韓 雪,孟玉彩,馬 蕾,趙 文,周 茜,閆晨靜,白冰瑤,蔡東偉

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071000)

薔薇紅景天低聚體原花青素的穩(wěn)定性和抗衰老研究

韓 雪,孟玉彩,馬 蕾,趙 文*,周 茜*,閆晨靜,白冰瑤,蔡東偉

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071000)

本文主要考察光、pH、溫度和金屬離子等對薔薇紅景天低聚體原花青素穩(wěn)定性的影響以及其對果蠅的抗衰老作用。穩(wěn)定性研究結(jié)果表明,光照、Fe3+、Sn2+、Al3+等條件可降低原花青素穩(wěn)定性,低pH、低溫以及K+、Mg2+、Na+和Cu2+條件下原花青素較穩(wěn)定。果蠅抗衰老研究結(jié)果顯示,低(0.04%)、中(0.12%)、高劑量(0.36%)原花青素對果蠅平均壽命和最高壽命均有不同程度的延長作用,其中中劑量(0.12%)能顯著延長果蠅壽命,最高壽命和平均壽命分別可達72 d和55 d;中(0.12%)、高劑量(0.36%)組果蠅SOD活性均顯著提高(p<0.05),且中(0.12%)、高(0.36%)劑量MDA含量均顯著下降(p<0.05)。研究為薔薇紅景天低聚體原花青素的深入研究和開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。

薔薇紅景天,低聚體原花青素,穩(wěn)定性,抗衰老活性

原花青素(Proanthocyanidin,PC)是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚類化合物的總稱,廣泛地分布于植物中,是迄今人類發(fā)現(xiàn)的最強、最有效的自由基清除劑之一[1-2],作為天然防腐劑、天然抗氧化劑和保護劑等[3],被越來越多的用于食品、醫(yī)療和化妝品等領域。根據(jù)構(gòu)成原花青素的單體數(shù)量不同可以將其分為兩大類,低聚原花青素(oligomeric proanthoeyanidins,OPC)和高聚原花青素(polymeric proanthoeyanidins,PPC),其中OPC更易被人體吸收,能更有效的發(fā)揮其生物功能。

薔薇紅景天(RhodiolaroseaL.)是薔薇目(Rosales)景天科(Crassulaceae)紅景天屬的多年生草本植物,含有多種活性物質(zhì),包括紅景天苷、酪醇、黃酮類等。研究發(fā)現(xiàn)紅景天屬植物具有抗衰老、抗缺氧、抗疲勞等藥理作用,馬桂芝等[4]研究發(fā)現(xiàn)薔薇紅景天具有抗冠心病的功效,還有研究發(fā)現(xiàn)薔薇紅景天對抗心肌缺血方面有突出作用[5],何承輝等[6]發(fā)現(xiàn)薔薇紅景天還具有抗氧化抗疲勞的作用,其中原花青素是主要抗氧化的物質(zhì)。目前國內(nèi)外對于薔薇紅景天低聚體原花青素(Oligomeric Proanthocyanidin fromRhodiolaroseaL.,OPCRR)研究相對簡單,主要集中在OPCRR的提取、純化、組分鑒定及活性篩選。本實驗室前期確定了薔薇紅景天低聚體原花青素的提取精制條件并對其抗氧化活性進行了研究[7]。為了更好地制備和保存原花青素,進一步確定原花青素的抗衰老作用,本文主要從OPCRR穩(wěn)定性實驗和其對果蠅抗衰老實驗兩部分進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薔薇紅景天塊莖 河北省張家口地區(qū);原花青素標準品(PC),純度大于95% 上海源葉生物技術(shù)有限公司;玉米粉(超市食品級)、蔗糖、酵母浸粉、瓊脂粉 天津市致遠化學試劑有限公司;超氧化物歧化酶測定測試盒、總蛋白定量測試盒、丙二醛測試盒 南京建成生物工程研究所;試劑均為分析純;黑腹果蠅(Drosophila melanogaster):OregonK品系實驗用黑腹果蠅。

