楊春華，孫 潔，羅秋紅，祝建新，孫思揚(yáng)，周 延，鐘 毅，夏 彪

（1. 江西出入境檢驗(yàn)檢疫局，江西南昌 330002；2. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳 518045；3. 南昌大學(xué)，江西南昌 330002）

豬細(xì)環(huán)病毒數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法的建立

楊春華1，孫 潔2，羅秋紅1，祝建新1，孫思揚(yáng)1，周 延3，鐘 毅1，夏 彪1

（1. 江西出入境檢驗(yàn)檢疫局，江西南昌 330002；2. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳 518045；3. 南昌大學(xué)，江西南昌 330002）

[目的]實(shí)現(xiàn)豬細(xì)環(huán)病毒（TTSuV）的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。[方法]根據(jù)TTSuV的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物、探針，建立數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)。對(duì)數(shù)字PCR反應(yīng)體系中的引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，分析方法的靈敏度、特異性，并初步應(yīng)用于進(jìn)行臨床檢測(cè)。[結(jié)果]最終確定TTSuV1a和TTSuV1b數(shù)字PCR反應(yīng)體系中最佳引物濃度均為250 nmol/L，最佳探針濃度均為 300 nmol/L，TTSuV1a型和TTSuV1b型靈敏度均可達(dá)到單個(gè)拷貝數(shù)；以豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果無(wú)交叉反應(yīng)；批內(nèi)和批間試驗(yàn)表明，該方法的重復(fù)性良好；本實(shí)驗(yàn)室留存的92份血清樣本的檢測(cè)結(jié)果與其背景信息一致。[結(jié)論]本研究建立的TTSuV數(shù)字PCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，可用于TTSuV的定量檢測(cè)。

豬細(xì)環(huán)病毒；實(shí)時(shí)熒光PCR；數(shù)字PCR

細(xì)環(huán)病毒（Torque Torque Virus，TTV）是1997 年首次發(fā)現(xiàn)的，可感染人[1-2]以及豬、牛、羊、貓、狗等多種動(dòng)物[3-4]的一種病毒。1999年Leary首次報(bào)道了豬細(xì)環(huán)病毒（Torque Torque Sus Virus，TTSuV）的存在[3]。該病毒是單股、負(fù)鏈、環(huán)狀DNA 病毒[3，5]，無(wú)囊膜，在氯化銫（CsCl）溶液內(nèi)的浮密度為1.31～1.35 g/cm3，在糞便、血液、膽汁中的浮密度也大致與其相同。TTSuV的基因組長(zhǎng)度約為3.9 kb，具有ORF1 和ORF2兩個(gè)開放閱讀框，其中ORF1編碼病毒的衣殼蛋白，ORF2編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白[6]。2011年國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）將TTSuV重新進(jìn)行了分類，分為Torque Torque Sus Virus 1和Torque Torque Sus Virus K2，其中常引起豬只感染的Torque Torque Sus Virus 1又分 為Torque Torque Sus Virus 1a和Torque Torque Sus Virus 1b。

目前，關(guān)于TTSuV的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）、免疫印跡法、PCR凝膠電泳法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法等[7-9]。ELISA法和免疫印跡法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、特異性不強(qiáng)。實(shí)時(shí)熒光PCR是目前進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)的主流技術(shù)手段。隨著科技的發(fā)展，在實(shí)時(shí)熒光PCR的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了一種核酸檢測(cè)絕對(duì)定量的新技術(shù)，即數(shù)字PCR技術(shù)。同傳統(tǒng)PCR以及qPCR相比，數(shù)字PCR增加了一步分液的操作，將幾十微升的反應(yīng)體系分成上百萬(wàn)個(gè)微小的、獨(dú)立的反應(yīng)體系。核酸模板在這種分液的過程中被充分稀釋，理想狀態(tài)下每個(gè)小反應(yīng)體系中至多含有1個(gè)分子的核酸模板。分液完成后，收集所有液滴進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后識(shí)別熒光信號(hào)并計(jì)數(shù)，從而得到絕對(duì)定量結(jié)果。與qPCR不同，數(shù)字PCR技術(shù)無(wú)需設(shè)置外部核酸標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)核酸模板的絕對(duì)定量分析，在病原體基因檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究旨在根據(jù)TTSuV的核酸序列，建立特異性強(qiáng)、敏感性高的TTSuV數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從江西省的4個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)，采取豬血清樣本92份。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器。核酸抽提純化系統(tǒng)（MagNA Pure LC2.0，瑞士Roche公司）；Nanodrop 3300超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾公司）；實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀（Biorad CFX96，美國(guó)Biorad公司）；基因擴(kuò)增儀（ABI9700，美國(guó)ABI公司）；Raindrop數(shù)字PCR儀（美國(guó)RainDance Technologies公司）。

