孫 婕,尹國(guó)友,Qi Wang,劉文霞,李文建,張現(xiàn)青

(1.河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南平頂山 467036；2.加拿大農(nóng)業(yè)與食品部圭爾夫研究與發(fā)展中心,安大略圭爾夫 N1G5C9)

黑曲霉液態(tài)發(fā)酵韭籽粕提取韭籽多肽工藝

孫 婕1,尹國(guó)友1,Qi Wang2,劉文霞1,李文建1,張現(xiàn)青1

(1.河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南平頂山 467036；2.加拿大農(nóng)業(yè)與食品部圭爾夫研究與發(fā)展中心,安大略圭爾夫 N1G5C9)

為充分利用提取韭菜籽油后的副產(chǎn)品韭籽粕,本文采用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化黑曲霉液態(tài)發(fā)酵韭籽粕中韭籽多肽提取工藝,并測(cè)定了最優(yōu)提取條件下韭籽多肽的抗氧化活性。結(jié)果表明:影響韭籽多肽提取工藝的因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間>韭籽粕濃度>初始pH,韭籽多肽提取的最佳工藝條件:韭籽粕濃度9.4%,初始pH3.0,發(fā)酵時(shí)間3 d,在此條件下,每毫升發(fā)酵液中韭籽多肽含量可達(dá)573.55 μg/mL。在最佳工藝條件下,測(cè)定黑曲霉液態(tài)發(fā)酵制備得到的韭籽多肽對(duì)DPPH·的清除能力以及總還原力,結(jié)果表明采用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵制備得到的韭籽多肽具有抗氧化活性,隨著韭籽多肽濃度的提高,抗氧化活性增強(qiáng)。

韭籽多肽,響應(yīng)面法,液態(tài)發(fā)酵,抗氧化活性

韭菜籽,是蔥屬科植物韭菜的成熟干燥種子,是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材,最早記載于《名醫(yī)別錄》。韭菜籽的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都極高,2002年我國(guó)衛(wèi)生部將其列為藥食兩用植物天然產(chǎn)物[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于藥食兩用的韭菜籽研究主要集中在韭菜籽油的提取和成分分析等方面,而對(duì)韭菜籽油提取后的副產(chǎn)品——韭籽粕的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用及研究等方面在國(guó)內(nèi)外都鮮有報(bào)道[2-5]。韭籽中含有豐富的蛋白質(zhì)和膳食纖維等成分,并且我國(guó)韭菜種質(zhì)資源豐富,有必要對(duì)韭籽及其副產(chǎn)物韭菜籽粕進(jìn)行進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。

近幾年隨著生命科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,人們?cè)谘芯可镄》肿拥耐瑫r(shí)更加關(guān)注生物活性多肽物質(zhì)的研究?？茖W(xué)家們已研究發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化、降血脂和降血壓等的功能性多肽,這就使得多肽類物質(zhì)研究更為熱門[6-8]。目前根據(jù)掌握的大量文獻(xiàn),除孫婕[9]、洪晶等[10]曾對(duì)韭菜籽蛋白的提取及抗氧化活性進(jìn)行研究和陳濤濤[11]等人對(duì)韭菜籽中活性肽的抗菌和抗氧化研究以外,鮮有關(guān)于韭菜籽蛋白質(zhì)、韭菜籽多肽的研究報(bào)道。響應(yīng)面分析法(Response Surface Metod,RSM)是一種非常有效的常用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法,通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以建立數(shù)學(xué)模型來(lái)實(shí)現(xiàn)受多因素影響的最優(yōu)組合條件的篩選;中心組合設(shè)計(jì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用較為廣泛[12]。本實(shí)驗(yàn)以韭籽多肽得率為考察指標(biāo),采用響應(yīng)面分析法研究黑曲霉液態(tài)發(fā)酵制備韭籽活性多肽得率的影響因素,利用Design-Expert軟件中心組合設(shè)計(jì),對(duì)三個(gè)主要工藝參數(shù)——韭籽粕濃度、初始pH、接種量進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),以獲取最佳發(fā)酵條件,為今后在工業(yè)中充分利用發(fā)酵法提取韭菜籽中生物活性物質(zhì)提供相應(yīng)的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(4097);斜面培養(yǎng)基:察氏培養(yǎng)基[13]。韭籽粕 平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;甘氨酸 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;茚三酮 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;乙酸鈉 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;乙酸氫氧化鈉、鹽酸、(均為分析純) 洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠;甘氨酸、DPPH· 上海索萊寶生物科技有限公司。

