阮 萍，黃 威，李鐵柱*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，長春130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 長春 130033)

復合菌種固態(tài)發(fā)酵飼料的工藝優(yōu)化

阮 萍1,2，黃 威2，李鐵柱1,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，長春130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 長春 130033)

以玉米粉和豆粕為底料，采用復合菌種進行固態(tài)發(fā)酵。在單因素實驗的基礎上，確定接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間作為實驗參數(shù)。以可消化粗蛋白含量作為指標，利用正交實驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵參數(shù)為接種量1%、發(fā)酵時間3d、發(fā)酵溫度30℃。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中可消化粗蛋白含量為29.58%，較初始物料提高了57.09%。

復合菌種；發(fā)酵飼料；正交實驗；可消化粗蛋白

隨著人類生活水平的提高，人們對于優(yōu)質(zhì)蛋白食物的需求量逐漸攀升，從而刺激了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。但是，在養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展過程中，對飼料業(yè)的依賴性也在與日俱增。據(jù)統(tǒng)計，我國的飼料產(chǎn)量供不應求，主要靠進口解決，預計到2030年，我國蛋白飼料的缺口將要達到2790萬噸[1-2]。而發(fā)酵飼料作為一種新型環(huán)保飼料，已經(jīng)成為當今熱點研究方向。通過微生物發(fā)酵手段來發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)物，可以改善產(chǎn)品品質(zhì)以及適口性[3-5],且微生物分泌的蛋白酶可分解胰蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子,提高消化吸收率和飼用價值,降低生產(chǎn)成本，減少疾病的發(fā)生,改善飼料對環(huán)境的污染，最終為人類提供全天然無公害營養(yǎng)價值高的飼料產(chǎn)品[6-7]。目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的發(fā)酵方式已從單一菌種的發(fā)酵趨向于復合菌株的協(xié)同發(fā)酵,并注重不同微生物之間的協(xié)同性、互補性[8]。由于發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)和其他生物活性物質(zhì)，將其添加于飼料中，可有效提高畜禽的生長率[9-12]。此外，固態(tài)發(fā)酵本身成本低，可利用資源豐富，對環(huán)境污染小，在許多方面要優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵，現(xiàn)已成為能源開發(fā)的新途徑[13-15]。

利用50L全自動固體發(fā)酵罐，進行復合菌種發(fā)酵飼料的生產(chǎn)。將四種菌種混合作為發(fā)酵種子液，以玉米粉和豆粕為底料，確定接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速作為參數(shù)，進行單因素實驗。最后通過進行正交實驗，優(yōu)化發(fā)酵罐生產(chǎn)的最佳工藝條件。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試材料

玉米粉和豆粕(比例2:1)由吉林省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.1.2 實驗菌種

復合菌種：包括植物乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母。菌種保存于吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、蒸餾水1L。121℃滅菌20min[16]。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉2g、葡萄糖20.0g、吐溫80 1ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸鈉2.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、蒸餾水1L。115℃滅菌20min[16]。

1.1.4 實驗試劑

蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、磷酸二氫鉀：北京化工廠。吐溫80、檸檬酸鈉、胰蛋白酶：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅：天津市福晨化學試劑廠。胃蛋白酶：Biosharp試劑公司。三氯乙酸：天津市光復精細化工研究所。 硫酸鉀、氯化鉀：西隴化工股份有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本Sanyo公司。AUY220電子分析天平：日本島津有限公司。HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司。Evolution RC高速冷凍離心機：Thermo Stovall公司。101A-2電熱恒溫鼓風干燥箱：上海試驗儀器廠有限公司。HY-04A高速粉碎機：北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司。BCN-1360B超凈工作臺：哈東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。Molgene1810a超純水器：重慶摩爾水處理設備公司。 HYP-Ⅱ消化爐：上海纖檢儀器有限公司。2300全自動凱氏定氮儀：FOSS。DELTA320pH計：METTLER。55SS-50L固態(tài)發(fā)酵罐：上海保興生物設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單因素實驗