1.2.2 主要試劑。病毒DNA提取試劑盒（MagNA Pure LC總核酸分離試劑盒）；實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒（美國(guó)Life Technology公司）；數(shù)字PCR試劑盒（美國(guó)RainDance Technologies公司）； PicoGreen雙鏈DNA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)RainDance Technologies公司）。所有引物、探針由大連寶生物公司合成。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)。從GenBank下載TTSuV所有靶基因的序列，用Lasergene進(jìn)行核酸序列比對(duì)，并截取其中最一致的序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針，分別是針對(duì)TTSuV1a的Q-F1和Q-R1引物對(duì)及探針Q-P1，針對(duì)TTSuV1b的Q-F2和Q-R2引物對(duì)及探針Q-P2，并驗(yàn)證其保守性；根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR引物所包含的核酸片段，選擇克隆用引物，分別為針對(duì)TTSuV1a的引物S1、S2，針對(duì)TTSuV1b的引物T1、T2[10]（表1）。

表1 引物序列

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病毒DNA的提取及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的制備

1.3.1.1 病毒DNA的提取。用核酸抽提純化系統(tǒng)MagNA Pure LC2.0，并使用該設(shè)備配套的核酸提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書提取樣品總核酸，用60 μL TE緩沖液將其充分溶解，- 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 目的基因的克隆、測(cè)序。以提取的病毒DNA為模板，分別用引物S1和S2、T1和T2進(jìn)行TTSuV1a、TTSuV1b的全序列擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳及鑒定后，獲取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒分別命名為T-TTSuV1a和T-TTSuV1b。

1.3.1.3 質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b的定量。用PicoGreen試劑盒中的DNA干粉標(biāo)準(zhǔn)品，按照說(shuō)明書的要求配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液并進(jìn)行倍比稀釋，用ND3300紫外分光光度計(jì)檢測(cè)熒光值，作直線回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)以1×TE緩沖液作為空白對(duì)照，測(cè)定質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b及空白對(duì)照的熒光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行質(zhì)粒濃度的計(jì)算。

1.3.2 數(shù)字PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件的優(yōu)化?；谙冗M(jìn)行PCR反應(yīng)，再進(jìn)行熒光檢測(cè)的數(shù)字PCR的原理，在反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的摸索過程中，先用qPCR驗(yàn)證引物、探針的可靠性，同時(shí)調(diào)整Taq酶、引物探針用量、循環(huán)參數(shù)和循環(huán)條件，使之達(dá)到最佳反應(yīng)條件，再進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)體系和條件的微調(diào)。

1.3.3 數(shù)字PCR反應(yīng)的靈敏度。將重組質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b進(jìn)行梯度稀釋，分別標(biāo)記為S0～S8，根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果計(jì)算質(zhì)粒濃度在總體積為20 μL的數(shù)字PCR反應(yīng)體系中加入稀釋好的S0～S8的DNA模板2 μL，使拷貝數(shù)分別為107、106、105、104、103、102、101、100數(shù)量級(jí)，進(jìn)行靈敏度研究。數(shù)字PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.4 數(shù)字PCR反應(yīng)的特異性試驗(yàn)。按照常規(guī)方法，利用Roche MagNA Pure LC 2.0，對(duì)豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬細(xì)小病毒（Porcine Parvovlirus，PPV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type2，PCV2）等病毒提取核酸，分別使用1.3.2的方法，對(duì)上述病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)，以確定該方法的特異性（分別以T-TTSuV1a和T-TTSuV1b為陽(yáng)性對(duì)照，DEPC水為陰性對(duì)照）。