電子天平、pH計(jì) 梅特勒-托利多(上海)有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋 上?？茖W(xué)有限公司;HZQ-X100E恒溫震蕩搖床 常州普天儀器制造有限公司;紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京譜析通用儀器有限責(zé)任有限公司;超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HWSZ8電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;FDC-1044高速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程 制備黑曲霉孢子懸液、發(fā)酵培養(yǎng)基→培養(yǎng)基滅菌→菌懸液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中→液態(tài)發(fā)酵→離心取上清液→酶活測(cè)定

1.2.2 制備黑曲霉孢子懸液和發(fā)酵培養(yǎng)基 取黑曲霉斜面一支,用10 mL生理鹽水分兩次將菌苔洗下,充分震蕩10 min后制成孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)[14]。用生理鹽水調(diào)整孢子懸液濃度為107個(gè)/mL,取10 mL孢子懸液加入容量為150 mL裝有90 mL的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,于30 ℃,200 r/min震蕩培養(yǎng)36 h,待生成均一菌絲球時(shí)即為可用于發(fā)酵的種子液[15-16]。發(fā)酵培養(yǎng)基:韭籽粕溶液50 mL/瓶(錐形瓶容量150 mL),121 ℃滅菌 20 min 后冷卻至室溫,按照一定比例接入種子液,振蕩培養(yǎng)。

1.2.3 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參考文獻(xiàn)[17-18]的方法,分別取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液于試管中,用蒸餾水補(bǔ)足到1 mL。分別加入0.2 mol/L pH5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL;再加入0.2%茚三酮顯色液1 mL,充分混合后蓋住試管口,在100 ℃水浴中加熱15 min,冷卻,放置5 min后,加入60%乙醇3 mL,充分搖勻,甘氨酸濃度為0的溶液為對(duì)照,在570 nm下測(cè)定 OD值。以甘氨酸的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 發(fā)酵液中多肽含量的測(cè)定 取適量發(fā)酵液4000 r/min離心15 min,上清液3 mL于10 mL離心管中,加入3 mL 20%三氯乙酸,5000 r/min離心15 min。離心結(jié)束后,取適量上清液,稀釋100倍,根據(jù)茚三酮法測(cè)定發(fā)酵液中多肽含量[19-20]。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響黑曲霉發(fā)酵韭籽粕產(chǎn)韭籽多肽的主要因素有韭籽粕濃度、初始pH、接種量和發(fā)酵時(shí)間[21-22]。將韭籽粕粉碎并過(guò)60目篩,并將未通過(guò)篩孔的渣滓再次進(jìn)行粉碎于過(guò)篩后的細(xì)粉混合作為發(fā)酵原料。

1.3.1 考察韭籽粕質(zhì)量濃度對(duì)韭籽多肽含量的影響 分別按照3%、5%、7%、9%、11%(m/v)的比例稱取韭籽粕,加入50 mL蒸餾水,pH調(diào)至6.0,121 ℃滅菌30 min,冷卻至30 ℃以下,加10%(v/v)的種子液,混勻后30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d結(jié)束發(fā)酵,測(cè)定多肽濃度。

1.3.2 考察初始pH對(duì)黑曲霉發(fā)酵制備韭籽多肽的影響 按10%(m/v)的比例將韭籽粕加入到錐形瓶中,均加入50 mL蒸餾水,分別將pH調(diào)為3、4、5、6、7,21 ℃條件下滅菌30 min,冷卻至30 ℃以下,接入10%(v/v)的種子液,混勻后30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d結(jié)束發(fā)酵,測(cè)定多肽含量。

1.3.3 考察接種量對(duì)黑曲霉發(fā)酵提取韭籽多肽的影響 按照10%(m/v)的比例稱量預(yù)處理后的韭籽粕于各錐形瓶中,加入蒸餾水50 mL,pH均調(diào)至6.0。121 ℃條件下滅菌30 min,滅菌結(jié)束后冷卻至30 ℃以下,然后按照6%、8%、10%、12%、14%(v/v)比例分別加種子液,混勻后30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d結(jié)束發(fā)酵,測(cè)定多肽含量。

