藺 勇，馬志駿，喬寒棟，徐效義，張 揚*

(1．長春市中心醫(yī)院 神經(jīng)科，吉林 長春130051；2．吉林大學(xué)藥學(xué)院 生物藥學(xué)系，吉林 長春130022；3．吉林大學(xué)第一醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長春130021)

替莫唑胺聯(lián)合丙戊酸鈉對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

藺 勇1，馬志駿2，喬寒棟2，徐效義3，張 揚2*

(1．長春市中心醫(yī)院 神經(jīng)科，吉林 長春130051；2．吉林大學(xué)藥學(xué)院 生物藥學(xué)系，吉林 長春130022；3．吉林大學(xué)第一醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長春130021)

目的 觀察替莫唑胺(TMZ)與丙戊酸鈉(VPA)聯(lián)用對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44和U251生物學(xué)行為的影響。方法 將細(xì)胞分為對照組、VPA單用組、TMZ單用組和VPA-TMZ聯(lián)用組。分別采用MTT法檢測細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FLUOS染色法檢測細(xì)胞凋亡；DAPI染色法觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 VPA-TMZ聯(lián)用較TMZ/VPA單獨用藥，能有效抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44和U251的增殖，促進其凋亡且減弱其侵襲能力。結(jié)論 VPA可提高人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ的敏感性，為臨床合理用藥提供參考。

替莫唑胺；丙戊酸鈉；人腦膠質(zhì)瘤

(ChinJLabDiagn,2017,21:0885)

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)率、治療效果差、預(yù)后較差和存活率低等特點[1]。目前對于惡性膠質(zhì)瘤的治療方案多為手術(shù)結(jié)合術(shù)后放化療，但由于血-腦脊液屏障的存在，常規(guī)化療藥物對顱內(nèi)惡性腫瘤術(shù)后輔助治療的效果比較有限。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)因其脂溶性高，易于通過血腦屏障，且不良反應(yīng)輕，目前廣泛應(yīng)用于臨床[2,3]。但其單獨用藥易導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤產(chǎn)生耐藥，治療后患者中位生存期仍然少于15個月[4]。因此，尋找有效的TMZ藥物聯(lián)用策略，對于增強腦膠質(zhì)瘤化療效果，改善患者生存質(zhì)量，減少腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)尤為重要。