對可能影響微生物飼料發(fā)酵的主要因素進行單因素實驗，主要包括：接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速。通過對發(fā)酵產(chǎn)物中可消化粗蛋白含量的測定，確定影響發(fā)酵的因素。

1.3.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進行正交實驗分析，從接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速四個因素中篩選出對發(fā)酵工藝有重要影響的三個參數(shù)，以發(fā)酵樣品中的可消化粗蛋白為指標，通過正交試驗，對發(fā)酵條件進行工藝優(yōu)化。

1.3.3 可消化粗蛋白的測定

體外消化率的測定采用兩步酶法測定[17]。稱量發(fā)酵樣品1g置于100mL三角瓶中，加入10mL，0.03g的胃蛋白酶溶液(pH=2.0)后，放入搖床中，以37℃、180r/min恒溫振蕩6h。取出后，加入少許10mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)至中性pH。加入50mL、0.025g的胰蛋白酶(pH=7.6)后，放入搖床中以37℃、180r/min恒溫振蕩18h。取出后，用5%的三氯乙酸溶液分三次，每次5mL沖洗三角瓶后，轉(zhuǎn)入100mL離心管中，離心管先稱重、編號。放入離心機，4℃、8000g、離心20min后取出。取出后，倒出上清液，剩余殘渣及離心管一起放入60℃烘箱中，烘干至恒重，計算殘渣重量。將發(fā)酵殘渣及發(fā)酵樣品一起用凱式定氮儀測定蛋白含量?？上值鞍椎挠嬎惴椒ㄒ妳⒖嘉墨I[18-19]。

可消化粗蛋白含量計算公式如下：

V1：滴定試樣時所需標準鹽酸溶液的體積(mL)；

V2：滴定空白時所需標準鹽酸溶液的體積(mL)；

C：鹽酸標準溶液濃度(mol/L)；

m：試樣質(zhì)量(g)；

0.014：每毫克當量氮的克數(shù)；

6.25：氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間3d、攪拌轉(zhuǎn)速35rpm時，接種量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%時，可消化粗蛋白含量如圖1所示。由圖1可知，當接種量為0.5%～1%時，可消化粗蛋白含量隨著接種量的增大而增大；當接種量為1%時，可消化粗蛋白含量為26.51%；當接種量超過1%時，可消化粗蛋白含量開始下降，且趨于平穩(wěn)。以節(jié)約成本為前提，在接種量為1%時，發(fā)酵效果最佳。

圖1 接種量對可消化粗蛋白含量的影響

圖2 發(fā)酵溫度對可消化粗蛋白含量的影響

2.2發(fā)酵溫度對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為接種量為1%、發(fā)酵時間為3d、攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm時，發(fā)酵溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃時，可消化粗蛋白含量如圖2所示。由圖2可知，當發(fā)酵溫度為20℃～25℃時，可消化粗蛋白含量趨于平穩(wěn)；當發(fā)酵溫度為25℃～30℃時，可消化粗蛋白含量隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸上升；當發(fā)酵溫度為30℃時，可消化粗蛋白含量為27.83%；當發(fā)酵溫度高于30℃時，可消化粗蛋白含量開始隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸下降。原因可能是，隨著發(fā)酵溫度增加，菌體生長速度快，如果發(fā)酵溫度持續(xù)增加，菌體生長過快，易產(chǎn)生衰老，導致菌體自溶使粗蛋白含量降低。所以，當發(fā)酵溫度為30℃時，可消化粗蛋白含量最高，發(fā)酵效果最佳。