SPX-150S-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;XD-1200D型超聲波細胞粉碎機 南京先歐儀器制造有限公司;DH-250電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海勝啟儀器儀表有限公司;H2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;1500-823型酶標儀 Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原花青素含量的測定 分別配制0.05、0.10、0.18、0.34、0.43 mg/mL的PC標準溶液,采用香草醛-鹽酸比色法[8],配制在10.5～420.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)的原花青素標準溶液,分別在500 nm測吸光度,繪制標準曲線。在1 mL待測樣品甲醇溶液中加2.5 mL 2%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 8%的鹽酸甲醇溶液,30 ℃下避光反應20 min,測得吸光度,根據(jù)標準曲線計算原花青素的含量。

1.2.2 OPCRR的制備 以薔薇紅景天根莖粉為實驗材料,參考本實驗室專利[9]。制備過程如下:利用乙醇回流法提取薔薇紅景天中的原花青素,提取溶劑為50%(v/v)乙醇,提取溫度80 ℃,提取時間120 min,料液比1∶25;再對乙醇提取液進行乙酸乙酯萃取,萃取時間為25 min,體積比(乙酸乙酯∶提取液)1.5∶1,取下樣液為低聚體原花青素,萃取4次;最終通過大孔樹脂AB-8對萃取液進行純化,解析液為50%乙醇溶液,提取液pH為4.5,解析液 pH為5,徑高比為1∶40(cm),將純化物濃縮,冷凍干燥后保存待用。

1.2.3 OPCRR的穩(wěn)定性研究

1.2.3.1 OPCRR保存率的計算方法 保存率(%)=C2/C1×100,本實驗通過保存率說明穩(wěn)定性。C1:OPCRR溶液最初濃度;C2:OPCRR溶液保存一段時間后的濃度。

1.2.3.2 光照對OPCRR穩(wěn)定性的影響 將0.3 mg/mL OPCRR溶液取等量放置在自然光、避光、日光燈環(huán)境中,分別于第1、2、3、4、5、6、7 d時取樣,按1.2.1方法測定OPCRR含量,按1.2.3.1方法計算保存率,實驗重復三次,取平均值。

1.2.3.3 pH對OPCRR穩(wěn)定性的影響 將配制好的0.3 mg/mL OPCRR溶液取等量分別加入到pH為2.0、4.0、6.0、8.0的等量0.2 mol/L磷酸氫二鈉和0.1 mol/L檸檬酸按不同比例混合的水溶液中[10],室溫下避光保存,分別于第2、4、6、8、10 h取樣,按1.2.1方法測定OPCRR含量,按1.2.3.1方法計算保存率。實驗重復三次,取平均值。

1.2.3.4 溫度對OPCRR穩(wěn)定性的影響 將配制好的0.45 mg/mL OPCRR溶液取等量置于4、25、50 ℃的環(huán)境下,分別在室溫密封避光2、4、6、8、10 h后取樣,按1.2.1方法測定OPCRR含量,按1.2.3.1方法計算保存率。實驗重復三次,取平均值。

1.2.3.5 金屬離子對OPCRR穩(wěn)定性的影響 在不超過國標中金屬離子在食品中最大安全使用量的前提下,將NaCl、KCl、MgSO4、CuCl2、SnSO4、FeCl3、AlCl3[11]加入到5 mL的0.3 mg/mL OPCRR溶液中制成1 mmol/L的鹽溶液,室溫密封避光保存,定時取樣,按1.2.1方法測定OPCRR含量,按1.2.3.1方法計算保存率。實驗重復三次,取平均值,并觀察溶液顏色。

