李佳樂(lè)，夏軼超，澈力格爾，劉 敏，王梓霖， 韓 冰*

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

三維打印雙相磷酸鈣陶瓷支架在骨組織工程中的應(yīng)用

李佳樂(lè)1，2，夏軼超1，澈力格爾1，劉 敏1，王梓霖1， 韓 冰1*

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的 探索研究三維打印技術(shù)制備的由羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)組成的雙相磷酸鈣陶瓷(BCP)支架在骨組織工程中的應(yīng)用潛力，為其作為骨組織工程支架提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 通過(guò)三維打印技術(shù)制備質(zhì)量比為3∶7的HA/β-TCP復(fù)合納米支架，掃描電鏡(SEM)觀察支架形態(tài)。將支架與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)；通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)支架的生物相容性以及種子細(xì)胞在支架上的增殖分；并以相同材料制備的壓模片進(jìn)行比較。結(jié)果 三維打印技術(shù)制備的雙相磷酸鈣陶瓷支架為三維均勻多孔隙結(jié)構(gòu)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能夠在此支架上很好的增殖，分化。結(jié)論 三維打印制備雙相磷酸鈣陶瓷支架有較好的相容性，可促進(jìn)細(xì)胞的分化，可作為細(xì)胞支架應(yīng)用于骨組織工程中。

三維打印技術(shù)； 納米羥基磷灰石； β-磷酸三鈣 ；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 骨組織工程

(ChinJLabDiagn,2017,21:0878)

因先天畸形、自然災(zāi)害及交通事故所致外傷、腫瘤及感染等各種因素引起的骨缺損在臨床上十分常見(jiàn)。這些骨缺損不同程度地影響著患者缺損部位的形態(tài)與功能，常常給患者帶來(lái)極大的不便[1]。傳統(tǒng)的治療方法都有著各自的局限性。如自體骨移植于供骨區(qū)的二次損傷，來(lái)源有限；同種異體骨移植雖經(jīng)過(guò)處理，但易引起免疫反應(yīng)，易吸收易感染等；人工骨材料如金屬等在力學(xué)性能及生物學(xué)性能上與骨組織存在顯著的差異等[2,3]。由于現(xiàn)行骨缺損修復(fù)方法存在以上問(wèn)題，骨組織工程修復(fù)骨缺損受到了越來(lái)越多的重視，已成為臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究的重點(diǎn)。

組織工程包括支架，種子細(xì)胞，生長(zhǎng)因子這三個(gè)關(guān)鍵因素。其中，骨支架的性能常常影響組織工程的成敗。理想的骨支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性，生物力學(xué)性，生物降解性。同時(shí)又應(yīng)具有較高的可塑性，且易于加工，來(lái)源充足等優(yōu)點(diǎn)[4,5]。

雙相磷酸鈣(Biphasic calcium phosphate,BCP)，由羥基磷灰石(HA)和β-磷酸三鈣(β-TCP)組成。其化學(xué)成分與骨組織的無(wú)機(jī)成分相似，目前已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架的研究中，對(duì)于骨缺損的修復(fù)和重建中有著重要的研究?jī)r(jià)值。

支架的制備方法大致分為相分離法，氣體發(fā)泡法，熔鹽法，微球法等傳統(tǒng)制備方法。然而，這些傳統(tǒng)方法都不能精確的控制其孔隙。三維打印技術(shù)是根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的模型，通過(guò)逐層沉積以完成整個(gè)支架的制備，可以精確地完成形狀以及孔隙的要求[6]。

本實(shí)驗(yàn)使用雙相磷酸鈣陶瓷作為支架材料，利用三維打印技術(shù)，制備質(zhì)量比為HA/β-TCP：30/70的準(zhǔn)確控制孔隙大小結(jié)構(gòu)的三維雙相磷酸鈣陶瓷支架，研究微觀支架結(jié)構(gòu)，及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上的增殖，探討其應(yīng)用于骨組織工程的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 普通級(jí)健康新西蘭大白兔，2周齡，體重約300 g，雌雄不限，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 試劑和材料 L-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；CCK-8(Sigma，美國(guó))；HA、β-TCP、PVA(中科院上海市硅酸鹽研究所)。

1.1.3 主要儀器 三維打印機(jī)(弗勞恩霍夫研究所，德國(guó))；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)；酶標(biāo)儀(Bio-RAD，美國(guó))；掃描電鏡(SEM,SHIMADZU SSX-550，日本)。