2.3 發(fā)酵時間對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為接種量為1%、發(fā)酵溫度為30℃、攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm時，發(fā)酵時間分別為1d、2d、3d、4d、5d時，可消化粗蛋白含量如圖3所示。由圖3可知：當發(fā)酵時間為1d～3d時，可消化粗蛋白含量隨著時間的增加而增加；當發(fā)酵時間為3d時，可消化粗蛋白含量為26.78%；當發(fā)酵時間超過3d時，可消化粗蛋白含量開始下降?？赡苁怯捎跁r間的增加，發(fā)酵物質(zhì)缺乏，菌體繁殖分解了部分蛋白。所以，當發(fā)酵時間為3d時，可消化粗蛋白含量最高，發(fā)酵效果最佳。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為接種量為1%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間為3d時，攪拌轉(zhuǎn)速分別為25rpm、30rpm、35rpm、40rpm、45rpm時，可消化粗蛋白含量如圖4所示。由圖4可知：當攪拌轉(zhuǎn)速為25rpm～35rpm時，可消化粗蛋白含量隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加而增加；當攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm時，可消化粗蛋白含量為24.97%；當攪拌轉(zhuǎn)速超過35rpm時，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加可消化粗蛋白含量減少。原因可能是，轉(zhuǎn)速過高，容易剪切菌絲造成細胞損傷，形成短矮的分支；轉(zhuǎn)速過低，溶氧供給不足，發(fā)酵變緩。雖然攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm時，可消化粗蛋白含量最高，但是如圖4所示，整條折線變化趨勢平穩(wěn)，差異不明顯。所以攪拌轉(zhuǎn)速可以不作為影響發(fā)酵條件的重要參數(shù)。

圖3 發(fā)酵時間對可消化粗蛋白含量的影響

圖4 攪拌轉(zhuǎn)速對可消化粗蛋白含量的影響

2.5 正交實驗

在上述實驗的基礎上，進一步對發(fā)酵條件進行工藝優(yōu)化。選擇接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間三個因素作為實驗參數(shù)，進行L9(33)三因素三水平的正交實驗，如表1所示。

表1 正交實驗因素和水平

正交實驗結(jié)果如表2所示?？梢姡琑A>RC>RB，即接種量對發(fā)酵產(chǎn)物的可消化粗蛋白含量影響最為顯著，然后是發(fā)酵時間，而發(fā)酵溫度的影響最小。最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C2，即接種量為1%、發(fā)酵時間為3d、發(fā)酵溫度為30℃。此時發(fā)酵產(chǎn)物的可消化粗蛋白含量為29.58%。

表2 正交實驗結(jié)果

3 結(jié)果與討論

利用混合菌種進行固態(tài)發(fā)酵，可以將非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，而且菌體分泌的胞外酶可以有效地分解大分子蛋白為小肽和氨基酸，大大提高了可溶性蛋白的含量[20]。由此可見：通過復合菌種固態(tài)發(fā)酵，可提高飼料的營養(yǎng)價值，有利于動物的消化吸收。在本項工作中，利用單因素實驗，確定了影響發(fā)酵效果的三個參數(shù)，分別為接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間。通過正交實驗得到的最佳工藝條件為：接種量1%、發(fā)酵時間3d、發(fā)酵溫度30℃。經(jīng)測定，未經(jīng)發(fā)酵的飼料底物中可消化粗蛋白含量為18.83%。在最優(yōu)實驗條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中可消化粗蛋白含量為29.58%，較初始物料提高了57.09%。

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責任編輯：程艷艷

Optimization for Process of Solid State Fermentation Feed with Composite Bacteria

RUAN Ping1,2，HUANG Wei2，LI Tiezhu1,2*

(1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118, China；2. Institute of Agricutural Products Processing Research, Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033, China)

With corn flour and soybean meal as the base materials, the solid state fermentation was carried out by composite bacteria. On the basis of single factor experiment, the inoculation amount, fermentation temperature and fermentation time were chosen as the experimental parameters. The fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment with utilizable crude protein (uCP) as indexes. The results showed that the optimal fermentation parameters were inoculation amount 1%, fermentation time 3d and fermentation temperature 30℃. Under this condition, the content of utilizable crude protein in fermentation products was 29.58%, which was increased by 57.09% compared to the raw materials.

composite bacteria; fermentation feed; orthogonal experiment; utilizable crude protein

2016-12-23

吉林省科技廳重大科技攻關(guān)專項(20140203014NY)，吉林省科技廳重點科技攻關(guān)項目(20140204051YY)。

阮萍(1992-)，女，遼寧鞍山人，研究實習員，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工及儲藏工程方面研究。

李鐵柱(1978-)，男，吉林長春人，博士，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及儲藏工程方面的研究。

TQ920.6

A

1009-3907(2017)04-0033-05