1.3.5 數(shù)字PCR反應(yīng)的重復(fù)性試驗(yàn)。分別設(shè)置3個(gè)不同濃度的重組質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b，應(yīng)用1.3.2的方法，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行5次獨(dú)立試驗(yàn)，以確定此方法的批內(nèi)重復(fù)性；連續(xù)5天對(duì)相同的樣品進(jìn)行檢測(cè)，以確定此方法的批間重復(fù)性。

1.3.6 臨床樣本檢測(cè)的初步應(yīng)用。將本研究建立的數(shù)字PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，從江西省4個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)采集血清樣本92份，提取DNA，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化后的探針濃度及反應(yīng)條件

采用qPCR對(duì)探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化和確定，使TTSuV1a和TTSuV1b反應(yīng)體系內(nèi)的探針濃度分別 為50、100、150、200、250、300、350和400 nmol/L。當(dāng)TTSuV1a探針濃度為250 nmol/L時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度較高，且不再隨著濃度的增加而增加；TTSuV1b的最佳探針濃度為300 nmol/L。后續(xù)試驗(yàn)中，將TTSuV1a和TTSuV1b PCR反應(yīng)的探針濃度分別設(shè)置為250 nmol/L和300 nmol/L。

采用qPCR對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化和確定。對(duì)T-TTSuV1a標(biāo)準(zhǔn)品10-1的稀釋質(zhì)粒，在53～65 ℃范圍內(nèi)的8個(gè)梯度退火溫度，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示：溫度越高，擴(kuò)增效率越低（圖1）；退火溫度為55 ℃時(shí)擴(kuò)增效率最高，E=101.9%。對(duì)TTSuV1b標(biāo)準(zhǔn)品10-1的稀釋質(zhì)粒，在53～65℃范圍內(nèi)的8個(gè)不同退火溫度，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示：溫度越高，擴(kuò)增效率越低（圖2）；退火溫度為55 ℃時(shí)，擴(kuò)增效率最高，E=97.5%。

T-TTSuV1a和TTSuV1b優(yōu)化后的反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

圖1 TTSuV1a標(biāo)準(zhǔn)品（10-1）在53～60 ℃范圍內(nèi)的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果

圖2 TTSuV1b標(biāo)準(zhǔn)品（10-1）在53～60 ℃范圍內(nèi)的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果

應(yīng)用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行數(shù)字PCR試驗(yàn)，TTSuV1a和TTSuV1b擴(kuò)增的散點(diǎn)圖分別見圖3、圖4。經(jīng)過優(yōu)化的PCR體系對(duì)TTSuV的擴(kuò)增效果良好，其中陽(yáng)性微滴和陰性微滴明顯分成兩簇，而且中間彌散的微滴數(shù)目很少，表明經(jīng)過優(yōu)化確定的數(shù)字PCR探針濃度和擴(kuò)增體系適合對(duì)TTSuV進(jìn)行定量分析。

圖3 微滴數(shù)字PCR方法擴(kuò)增TTSuV1a的散點(diǎn)圖

2.2 數(shù)字PCR反應(yīng)的靈敏度

將TTSuV1a和TTSuV1b的DNA模板稀釋后，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系S1～S8生成的可接受總微滴數(shù)和陽(yáng)性微滴數(shù)分布見圖5（TTSuV1a）和圖6（TTSuV1b）。從圖中可發(fā)現(xiàn)，DNA樣品經(jīng)稀釋后再擴(kuò)增，其陽(yáng)性微滴數(shù)目隨著濃度的降低而逐漸減少。在數(shù)字PCR反應(yīng)中，當(dāng)20 μL反應(yīng)液中的拷貝數(shù)為100數(shù)量級(jí)時(shí)，TTSuV1a檢測(cè)到5個(gè)擴(kuò)增，TTSuV1b檢測(cè)到4個(gè)擴(kuò)增，且對(duì)照組均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明數(shù)字PCR對(duì)TTSuV1a和TTSuV1b的檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到單個(gè)拷貝。