1.2 方法

1.2.1 支架的制備 制備的支架為圓柱狀，高3 mm，直徑3 mm?？紫稙檎叫危讖綖?00 μm。在打印制備中，選擇納米 HA 和納米 β-TCP粉末為原材料，以質(zhì)量比為30∶70 的比例混合。以聚乙烯醇(poly vinyl alcohol ，PVA)為粘結(jié)劑。將上述 10 g 混合粉末與 5.6 g PVA 水溶液(質(zhì)量比為6%)均勻混合配成可注射型的膏狀物。噴射針頭的壓力控制在 200 到400KPa 之間，控制移動(dòng)速度為 6 mm/s。根據(jù)預(yù)定模型數(shù)據(jù)控制噴射針頭在三維方向的定向移動(dòng)分層打印，直至整個(gè)支架打印完成。初模型在室溫下干燥過(guò)夜，第二天在1 100℃燒結(jié)3 h，BCP 支架最終成型[7]。同期制備BCP壓模片材料作為對(duì)照。將上述混合好的粉末放置于模具中，用5 Mpa的壓縮強(qiáng)度制成與三維打印支架材料直徑及高度相同的圓柱形，同樣于1 100℃燒結(jié)3 h，制備成型。

1.2.2 SEM表面形態(tài)觀察 干燥后的支架表面噴金，對(duì)其表面進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。

1.2.3 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的分離培養(yǎng) 兔處死脫毛處理后，置入75%的酒精中消毒，移至超凈臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下解剖分離出雙下肢骨，剪去骨一端，用內(nèi)含配置好的培養(yǎng)基的注射器抽取骨髓腔內(nèi)骨髓。后將抽取的骨髓-培養(yǎng)液注射入培養(yǎng)瓶中。于37℃孵箱中靜置培養(yǎng)。靜置72 h后行第一次半換液。后常規(guī)培養(yǎng)傳代。傳至第三代時(shí)即為需要的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[8]。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將組織培養(yǎng)板表面(tissue culture plate surface,TCPS)作為空白組。即分為三組：實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組，空白組。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。支架及壓片經(jīng)去離子水超聲振蕩清洗，烘干，高壓蒸汽滅菌后放入96孔培養(yǎng)板中，每孔放置 1 件材料。取上述細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，每孔(材料表面和孔板底)接種細(xì)胞數(shù)量為2×103個(gè)，常規(guī)培養(yǎng)。分別于1 d、3 d、5 d、7 d后終止培養(yǎng)。在超凈臺(tái)中每孔加入CCK-8溶液10 μL后孵育，37℃，2 h。每孔吸取孔內(nèi)溶液，按照原來(lái)的順序加入到新的96孔板中，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各組溶液吸光度值A(chǔ)。按照下述公式計(jì)算細(xì)胞增殖活性：Cell viability(%)= A sample / A control ×100(其中A control 代表對(duì)照組的吸光度值，A sample 代表實(shí)驗(yàn)組的吸光度值。)

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析及T檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架的宏觀結(jié)構(gòu) 如圖1，采用三維打印技術(shù)制備的支架呈圓柱型，支架孔隙大小均勻，孔隙互相連通(圖1A)；壓制模片(圖1B)質(zhì)地均勻，表面光滑。

圖1 制備的雙相磷酸鈣陶瓷支架，1A所示為三維打印的三維多孔支架，1B為利用模具壓縮成型的模片

2.2 SEM觀察 支架表面結(jié)構(gòu)的掃描電鏡見(jiàn)圖2。可以看出三維打印制備的支架孔隙控制的十分均勻，大小一致，孔隙之間相互連接?？障洞笮≡?50-450 μm之間?？障侗诖植诓黄剑性S多可達(dá)微米級(jí)別的微孔。

圖2 三維打印 BCP 支架的掃描電鏡，BCP 支架表面的微觀結(jié)構(gòu)(2a,2b)，孔隙壁表面的微觀結(jié)構(gòu)(2c，2d)

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果 BMSC與支架共培養(yǎng)1,3,5,7 d 后各組支架表面粘附細(xì)胞吸光度值結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，各組的吸光度值隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增大，說(shuō)明細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加穩(wěn)定增長(zhǎng)。結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上可以穩(wěn)定生長(zhǎng)。在體外培養(yǎng) 1 d，3d，5 d，空白組的細(xì)胞數(shù)量明顯高于實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組組(P<0.05)。在1 d時(shí)，可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，而在第3 d，5 d 時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。培養(yǎng)7 d 后，對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量低于實(shí)驗(yàn)組及空白組(P<0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)制備的BCP支架中的HA和β-TCP是目前使用較多的已被驗(yàn)證性能較好的支架材料。β -TCP的成分與骨礦物組成相似，生物相容性好，被植入體內(nèi)后逐漸降解，最終無(wú)異物殘留，這使得材降解后所形成的新骨不受影響；而且新骨強(qiáng)度優(yōu)于新骨-材料結(jié)合的強(qiáng)度；但疲勞強(qiáng)度低，脆性大，力學(xué)性能一般，降解快[9]。HA的化學(xué)組成及晶體結(jié)構(gòu)與人骨骼中的磷灰石相類似，形態(tài)穩(wěn)定，力學(xué)性能良好，是公認(rèn)的性能良好的骨修復(fù)材料，但其降解速率緩慢[10]。通過(guò)調(diào)控兩種材料的混合比例，使得材料的降解率變的可調(diào)控，可滿足組織工程的降解要求。

