)的組成部分[27-28]。β和γ亞基在它們胞質(zhì)內(nèi)的尾部都攜帶信號(hào)序列,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)多種細(xì)胞內(nèi)通路,如酪氨酸蛋白激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子激活通路(JAK/STAT)、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B通路(PI3K/Akt)及絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPKs)[29],γ鏈不僅對(duì)IL-2有應(yīng)答,對(duì)IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21也有應(yīng)答[30],因此IL-2及其受體信號(hào)系統(tǒng)介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng),隨細(xì)胞表面表達(dá)IL-2受體構(gòu)型和數(shù)量的不同產(chǎn)生明顯差異,并與周圍環(huán)境IL-2的濃度、持續(xù)作用的時(shí)間、有無(wú)其他相關(guān)細(xì)胞因子的參與等多種因素密切相關(guān)[31-32]。

IL-2通過(guò)與IL-2R的結(jié)合產(chǎn)生多種生物學(xué)功能:1)刺激T細(xì)胞增殖:各種刺激物活化的T細(xì)胞一般不能在體外培養(yǎng)中長(zhǎng)期存活,加入IL-2則能其長(zhǎng)期持續(xù)增殖。靜止的T細(xì)胞表面不表達(dá)IL-2R,對(duì)IL-2沒(méi)有反應(yīng);受絲裂原或其他刺激活化后T細(xì)胞才能表達(dá)IL-2R,成為IL-2的靶細(xì)胞;而IL-2又可誘導(dǎo)靶細(xì)胞增加IL-2R的表達(dá)。在活體內(nèi),IL-2對(duì)CD4+T細(xì)胞的作用是通過(guò)自分泌途徑實(shí)現(xiàn)的,因?yàn)榛罨腃D4+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的IL-2;而CD8+T細(xì)胞則通過(guò)旁分泌途徑來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)。2)誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用:a.接受了預(yù)刺激信號(hào)的CD8+T細(xì)胞可以受IL-2的作用活化為CTL,發(fā)揮細(xì)胞毒作用;在一定條件下,CD4+T細(xì)胞也可被IL-2誘導(dǎo)為具有殺傷作用的細(xì)胞。b.NK細(xì)胞是唯一正常情況下表達(dá)IL-2R的淋巴樣細(xì)胞,因此始終對(duì)IL-2保持反應(yīng)性。然而靜止的NK細(xì)胞上只表達(dá)IL-2R的β鏈和γ鏈,對(duì)IL-2的親和力低,只能對(duì)高濃度的IL-2發(fā)生反應(yīng)。一旦NK細(xì)胞活化,就表達(dá)IL-2R的α鏈,成為高親和力的受體;因此,大劑量的IL-2誘導(dǎo)的淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(Lymphokine Activated Killer Cells,LAK)主要為NK細(xì)胞。c.使T細(xì)胞作NK細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子β(Tumor Necrosis Factor-β,TNF-β)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等因子,促進(jìn)非特異性細(xì)胞毒素的合成和分泌;還可誘導(dǎo)產(chǎn)生某些B細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及造血生長(zhǎng)因子等,從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。3)對(duì)B細(xì)胞的作用:IL-2對(duì)B細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化均有一定的促進(jìn)作用?；罨幕驉鹤兊腂細(xì)胞表面表達(dá)高親和力的IL-2R,但密度較低;較高濃度的IL-2可誘導(dǎo)B細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖,促進(jìn)抗體分泌,并誘使B細(xì)胞由分泌IgM向著分泌IgG2轉(zhuǎn)換。

3.3.2 衰老對(duì)機(jī)體IL-2及其受體的影響 IL-2和IL-2R在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用,其與衰老之間的關(guān)系已有大量的研究報(bào)道。王敏[33]等采用放射免疫法測(cè)定了D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-2含量,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了脾淋巴細(xì)胞膜IL-2R的表達(dá),結(jié)果表明與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2表達(dá)和脾淋巴細(xì)胞膜IL-2R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而另一項(xiàng)研究則證實(shí)亞急性衰老模型大鼠血清IL-2含量明顯低于青年對(duì)照組(P<0.01)。謝紅林等的研究也得出了同樣的結(jié)論。在自然衰老動(dòng)物模型中也出現(xiàn)了類似的表現(xiàn),吳志奎[34]等比較了自然衰老小鼠和D-半乳糖致衰老小鼠2種模型,發(fā)現(xiàn)2種模型小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力和產(chǎn)生IL-2的能力下降,同時(shí)IL-2R表達(dá)能力亦出現(xiàn)下降。

臨床實(shí)驗(yàn)也有同樣的報(bào)道,趙粹英[35]等報(bào)道了223例老年人外周血IL-2的活性較青年組明顯下降,淋巴細(xì)胞表面IL-2R百分率增加。另一項(xiàng)研究[36]選取了18名健康老年人和12名青年人,抽取外周血后經(jīng)PHA刺激,采用MTT法測(cè)定IL-2活性和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-2R,結(jié)果表明老年組的IL-2活性比青年組下降了48.0%,IL-2R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也下降了28.6%。王舒[37]等分析了17名健康老年人和7名健康青年人的外周血淋巴細(xì)胞增殖能力和IL-2Rγ鏈的表達(dá),結(jié)果顯示青年組的淋巴細(xì)胞增殖能力平均為(0.279±0.054),老年組平均為(0.199±0.055),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);老年組IL-2Rγ鏈陽(yáng)性的細(xì)胞百分比明顯低于青年組(P<0.001);且老年人淋巴細(xì)胞活化后IL-2Rγ鏈mRNA的表達(dá)低于青年人。