1.2.4 OPCRR對果蠅的抗衰老研究

1.2.4.1 果蠅培養(yǎng)基的配制 稱量8.5 g玉米粉、6.5 g蔗糖、0.75 g瓊脂粉和0.75 g酵母浸粉,混合,加入蒸餾水攪拌均勻,置于鋪有石棉網(wǎng)的電爐上煮沸1 min,當培養(yǎng)基成為糊狀物時停止加熱,加入1 mL丙酸,不同劑量組的培養(yǎng)基是由基礎培養(yǎng)基分別加入0.04%、0.12%、0.36%的OPCRR粉末得來。攪拌并迅速倒入培養(yǎng)直管,高度約2 cm,制得基礎培養(yǎng)基。

1.2.4.2 果蠅壽命實驗 分別設置空白對照組、低(0.04%)、中(0.12%)、高(0.36%)劑量組。果蠅培養(yǎng)基在室溫下干燥1～2 d后,等待其完全凝固后,將處女蠅倒入潔凈錐形瓶,適當乙醚麻醉使之處于不活動狀態(tài),隨即選960只體型相近的果蠅。若性狀不明顯、難以判斷或蠅翅翹起與蠅體夾角超過45°的果蠅,均將其舍棄[12]。將篩選好的果蠅分裝,每管20只。分組后保持同樣培養(yǎng)條件,置于生化培養(yǎng)箱中,每日12 h光照,培養(yǎng)溫度(25±1) ℃,相對濕度55%～65%。當培養(yǎng)至14 d時,隨機分為空白對照組、低、中、高劑量OPCRR處理組,隔3 d換新鮮培養(yǎng)基。同時每天定時統(tǒng)計死亡數(shù)目,每隔12 h觀察、記錄各果蠅的存亡情況,直至其全部死亡。從第14 d起作為第1 d,計算每組平均壽命(mean life span,MLS)和最高壽命(maximum life span,MMLS)。MLS為全部正常死亡果蠅壽命的平均值,MMLS為最后10只正常死亡的果蠅平均壽命[13]。

1.2.4.3 果蠅體內(nèi)SOD活性和MDA含量測定 乙醚麻醉處女蠅后分裝800只果蠅,隨機分成4組,每50只放入一個清潔的錐形瓶中,各準備四個基礎培養(yǎng)基、低、中、高劑量OPCRR培養(yǎng)基,即每組各四瓶共200只。培養(yǎng)條件與果蠅壽命實驗相同。培養(yǎng)30 d后將同組果蠅乙醚麻醉致死,放入離心管中,按體積比1∶9加入生理鹽水,在冰浴中以2000 r/min勻漿10 s,間歇10 s,反復進行3次,制成勻漿,再離心、取上清液。按試劑盒說明書進行SOD和MDA檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線和回歸方程

以原花青素含量(mg/mL)為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制原花青素的標準曲線,見圖1,并得到回歸方程Y=1.7827X+0.0105,相關(guān)系數(shù)為r=0.99936。

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 The standard curve of proanthocyanidins

2.2 OPCRR的制備

經(jīng)提取、萃取和純化三種方法結(jié)合,OPCRR的得率為4. 56%,測得OPCRR的純度為88. 3%。

2.3 OPCRR穩(wěn)定性研究

2.3.1 光照對OPCRR穩(wěn)定性的影響 由圖2可以看出,不同光照處理下,隨著光照時間延長,OPCRR的含量均降低,且降低程度隨光照強度的增加而增大。與初始含量相比,避光條件OPCRR含量變化較小,7 d后保存率為90.7%;在自然光條件下,OPCRR含量明顯下降,7 d后其保存率為64.7%;在日光燈照射條件下,OPCRR含量顯著下降,7 d后其保存率僅為50.6%。由此可知,不同光照條件會影響OPCRR的穩(wěn)定性,且光照強度為決定性因素。

圖2 光照對OPCRR穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of light on stability of OPCRR

2.3.2 pH對OPCRR穩(wěn)定性的影響 圖3可知,在pH為2～6范圍內(nèi),隨保存時間的延長,OPCRR含量變化不明顯,比較穩(wěn)定。隨著pH的升高,當溶液呈堿性(pH=8)時,溶液的吸光度迅速減小并且溶液顏色加深。