丙戊酸鈉(Valproic acid，VPA)是臨床常用的抗癲癇藥物，其在膠質(zhì)瘤術(shù)后預(yù)防癲癇的同時能夠增強化療藥物殺傷腫瘤的效果，并且對惡性腫瘤具有誘導(dǎo)分化作用[5]。本研究擬采用TMZ與VPA聯(lián)合用藥，觀察其對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44和U251生物學(xué)行為的影響，為進一步指導(dǎo)臨床VPA治療腦膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)，亦為TMZ與藥物聯(lián)用后提高其藥效提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器 TMZ及VPA購自美國Selleck公司；人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG-44和U251均由吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院腫瘤中心實驗室提供；DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自北京元亨金馬生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶購自長春寶泰克生物技術(shù)公司；EDTA、DMSO、ECM購自美國Sigma公司；MTT購自美國Amresco公司；AnnexinV-FLUOS凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；倒置顯微鏡和熒光顯微鏡，Olympus日本；流式細(xì)胞儀，BD美國。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 SHG-44和U251用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)增長期細(xì)胞進行藥物處理。分為4組：(1)DMSO(對照組，濃度為0.05%)；(2)VPA(0.5、1、2、4、8、16、32 mM)；(3)TMZ(0.05、0.1、0.5、1、5 mM)；(4)VPA+TMZ。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活 取對數(shù)增長期的兩種細(xì)胞，分別以1.0×104/ml和3.0×104/ml密度、每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，每組各設(shè)3個復(fù)孔。收集各時間點的細(xì)胞(0、24、48、72 h)，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，再加入DMSO溶劑150 μl，置于振蕩器避光直至甲瓚結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處吸光度(A值)，計算各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 AnnexinV-FLUOS染色法檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)增長期的兩種細(xì)胞，分別以1.0×104/ml和3.0×104/ml密度接種于6孔板內(nèi)過夜，棄上清，按分組處理細(xì)胞，每組各設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)板上各組培養(yǎng)基分別移至15 ml試管中并置于冰上備用；PBS洗滌細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后將細(xì)胞重懸于上一步所得培養(yǎng)基中；將細(xì)胞懸液移至一離心管，加入200 μl AnnexinV-FLUOS結(jié)合液輕混；室溫避光反應(yīng)10 min，1000 rpm離心5 min，棄上清；再加入190 μl AnnexinV-FLUOS結(jié)合液重懸后加入10 μl碘化丙啶(PI)，立即行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 DAPI染色法觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取對數(shù)增長期SHG-44細(xì)胞，以1.0×104/ml密度接種于6孔板內(nèi)，每孔2 ml。按分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)48 h；棄孔板內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每孔加入500 μl甲醇固定10 min；PBS洗滌2次，每孔加入200 μl DAPI染液，室溫避光反應(yīng)15 min；甲醇洗滌1次后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力 將ECM膠(8-12 mg/ml)置于4℃融化過夜，用預(yù)冷的無血清DMEM按1∶9稀釋(稀釋至1 mg/ml)；Transwell板上室每孔加入40 μl冰預(yù)冷的ECM膠，37℃放置20 min，平鋪膠化。收集對數(shù)增長期SHG-44細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105/ml，在Transwell板濾膜上方加入200 μl細(xì)胞懸液，孔板下室加入含30%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；取上室，棄室內(nèi)培養(yǎng)液，用棉簽拭去濾膜上的細(xì)胞，冰甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15-20 min，光鏡下觀察細(xì)胞。隨機取5個視野，高倍鏡(×200)下計數(shù)每個視野內(nèi)穿過微孔的細(xì)胞數(shù)，以遷移細(xì)胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理和分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本顯著性比較用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VPA、TMZ單獨及聯(lián)用對細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測兩種細(xì)胞存活率變化。在SHG44細(xì)胞中，除0.5 mM低濃度外，VPA單獨作用48 h該細(xì)胞活性隨著其濃度增加而減弱(P<0.01)；在U251細(xì)胞中，VPA單獨作用48 h且濃度≥4 mM時，對該細(xì)胞存活有顯著的抑制作用(P<0.05)，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強。VPA對兩種細(xì)胞的IC50約為16mM(圖1a)。除0.05、0.1 mM低濃度外，TMZ其余濃度組作用48 h均能顯著抑制兩種細(xì)胞的存活(P<0.01)。結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，TMZ抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，且對兩種細(xì)胞的IC50約為1 mM(圖1b)。在后續(xù)實驗中，鑒于VPA具有提高TMZ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷能力，故選取低濃度1、2 mM作為后續(xù)VPA-TMZ聯(lián)用的實驗濃度。

圖1 VPA、TMZ單獨作用48 h對兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

如表1所示，與單獨用藥組相比，VPA-TMZ聯(lián)用兩種細(xì)胞的存活率都有所減少(P<0.01)。提示經(jīng)VPA作用后，在一定程度上增強了TMZ對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.2 VPA-TMZ聯(lián)用對細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FLUOS染色法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，低濃度VPA(1、2 mM)作用于兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，其細(xì)胞凋亡率較對照組無明顯差別(P<0.05)；單用TMZ組兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率略有增多但不顯著；與單用VPA/TMZ相比，VPA-TMZ聯(lián)用均使兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及壞死率明顯增多(P<0.01)，以2 mM VPA +1 mM TMZ促細(xì)胞凋亡效果最為顯著(圖2)。