1.3.4 考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵提取韭籽多肽的影響 按照10%(m/v)的比例稱量預(yù)處理后的韭籽粕于各個(gè)錐形瓶中,均加入蒸餾水50 mL,pH均調(diào)至6.0。121 ℃條件下滅菌30 min,冷卻至30 ℃以下,然后按照10%(v/v)比例加種子液,混勻后30 ℃,200 r/min分別振蕩培養(yǎng)2、3、4、5、6 d結(jié)束發(fā)酵,測(cè)定多肽含量。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,根據(jù)中心組合設(shè)計(jì),采用軟件Design-Expert建立三因素三水平實(shí)驗(yàn),確定微生物發(fā)酵韭籽粕提取韭籽多肽工藝。以韭籽多肽含量為考察指標(biāo),韭籽粕濃度(A)、初始pH(B)和發(fā)酵時(shí)間(C)為自變量,因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表

1.5 發(fā)酵液中多肽的提取

參考陳濤濤的提取方法[11]。

1.6 抗氧化效果測(cè)定

1.6.1 對(duì)DPPH·清除效果測(cè)定 參考孫婕等人的方法[9]。

1.6.2 總還原力測(cè)定 取0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%(m/V)的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,加入不同濃度的韭籽多肽溶液1 mL(用1.5中提取得到的多肽粉末配制不同濃度的多肽溶液),混勻后50 ℃水浴20 min,冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻,3000 r/min條件下離心10 min,取離心后的上清液2.5 mL,再加入2.5 mL雙蒸水和2.5 mL 0.1%的氯化鐵,混勻,室溫下靜置10 min,在700 nm處測(cè)定吸光度[23]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖均采用Execl 2003軟件,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。

圖1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Glycine

通過(guò)茚三酮顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn),確定甘氨酸濃度和吸光值之間的線性關(guān)系,即:Y=0.0687X-0.0425,R2=0.993。

2.2 單因素對(duì)發(fā)酵液中韭籽多肽含量的影響

2.2.1 韭籽粕濃度對(duì)黑曲霉發(fā)酵法制備韭籽多肽的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。韭籽粕濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大影響,韭籽粕濃度從3%升到9%的過(guò)程中,多肽含量隨之提高,增加趨勢(shì)十分明顯。但當(dāng)濃度提高到11%時(shí),多肽含量下降,分析其原因可能為濃度過(guò)大,發(fā)酵培養(yǎng)基粘度增高,基質(zhì)水分含量減少,溶氧不足,不利于微生物的生長(zhǎng)代謝以及微生物代謝產(chǎn)生的酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解作用[24]。因此,將發(fā)酵過(guò)程中的底物濃度即韭籽粕濃度定為9%。

圖2 韭籽粕質(zhì)量濃度對(duì)韭籽多肽含量的影響 Fig.2 Effect of concentration of leek seed meal on Polypeptide content

2.2.2 初始pH對(duì)黑曲霉發(fā)酵制備韭籽多肽的影響 結(jié)果如圖3所示。菌株所產(chǎn)蛋白酶對(duì)韭籽粕中蛋白的酶解效果與發(fā)酵初始pH有密切關(guān)系,同時(shí),pH也會(huì)影響菌株的產(chǎn)酶量,進(jìn)而影響多肽含量。從圖3中可以看出,隨著pH的增大,多肽含量迅速降低,其原因是所選發(fā)酵菌種為40970號(hào)黑曲霉,其主要產(chǎn)酸性蛋白酶,而酸性蛋白酶酶解時(shí)環(huán)境最適pH為2.5～3.5。當(dāng)pH環(huán)境偏大或者偏小時(shí),都不利于菌種的生長(zhǎng)[25]。因此,在pH為3的條件下發(fā)酵效果較好。

圖3 初始pH對(duì)韭籽多肽含量的影響Fig.3 Effect of initial pH on polypeptide content

2.2.3 接種量對(duì)黑曲霉發(fā)酵提取韭籽多肽的影響 結(jié)果如圖4所示。接種量在6%～10%之間時(shí),韭籽多肽含量先增后降,但是升高和下降的趨勢(shì)均不明顯。說(shuō)明接種量在6%～10%之間時(shí)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)多肽影響較小,但是隨著接種量的增高,菌株大量消耗發(fā)酵培養(yǎng)基的水分,阻礙酶水解蛋白的過(guò)程,使得韭籽多肽含量顯著下降[26]。因此根據(jù)測(cè)定結(jié)果,確定發(fā)酵接種量為8%。

圖4 接種量對(duì)韭籽多肽含量的影響Fig.4 Effect of inoculation concentration on polypeptide content