圖3 pH對OPCRR穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on stability of OPCRR

2.3.3 溫度對OPCRR穩(wěn)定性的影響 由圖4可知,不同保存溫度下OPCRR穩(wěn)定性具有較大差異。在低溫條件下OPCRR較為穩(wěn)定,4 ℃條件下放置10 h后相對保存率為97.3%,在25 ℃下放置10 h后相對保存率為91.9%。但隨著溫度升高,OPCRR穩(wěn)定性逐漸下降,尤其是保存溫度為70 ℃以上時,OPCRR含量下降速度加快。當在90 ℃條件下放置10 h后,保存率為75.6%,由此可知,在實驗溫度范圍內(nèi),低溫條件對OPCRR穩(wěn)定性無明顯影響,而高溫能顯著降低OPCRR穩(wěn)定性。

圖4 溫度對OPCRR穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on stability of OPCRR

2.3.4 金屬離子對OPCRR穩(wěn)定性的影響 由圖5可知,K+和Mg2+存在條件下OPCRR的保存率最大,其次為Na+和Cu2+,這四種離子對OPCRR的穩(wěn)定性影響較小。Fe3+、Al3+、Sn2+對OPCRR的穩(wěn)定性影響較大,Fe3+加入后溶液顏色由紅色變?yōu)樘m黑色,且即刻產(chǎn)生絮狀沉淀;Sn2+加入后溶液顏色變成淺紅色,且立刻產(chǎn)生絮狀沉淀,8 h后OPCRR的保存率僅為50.5%;Al3+加入使溶液顏色發(fā)黃,同時也有少許沉淀生成,說明這三種離子對OPCRR具有明顯的破壞作用,其原因還有待進一步研究。因此,在OPCRR的保存和使用時應盡量避免與Fe3+、Al3+、Sn2+共存。

圖5 金屬離子對OPCRR穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of metal iron on stability of OPCRR

2.4 OPCRR對果蠅的抗衰老研究

2.4.1 OPCRR對果蠅壽命的影響 表1結(jié)果顯示,隨OPCRR濃度的增加,果蠅的MLS和MMLS均延長,直至濃度達到0.12%后變化平穩(wěn)。與空白對照組相比,低、中、高劑量組果蠅MLS分別增加了1.3%、6.1%和5.0%,MMLS分別增加了1.1%、4.6%和4.0%(p<0.01)。其中果蠅MLS最高為55 d,MMLS為72 d。

表1 OPCRR對果蠅壽命的影響

注：同列后的不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著性差異，表2同。

2.4.2 OPCRR對果蠅體內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響 表2表示OPCRR處理對果蠅體內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響。與空白對照組相比,不同劑量組OPCRR處理的果蠅SOD活性均有顯著提高(p<0.05),MDA含量均有降低。低劑量組果蠅SOD活性提高了5.0%,差異不顯著,中、高劑量組分別提高了19.2%和19.4%,均具有顯著差異(p<0.05)。與空白對照組相比,各劑量組果蠅MDA含量分別降低了13.3%、16.5%和18.6%,且中、高劑量MDA含量均顯著下降(p<0.05)。

表2 OPCRR對果蠅體內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響(±s)

3 討論與結(jié)論

本實驗室前期研究結(jié)果顯示,薔薇紅景天低聚體原花青素具有顯著的體外清除自由基活性和體內(nèi)抗氧化活性,作為來源于新資源食品的植物提取物,具有潛在的研究價值和應用前景。本實驗研究了光照、溫度、pH和金屬離子等影響因素對OPCRR穩(wěn)定性的影響以及OPCRR對果蠅延緩衰老作用,為OPCRR的深度開發(fā)和應用提供了科學依據(jù)。結(jié)果顯示光照、溫度和pH的增加使OPCRR降解損失,造成OPCRR含量下降;金屬離子K+、Mg2+、Na+和Cu2+對OPCRR穩(wěn)定性無顯著性影響,而Fe3+、Sn2+、Al3+可使OPCRR溶液的顏色改變或發(fā)生明顯的沉淀。廖義秀[14]等研究表明光照、溫度、pH、添加劑和金屬離子等對酚類物質(zhì)穩(wěn)定性的影響較顯著,張海暉[15]等也證明光照、溫度、pH和金屬離子是影響原花青素穩(wěn)定性的主要影響因素。陳嬋[11]等研究結(jié)果證明光照、溫度和pH的增強使紫色甘薯原花青素含量下降,金屬離子Fe3+、Sn2+、Al3+、Mg2+、Na+對原花青素穩(wěn)定性影響較大。