3.3.3 艾灸對(duì)衰老機(jī)體IL-2及其受體的調(diào)節(jié)機(jī)制 艾灸能夠?qū)λダ蠙C(jī)體受影響的IL-2及IL-2R信號(hào)系統(tǒng)起到改善作用。唐志勇等比較了溫和灸足三里、腎俞穴一段時(shí)間后中老年人和青年人外周血中IL-2的含量,在針灸前老年組IL-2含量明顯低于青年組,針灸后老年組的IL-2含量明顯上調(diào)。另一項(xiàng)以隔藥餅灸為治療手段的研究也證實(shí)艾灸可以顯著提高老年人外周血中IL-2活性[38]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了艾灸的這一作用,趙偉康[39]等對(duì)自然衰老大鼠關(guān)元穴進(jìn)行艾灸治療,治療結(jié)束后測(cè)定脾臟IL-2活性,結(jié)果表明艾灸可明顯提高老年大鼠脾臟IL-2活性。李麗紅等的研究采用的是D-半乳糖致衰老大鼠模型,選取“足三里”“腎俞”和“關(guān)元”溫和灸20次,治療后測(cè)定大鼠血清IL-2含量,結(jié)果顯示艾灸組大鼠血清IL-2含量明顯高于模型組。另一項(xiàng)研究[40]則選取小鼠在頸背部皮下注射D-半乳糖造成亞急性衰老模型,并對(duì)關(guān)元、足三里穴進(jìn)行艾灸,隔日1次,共進(jìn)行六周,治療結(jié)束后比較各組大鼠血清IL-2含量,與模型組比較,艾灸組血清IL-2含量明顯升高(P<0.05)。詹睿[41]的研究則發(fā)現(xiàn)逆灸關(guān)元穴可顯著升高更年期大鼠血清和子宮IL-2的含量,且脾臟和子宮IL-2RmRNA的表達(dá)也呈增高趨勢(shì)。

衰老機(jī)體IL-2含量降低的原因之一是消耗過(guò)多,血清中的可溶性IL-2受體(sIL-2R)能與IL-2結(jié)合加速廓清IL-2,使激活的T細(xì)胞復(fù)原為靜息狀態(tài),從而使IL-2R的表達(dá)也出現(xiàn)下降,有研究發(fā)現(xiàn)亞急性衰老小鼠模型的sIL-2R含量較對(duì)照組明顯升高;另一個(gè)原因是產(chǎn)生減少,抑制IL-2產(chǎn)生的其中一個(gè)因素是糖皮質(zhì)激素(大鼠為皮質(zhì)酮),研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠的血清皮質(zhì)酮含量較青年對(duì)照組明顯升高[42],高濃度的糖皮質(zhì)激素與靶器官糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合形成GC-R復(fù)合物,該復(fù)合物可通過(guò)蛋白-蛋白相互作用直接與NF-κB等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合,影響I-κB的磷酸化和降解,使NF-κB的磷酸化過(guò)程受到抑制,從而阻礙其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移[43],抑制轉(zhuǎn)錄活性,下調(diào)IL-2基因的表達(dá)。

本課題組前期研究結(jié)果表明,與正常組大鼠比較,D-半乳糖所致的亞急性衰老模型大鼠血清皮質(zhì)酮含量升高,胸腺糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)降低[44]。本次研究進(jìn)一步表明胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)量均下降;而艾灸組大鼠血清皮質(zhì)酮含量較模型組降低,胸腺糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)及胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)量較模型組明顯升高,說(shuō)明艾灸可能是通過(guò)降低血清中的皮質(zhì)酮含量,減少胸腺淋巴細(xì)胞中GC-R復(fù)合物的形成,降低其與NF-κB的結(jié)合幾率,促進(jìn)NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移,提高轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)IL-2基因的表達(dá),使淋巴細(xì)胞激活,IL-2R的表達(dá)增多。

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(2017-04-19收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Moxibustion on the Expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in Thymus CD4+T Cells of Subacute Aging Rats

Cui Yunhua1, Shen Wenbin1, Wu Huangan1, Zhou Cili1, Lei Fei1, Huang Lishi1, Zhao Chen2, Li Jing3

(1ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridan,ShanghaiUniversityOfTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 2ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 3DepartmentofAcupuncture,YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China)

Objective:To observe the effect of moxibustion on CD4+T cells of thymus in subacute aging rats by recording the changes of IL-2 and related receptor protein levels. Methods:Use D-galactose induced subacute aging rat model. Twenty-four male SD rats were randomly divided into normal group, model group and moxibustion group. In moxibustion group, use mild moxibustion on Shenshu Point(BL23) bilateral for 40 days, 5 minutes each day each time. To separate CD4+T cells by MACS method, and access the expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in CD4+T cell by Western Blot. Results:Western Blot assay shows that comparing to the control group, the expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in CD4+T cell of model group significantly decreased (P<0.05). However, in the moxibustion group, those increased with significant difference (P<0.05). Conclusion:In subacute aging rats, moxibustion on BL23 can improve the expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in thymic CD4+T cell.

Subacute aging; IL-2; IL-2Rα; NF-κB; I-κB; Moxibustion

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”計(jì)劃)資助項(xiàng)目(編號(hào):2009CB522900;2015CB554501);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):81303029;81373752)

吳煥淦(1956.11—),男,博士,上海中醫(yī)藥大學(xué)首席教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向:針灸作用的基本原理與應(yīng)用規(guī)律研究,E-mail:wuhuangan@126.com;李璟(1968.03—),女,博士,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師,研究方向:針灸胃腸疾病的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mial:1971921250@qq.com

R245.81

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.036