*P<0.05、**P< 0.01。

這也是我們將HA與β -TCP的比例定為3∶7的原因之一。一方面，HA的低降解率和較好的力學(xué)性能可以緩和因β -TCP的快速降解而降低的支架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定與強(qiáng)度，使得支架在降解，細(xì)胞的增殖分化，新骨在形成的過(guò)程中仍有支架的“框架支撐”。另一方面，β -TCP在BCP中優(yōu)先于HA降解，產(chǎn)生較多的游離鈣、磷離子，“創(chuàng)造”其周圍的過(guò)飽和狀態(tài)，礦化物質(zhì)地沉積從而引導(dǎo)新骨形成，并吸引周圍的骨形成蛋白(BMPs)，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞方向分化，促進(jìn)成骨[11]。然而，過(guò)多的游離的鈣磷離子會(huì)引起炎癥反應(yīng)，使創(chuàng)口延期愈合，從而影響新骨形成[12]。 所以我們最終將兩種材料的比例設(shè)置為3∶7。

對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，100-500 μm孔隙率對(duì)于非常有利于細(xì)胞長(zhǎng)入[13],而據(jù)報(bào)道，如果孔徑大于300 μm，十分有利于血管化和骨再生[14]。在另一方面，如果孔徑較大，支架的力學(xué)性能將會(huì)大打折扣。最后，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備的孔隙大小定為400 μm。從SEM圖像可以很明顯的看出，通過(guò)三維打印技術(shù)制備的BCP支架有著350-450 μm大小的孔隙，且孔隙大小、分布均勻并互相連通，對(duì)細(xì)胞粘附增殖有良好促進(jìn)作用[15]。此外，鏡下可觀察到支架表面有很多微孔(圖 2.c,d)，這些微孔增加了材料的表面積，也增加了細(xì)胞在材料的表面粘附和增殖的空間。

CCK-8結(jié)果表示，在細(xì)胞培養(yǎng)1天和3天之后，實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞增殖比空白和對(duì)照組低。且空白組較其他兩組一直表現(xiàn)出較高的細(xì)胞數(shù)量。這似乎與我們的預(yù)期相矛盾。這可能是制備的細(xì)胞懸液在滴入支架進(jìn)行細(xì)胞接種時(shí)，有些細(xì)胞會(huì)通過(guò)支架的孔隙落入到孔板底部，未能成功種植于支架表面。這使得支架比其他兩組有更低的原始細(xì)胞的數(shù)量。在體外培養(yǎng)5天后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量已與對(duì)照組相接近，7天后就表現(xiàn)為高于對(duì)照組。這說(shuō)明，BCP支架顯示更優(yōu)良的的生物相容性。此外，在四個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，與其他兩組相比，空白組的細(xì)胞數(shù)量一直表現(xiàn)較高水平。這可能是培養(yǎng)孔板底經(jīng)過(guò)處理有著親水性能較好的表面而能促進(jìn)細(xì)胞的粘附，使得細(xì)胞更容易種植[16]。同時(shí)干細(xì)胞處于分化狀態(tài)時(shí)其增殖水平會(huì)減低甚至是停止，這也使得有支架材料的細(xì)胞數(shù)量較空白組表現(xiàn)“稍低水平”。培養(yǎng)后期，BCP支架與具有二維平面結(jié)構(gòu)的模片和空白對(duì)照組相比有著更大的表面積。由于細(xì)胞在限定空間內(nèi)增殖發(fā)生的接觸抑制，BCP支架表現(xiàn)出了更高的細(xì)胞增殖率，細(xì)胞數(shù)量也與孔板表現(xiàn)沒(méi)有明顯差距。

綜上所述，利用三維打印技術(shù)制備的多孔雙相磷酸鈣陶瓷骨支架具有良好的生物相容性，其互通完善、交通良好的均勻孔隙以方形的形式存在，表面粗糙的微孔形態(tài)也使得這種三維孔隙結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞粘附、增殖。本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了BCP支架在骨組織工程中應(yīng)用潛力，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及其臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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The application of Biphasic calcium phosphates ceramic scaffold by 3D printing in bone tissue engineering

LIJia-le,XIAYi-chao,CHELigeer,etal.

(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolandHospitalofStomatology,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To evaluated the biphasic calcium phosphates ceramic scaffold by 3D printing,which is consists of hydroxyapatite and β-tricalcium phosphate (HA/β-TCP),and provide the experimental basis used for bone tissue engineering.Methods 3D printing technology was applied to prepare porous BCP scaffolds，and BCP cylinder was were prepared by mold materials.The composition ratio of BCP (%HA/%β -TCP) was 30/70.Scaffold was observed by scanning electron microscopy (SEM) .Rabbit bone mesenchymal stem cells were seeded on the scaffolds and cultured together.Results Scaffold-BMSCs were investigated with regard to cellular,spreading and proliferation through analyses of CCK-8.Conclusion The BCP scaffold had a good biocompatibility and may be a promising material in bone tissue engineering.

3D printing technologies;Nano-hydroxyapatite;β-tricalcium phosphate;bone mesenchymal stem cells;bone tissue engineering

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉科教合字[2015]第525號(hào))

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0878-04

R783.1

A

2016-10-11)