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵提取韭籽多肽的影響 結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物法提取多肽有較大的影響,發(fā)酵時(shí)間在2～3 d時(shí),多肽含量顯著增加,說(shuō)明該時(shí)間段菌株大量產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物—酸性蛋白酶,蛋白酶作用于蛋白產(chǎn)生多肽。發(fā)酵進(jìn)行3 d后,發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)基本大部分被消耗,菌株進(jìn)入衰亡期,所產(chǎn)酶量減少[27],韭籽多肽含量隨之下降。因此將3 d作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

表3 回歸方程的方差分析

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)韭籽多肽含量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on polypeptide content

注：p<0.001,代表極顯著“***”;p<0.01,代表較顯著“**”;p<0.05,代表顯著“*”;p>0.05,代表不顯著。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果和分析

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取韭籽粕濃度、初始pH和發(fā)酵時(shí)間為考察因素,根據(jù)響應(yīng)面分析法中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)點(diǎn)共15個(gè)?？煞譃閮深?一是12個(gè)析因點(diǎn);二是區(qū)域的中心點(diǎn)-零點(diǎn),零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,以估計(jì)誤差。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到韭籽粕濃度、初始pH、發(fā)酵時(shí)間的二元多次回歸模型:R1=+593.68+54.46A+25.14B+122.94C+69.87AB+46.12AC+34.05BC-100.60A2-127.00B2-126.95C2

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3?；貧w模型p值(p=0.0005)小于0.01,表明所得模型較顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)98.52%以上,失擬項(xiàng)p值為0.1333大于0.05,失擬不顯著,說(shuō)明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合度較好,可靠性較高,可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)黑曲霉發(fā)酵法制備韭籽多肽的效果。從表3回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果中可以看出,模型一次項(xiàng)A、C的p值小于0.01,說(shuō)明韭籽粕濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)韭籽多肽含量的影響極顯著,B的p值大于0.05,說(shuō)明初始pH對(duì)韭籽多肽含量的影響不顯著;交互項(xiàng)AB的p值小于0.01對(duì)韭籽多肽含量影響極顯著;交互項(xiàng)BC的p值大于0.05對(duì)韭籽多肽含量影響不顯著;交互項(xiàng)AC的p值小于0.05對(duì)韭籽多肽含量影響顯著;同時(shí)二次項(xiàng)A2、B2、C2的p值都小于0.01具有極高的顯著性。由此可知,各影響因素對(duì)于多肽含量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,曲面效應(yīng)顯著。各因素影響提取韭籽多肽含量的程度由大到小為:發(fā)酵時(shí)間>韭籽濃度>初始pH。

2.3.1 各因素對(duì)黑曲霉發(fā)酵韭籽粕制備得到韭籽多肽的影響分析 用各因素的F值可評(píng)價(jià)該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響,F值越大,表明該因素的影響越顯著[28]。響應(yīng)面曲面的坡度可反映該因素對(duì)黑曲霉發(fā)酵韭籽粕制備得到韭籽多肽含量影響的強(qiáng)弱程度[29]。響應(yīng)曲面相對(duì)平緩,說(shuō)明其可容忍處理?xiàng)l件的影響。等高線圖的形狀表明變量間的交互作用是否顯著,橢圓等高線表明變量間的交互作用顯著,圓形等高線表明交互作用不顯著[30]。由圖6～圖8可以看出,各因素對(duì)韭籽多肽含量均有不同程度影響,韭籽多肽含量在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)可達(dá)到極值。此外,由等高線可知,發(fā)酵時(shí)間等高線變化趨勢(shì)較韭籽粕濃度和初始pH陡峭。由此可推測(cè)發(fā)酵時(shí)間對(duì)所得多肽含量影響大于韭籽粕濃度和初始pH。由圖7可看出,在韭籽粕濃度和初始pH交互作用等高線中,等高線沿韭籽粕濃度軸變化的趨勢(shì)明顯高于初始pH軸,說(shuō)明韭籽粕濃度對(duì)黑曲霉發(fā)酵韭籽粕制備得到韭籽多肽含量影響較初始pH大。綜上所述,各因素對(duì)韭菜籽蛋白提取率的影響主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間>韭籽粕濃度>初始pH。

圖6 韭籽粕濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵韭籽粕 制備得到韭籽多肽影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Responsive surfaces and contour plot of the effect of concentration of Chinese leek seed meal and fermentation time on the concentration of leek polypeptide