圖4 微滴數(shù)字PCR方法擴(kuò)增TTSuV1b的散點(diǎn)圖

圖5 數(shù)字PCR方法擴(kuò)增TTSuV1a的靈敏度

圖6 數(shù)字PCR方法擴(kuò)增TTSuV1b的靈敏度

2.3 特異性試驗(yàn)

采用本實(shí)驗(yàn)建立的TTSuV1a和TTSuV1b 實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對(duì)TTSuV1a和TTSuV1b及PPV、PCV-2和PRV 3種病毒培養(yǎng)液提取的DNA進(jìn)行數(shù)字PCR方法特異性驗(yàn)證。結(jié)果表明，TTSuV1a和TTSuV1b均得到了特異性擴(kuò)增，其他病毒的檢測(cè)均為陰性，且TTSuV1a和TTSuV1b兩者之間無(wú)交叉反應(yīng)，表明建立的數(shù)字PCR方法特異性良好（圖7、圖8）。

圖7 數(shù)字PCR方法擴(kuò)增TTSuV1a的特異性

圖8 數(shù)字PCR方法擴(kuò)增TTSuV1b的特異性

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)TTSuV1a和TTSuV1進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)。分別取模板濃度為103、102、101的TTSuV1a和TTSuV1b質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在同一反應(yīng)條件下，分別做5個(gè)批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)。結(jié)果顯示，TTSuV1a和TTSuV1b數(shù)字PCR方法批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)均小于1%，批間重復(fù)變異系數(shù)均小于3%（表2、表3），表明方法重復(fù)性好。

表2 數(shù)字PCR檢測(cè)TTSuV1a批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

表3 數(shù)字PCR檢測(cè)TTSuV1b批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測(cè)的初步應(yīng)用

對(duì)92份臨床血液樣本提取核酸，采用本研究建立的數(shù)字PCR方法檢測(cè)。結(jié)果表明，92份樣品中，陽(yáng)性樣品份數(shù)為17，每個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果均與其背景信息相吻合。

3 討論

當(dāng)前，動(dòng)物疫病的主要檢測(cè)手段以qPCR為主。qPCR檢測(cè)是通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品中含有的目標(biāo)基因拷貝數(shù)的，依賴于Ct值的重現(xiàn)性、Ct值與起始模板的線性關(guān)系，其最終計(jì)算出的目標(biāo)基因拷貝數(shù)是相對(duì)定量的。在日常動(dòng)物疫病檢測(cè)中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)當(dāng)靶標(biāo)序列含量很低時(shí)，qPCR的Ct值處于臨界值附近，這時(shí)應(yīng)用qPCR無(wú)法得到準(zhǔn)確的結(jié)果，需要一種更加靈敏的方法來(lái)檢測(cè)低含量的核酸，此時(shí)數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。這是一種新興的定量技術(shù)，其操作步驟是先進(jìn)行分液，即將一定體積的PCR反應(yīng)體系快速、均一地制備成數(shù)百萬(wàn)個(gè)皮升大小的油包水液滴，確保真正的單分子擴(kuò)增。分液完成后，收集所有液滴進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增。與qPCR不同，數(shù)字PCR不對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，而是檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)的熒光信號(hào)。對(duì)結(jié)果的判讀是基于反應(yīng)終點(diǎn)閱讀到的熒光信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合無(wú)模板對(duì)照和陰陽(yáng)性對(duì)照劃出相應(yīng)的閾值。將信號(hào)強(qiáng)度位于閾值之上的微滴判定為陽(yáng)性微滴，位于閾值之下的判定為陰性微滴，并利用泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算出目的DNA分子濃度。該技術(shù)在檢測(cè)時(shí)不需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可直接得到絕對(duì)定量。當(dāng)前，數(shù)字PCR技術(shù)被大力推廣用于特定基因及核酸的絕對(duì)定量檢測(cè)中，尤其是對(duì)微量樣品的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR以qPCR為基礎(chǔ)，是對(duì)單個(gè)微滴中的目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)，可直接計(jì)算出目標(biāo)基因DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量，適用于需要絕對(duì)定量及qPCR中依賴Ct值不能很好分辨檢測(cè)結(jié)果的情況。