生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應,氧化終產(chǎn)物為丙二醛,會引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的交聯(lián)聚合,且具有細胞毒性。超氧化物歧化酶是機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中具有代表性的酶類,可特定清除各種自由基,避免由自由基引起的細胞損傷和機體損害。因此,測定超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量可間接了解過氧化程度。目前,衰老自由基理論認為可通過提高抗氧化酶活性或者減少自由基來緩解衰老。本實驗采用果腹果蠅為研究對象,以MLS和MMLS為統(tǒng)計標準,考察了OPCRR對果蠅壽命的影響。結(jié)果顯示,不同劑量的OPCRR對果蠅壽命影響程度不同,但在一定范圍之內(nèi)與劑量呈正相關(guān)關(guān)系,具有良好的延長壽命作用;中劑量OPCRR對果蠅壽命的影響最大,在抗衰老方面體現(xiàn)最明顯,延長的壽命率達到了6.3%。孫智達[16]、譚壯生[17]等研究了原花青素對果蠅壽命的影響,結(jié)果證明低(0.04%)、中(0.12%)、高(0.36%)三個劑量組均能延長果蠅的MLS,其中高劑量果蠅壽命最長;對于MMLS,中、高劑量組可延長雌果蠅壽命,與本實驗果蠅的壽命實驗結(jié)果基本一致。本果蠅抗衰老實驗中,SOD活性較空白組有所提高,MDA含量較空白組有所下降。其中,中、高劑量組雄果蠅的SOD活性均顯著提高(p<0.05),其中,高劑量組果蠅SOD活性與空白對照組差異極顯著(p<0.01)。與空白對照組相比,各劑量組MDA均不同程度地降低,其中中、高劑量OPCRR處理后MDA含量表現(xiàn)出顯著性下降(p<0.05)。高江霞[18]等結(jié)果證明,原花青素提取物可使小鼠血清、腦組織、肝組織中的SOD活性增加,MDA含量下降;孫智達[17]研究原花青素對小鼠體內(nèi)抗氧化指標影響結(jié)果顯示0.2%、0.6%兩個劑量均可顯著地提高SOD活性和降低MDA含量,0.6%劑量效果顯著,與本實驗結(jié)果基本一致。

原花青素作為一種安全的天然提取物,具有很強的抗氧化和清除自由基的能力,這使得它在保健食品研發(fā)領域具有良好前景。對此本研究確立了影響OPCRR穩(wěn)定性的因素,因此,我們在生產(chǎn)實踐中需要注意選擇食品添加劑的種類以及貯藏條件;抗衰老作用結(jié)果表明,原花青素可清除體內(nèi)過多的自由基發(fā)揮其抗衰老作用,但原花青素清除自由基的機理仍不清楚,還需更全面的研究來探索其機理。

[1]趙平,任鵬,張月萍. 原花青素抗氧化活性測定方法比較[J]. 現(xiàn)代化工,2012,32(5):119-122.

[2]張峰源,趙先英,張定林,等. 原花青素抗腫瘤作用及機制研究進展[J]. 重慶醫(yī)學,2012,41(27):2887-2889.

[3]趙平,張月萍,劉俊英,等. 原花青素分級分離[J]. 中國食品添加劑,2011,(6):75-79.

[4]馬桂芝,滕亮,馬亮英,等. 新疆薔薇紅景天抗冠心病有效成分的提取純化研究[J]. 中成藥,2012,34(1):1009-1011.