圖7 韭籽粕濃度和初始pH對(duì)黑曲霉發(fā)酵韭籽粕 制備得到韭籽多肽影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Responsive surfaces and contour plot of the effect of concentration of Chinese leek seed meal and initial pH on the concentration of leek polypeptide

圖8 初始pH和發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵韭籽粕 制備得到韭籽多肽影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Responsive surfaces and contour plot of the effect of concentration of initial pH and fermentation time on the concentration of leek polypeptide

2.3.2 最佳提取條件及驗(yàn)證 由Design-Expert軟件分析三個(gè)因素最優(yōu)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)為:濃度9.40%,初始pH3.06,發(fā)酵時(shí)間3.04 d,在此點(diǎn)的韭籽多肽含量是593.34 μg/mL。按照實(shí)驗(yàn)操作的可行性,將最佳條件調(diào)整為韭籽粕濃度9.4%,初始pH3.0,發(fā)酵時(shí)間3.0 d,根據(jù)優(yōu)化得到的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,發(fā)酵結(jié)果的平均韭籽多肽含量是573.55 μg/mL,與理論值相差3.45%(相對(duì)誤差<5%),說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好,通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型回歸方程及最佳條件可靠。

2.4 抗氧化性能檢測(cè)

2.4.1 韭籽多肽和BHT對(duì)DPPH·的清除效果 由圖9看出,以BHT為對(duì)照,隨著韭籽多肽濃度的提高,清除能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)濃度為2.0 mg/mL時(shí),清除率達(dá)66.3%。

圖9 韭籽多肽和BHT清除DPPH·的能力Fig.9 The scavenging of DPPH free radicals by leek polypeptide and BHT

2.4.2 韭籽多肽和BHT的總還原力 抗氧化劑通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基,還原力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng)。因此,可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性的大小[31]。由圖10可知,隨著韭菜籽濃度提高(0.1～2.0 mg/mL),還原力逐漸增強(qiáng)。

圖10 韭籽多肽和BHT的總還原力Fig.10 The total reducing power of leek polypeptide and BHT

3 結(jié)論

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析,得到具有較好擬合度的回歸方程模型,該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從而確定優(yōu)化條件。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),優(yōu)化后實(shí)際響應(yīng)值與預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)值間擬合程度良好,表明中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析在提取條件優(yōu)化方面的應(yīng)用具有實(shí)際指導(dǎo)作用。最終的優(yōu)化條件為:韭菜籽粕濃度為9.4%,初始pH為3.0,發(fā)酵時(shí)間為3.0 d,在此條件下韭籽多肽含量是573.55 μg/mL。

對(duì)在最佳黑曲霉發(fā)酵工藝條件下制備得到韭籽多肽對(duì)DPPH·的清除能力以及總還原力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明韭籽多肽具有抗氧化活性。

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Optimization on the production of polypeptide from Chinese leek seed meal byAspergillusnigerliquid fermentation

SUN Jie1,YIN Guo-you1,Qi Wang2,LIU Wen-xia1,LI Wen-jian1,ZHANG Xian-qing1

(1.College of Life Science and Engineering,Henan University of Urban Construction,Pingdingshan 467036,China;2.Guelph Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada,Guelph,Ontario,N1G5C9,Canada)

The optimum extraction conditions of bioactive peptides from Chinese leek seed meal by usingAspergillusnigerliquid fermentation were investigated using the response surface method(RSM)and the antioxidant activity of extract was obtained under optimum extraction conditions in order to make full use of the by-product of Chinese leek seed meal. The results indicated that the effect order of the three factors on the peptide extraction from Chinese leek seed meal was fermentation time>substrate concentration>initial pH,and the optimum extraction conditions were substrate concentration 9.4%,initial pH3.0,fermentation time 3 d. Under the optimal conditions,the extraction rate of peptide from Chinese leek seed meal was 573.55 μg/mL. Antioxidant activity of the leek polypeptide from Chinese leek seed meal,including the DPPH· and reducing power measure. The results showed that the leek polypeptide possessed antioxidant propertiesinvitro. And with the concentration of polypeptides increasing,its antioxidant activity gradually becomes stronger.

leek polypeptide;response surface method;liquid state fermentation;antioxidant activity

2016-08-04

孫婕(1976-)，女，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化及功能性質(zhì)研究，E-mail：sunjie124@163.com。

河南省科技計(jì)劃重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(132102210192，152102210091)；河南省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(152107000052); 河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(17A550008)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)05-0199-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.029