數(shù)字PCR是一種絕對(duì)定量方法。數(shù)字PCR體系中的DNA濃度若過高，會(huì)導(dǎo)致微滴不滿足泊松分布原理，使定量結(jié)果顯著偏離真實(shí)值，無(wú)法實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR的準(zhǔn)確定量。因此，DNA濃度的準(zhǔn)確定量對(duì)于方法的建立十分關(guān)鍵。本文對(duì)質(zhì)粒模板的濃度測(cè)定，未采用傳統(tǒng)的OD260/280測(cè)量法，而是采用ND3300紫外分光光度計(jì)，結(jié)合PicoGreen雙鏈DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。這是因?yàn)閼?yīng)用OD260/280測(cè)量核酸濃度時(shí)，單鏈核苷酸、單核苷酸和樣本中的雜質(zhì)都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾，同時(shí)光吸收不能區(qū)分DNA和RNA，但PicoGreen染料法能夠排除上述干擾，使得測(cè)量的DNA濃度更加準(zhǔn)確。本文選取了豬細(xì)環(huán)病毒DNA序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物探針，并通過qPCR反應(yīng)測(cè)試其特異性，在后續(xù)的數(shù)字PCR試驗(yàn)中，NTC均沒有檢測(cè)到陽(yáng)性微滴，可見該體系中無(wú)污染，無(wú)非特異性擴(kuò)增，方法的特異性良好，經(jīng)反復(fù)調(diào)整反應(yīng)體系確定其最佳濃度，以此來(lái)摸索數(shù)字PCR的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。

過去，對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒的研究主要集中在檢測(cè)方法及感染率的調(diào)查等方面[10-11]。近年來(lái)，隨著對(duì)其研究的深入，對(duì)檢測(cè)方法的要求也越來(lái)越高，逐漸出現(xiàn)了實(shí)時(shí)熒光PCR法、PCR-DHPLC等[12-13]。本研究在實(shí)時(shí)熒光PCR方法的基礎(chǔ)上，將數(shù)字PCR方法引入到該病毒的檢測(cè)中，建立了數(shù)字PCR檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒的準(zhǔn)確定量檢測(cè)，且該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用方便，可在短時(shí)間內(nèi)出具定量結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了痕量病原檢測(cè)，適用于對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒早期感染的鑒定，對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒的致病性及機(jī)理的進(jìn)一步研究具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Development of a Digital PCR Assay for Quantitative Detection of Torque Teno Sus Virus

Yang Chunhua1，Sun Jie2，Luo Qiuhong1，Zhu Jianxin1，Sun Siyang1，Zhou Yan3，Zhong Yi，Xia Biao1

（1. Jiangxi Entry-exit Inspection & Quarantine Bureau，Nanchang，Jiangxi 330002；2. Shenzhen Entry-exit Inspection & Quarantine Burea，Shenzhen，Guangdong 518045；3. Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330002）

[Objective] In order to accurately and quantitatively detect the Torque Teno Sus virus（TTSuV）. [Methods] Specific primers and probes were designed and synthesized based on the sequence of TTSuV，then a digital PCR detection assay（dPCR）was established. After optimizing the working concentration of primers and probes，the sensitivity and specificity of the established reaction system were tested，and preliminary application was carried out. [Results] The optimal concentration of primers for both TTSuV1a and TTSuV1b genes had the same value of 250 nmol/L，and the optimal concentration of probes for the two genes was 300 nmol/L. As to the sensitivity of dPCR method，results showed single copy of TTSuV1a and TTSuV1b could be detected. Then its specificitywas evaluated by detecting TTSuV，Parvovirus（PPV），Porcine circovirus type 2（PCV-2）and Pseudorabies virus（PRV）simultaneously，and no cross reaction was observed. Furthermore，good repeatability of the method was confirmed by intra and inter assay. At last，92 clinical serum samples derived from our laboratory were conducted detection，results of which showed good consistence with their background information. [Conclusion]The established dPCR method was specific，sensitive and repeatable.，and it could be used in quantitative detection of TTSuV.

TTSuV；real-time PCR；digital PCR

S851.34

A

1005-944X（2017）04-0080-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.024

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20151BBF60048）