[5]馬桂芝. 薔薇紅景天化學成分和抗心肌缺血有效部位的研究[D]. 烏魯木齊:新疆醫(yī)科大學,2006.

[6]何承輝. 薔薇紅景天化學成分及抗氧化作用的研究[D]. 烏魯木齊:新疆醫(yī)科大學,2006.

[7]殷志萍. 薔薇紅景天原花青素的分離純化及抗氧化、抗腫瘤活性研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2012.

[9]趙文. 一種薔薇紅景天原花青素的制備方法:中國:CN2011100915740[P].2013-08-14.

[10]劉佳,許盈芃,盧紅沖,等. 火棘原花青素穩(wěn)定性研究[J]. 食品研究與開發(fā),2015(7):29-32.

[11]陳嬋,黃瓊,彭宏,等. 紫色甘薯原花青素穩(wěn)定性及抗氧化性的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(35):17308-17310.

[12]熊麗丹. 雪靈芝抗衰老研究[D]. 成都:四川師范大學,2010.

[13]陳勤. 抗衰老研究實驗方法[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1996.

[14]廖義秀. 茶油多酚分析及其抗氧化穩(wěn)定性研究[D]. 株洲:中南林業(yè)科技大學,2013.

[15]張海暉,李金鳳,段玉清,等. 板栗殼原花青素提取及其穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學,2011,32(8):5-9.

[16]孫智達,楊爾寧,謝筆鈞. 荷葉中原花青素對果蠅壽命及小鼠及的影響[J]. 食品科學,2005,26(12):221-223.

[17]譚壯生,張懿,宋乃寧,等. 花青素對果蠅壽命和小鼠某些氧化及抗氧化指標的影響[J]. 毒理學雜志,2012,(6):440-441.

[18]高江霞,王艷紅,孟敏,等. 馬栗籽提取物對衰老模型小鼠氧化損傷的改善作用[J]. 中國藥房,2015,(16):2175-2177.

Stability and anti-aging effect of oligomeric proanthocyanidin fromRhodiolaroseaL.

HAN Xue,MENG Yu-cai,MA Lei,ZHAO Wen*,ZHOU Qian*,YAN Chen-jing,BAI Bing-yao,CAI Dong-wei

(College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)

The stability and anti-aging effect of oligomeric proanthocyanidin fromRhodiolaroseaL. (OPCRR)was studied.The results of stability showed that the OPCRR content would decrease under the condition of light,Fe3+,Sn2+,Al3+,keep stable at low pH,low temperature,K+,Mg2+,Na+and Cu2+. The results of anti-aging effect showed that the concentration of 0.04%,0.12% and 0.36% OPCRR had various degrees of prolonging effect on the average life and the highest life of Drosophila melanogaster,and the most effective dose was 0.12% OPCRR,in which the highest life and average life of Drosophila melanogaster was up to 72 d and 55 d respectively.In 0.12% and 0.36% OPCRR groups,the SOD activities were significantly increased(p<0.05)and MDA contents were significantly decreased(p<0.05).The study provided the theoretical basis for deeply research and application of oligomeric proanthocyanidin fromRhodiolaroseaL.in future.

RhodiolaroseaL;oligomeric proanthocyanidins;stability;anti-aging activity

2016-09-06

韓雪(1991-),女,在讀研究生,研究方向:食品加工與安全,E-mail:245690659@qq.com。

*通訊作者:趙文(1962-),女,碩士,教授,研究方向:營養(yǎng)分析與食品安全,E-mail:13582820221@163.com。 周茜(1986-)，女，博士，從事營養(yǎng)和食品安全研究工作，E-mail:zhouqianyz513@126.com。

河北省高等學校科學技術(shù)研究項目(QN2015198);河北省食品科學與工程學科“雙一流”建設資金項目(2016SPGCA18)。

TS202.3

A

1002-0306(2017)05-0120-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.014