2.3 VPA-TMZ聯(lián)用SHG-44細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化

經(jīng)DAPI染色免疫熒光觀察VPA-TMZ聯(lián)用對膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化(圖3)。對照組細(xì)胞核形完整，染色質(zhì)均勻；VPA單用組的細(xì)胞形態(tài)及熒光顯色上與對照組無明顯差別；單用TMZ后細(xì)胞體積有所增大，凋亡數(shù)量增多，且熒光染色減弱；而VPA-TMZ聯(lián)用組細(xì)胞凋亡明顯增多，染色質(zhì)固縮，周邊化聚集，甚至細(xì)胞核破裂形成碎片，核解體。

表1 VPA-TMZ聯(lián)用對膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.4 Transwell檢測VPA-TMZ聯(lián)用對SHG-44細(xì)胞侵襲能力的影響

細(xì)胞侵襲實驗顯示，在鋪有ECM凝膠的Transwell小室中，與空白對照組(255±13)及單用VPA組(247±11)或TMZ組(156±23)相比，VPA-TMZ聯(lián)用組穿膜細(xì)胞數(shù)(86±9)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)，表明二者聯(lián)用能有效減弱SHG-44細(xì)胞侵襲能力。

3 討論

目前美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)、歐洲腫瘤聯(lián)盟(ESMO)和我國均推薦將TMZ列為初治及復(fù)發(fā)惡性膠質(zhì)瘤最重要的一線化療藥物，但其總體預(yù)后不樂觀。因此尋找增強TMZ藥物敏感性，提高TMZ療效的輔助化療藥物十分必要。

研究者們發(fā)現(xiàn)VPA作為組蛋白去乙酞化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和分化，可抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、腺病毒5DNA轉(zhuǎn)化HEK細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、淋巴單核細(xì)胞、鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和肺癌細(xì)胞株等生長增殖，或是阻礙血管生成、抑制轉(zhuǎn)移，從而達到治療腫瘤的目的[6-11]。此外，VPA因半衰期長、生物利用性較好及有效藥物濃度較低等特點，在臨床輔助治療方面有一定的優(yōu)勢。例如腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期應(yīng)用VPA可顯著降低癲癇發(fā)生率，不良反應(yīng)小，且安全性較好[12]。

圖2 VPA-TMZ聯(lián)用對SHG-44(a)和U251(b)細(xì)胞凋亡的影響

圖3 VPA-TMZ聯(lián)用SHG-44細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化

圖4 VPA-TMZ聯(lián)用對SHG-44細(xì)胞侵襲能力的影響

VPA不僅可以單獨應(yīng)用，還可以與傳統(tǒng)化療藥物TMZ聯(lián)合應(yīng)用治療惡性腫瘤，尤其是惡性程度極高的腦膠質(zhì)瘤。有報道[13]，VPA-TMZ聯(lián)用對TMZ敏感型腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(T98、U138)的增殖和遷移抑制，以及凋亡和自噬誘導(dǎo)有良好的協(xié)同效應(yīng)；體內(nèi)實驗亦觀察到聯(lián)合用藥可降低膠質(zhì)瘤移植模型腫瘤的生長。此外，Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示，VPA協(xié)同放療及TMZ對藥物敏感性膠質(zhì)瘤患者有較好的耐受性[14]，且延長其生存時間，提高其生活質(zhì)量[15]。

本實驗通過利用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色法和Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實驗等技術(shù)，觀察到VPA-TMZ聯(lián)用較TMZ/VPA單獨用藥，能有效抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44和U251的增殖，促進其凋亡且減弱其侵襲能力。邵翠杰等亦證實體外VPA在1 mM濃度時，能夠增強TMZ對大部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用[16]。因此，VPA聯(lián)合TMZ可能成為膠質(zhì)瘤臨床化療過程中候選治療措施，為提高膠質(zhì)瘤化療效果提供參考。

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Study on effects of biological activity by temozolomide combined with valproic acid on human glioma cells

LINYong1,MAZhi-jun2,QIAOHan-dong2,etal.

(1.DepartmentofNeurobiology,ChangchunCentralHospital,Changchun130051，China;2.DepartmentofBiologicalPharmacy,SchoolofPharmaceuticalSciences,JilinUniversity;3.InstituteofTranslationMedicine,theFirstHospitalofJilinUniversity)

Objective The main aim of the present study was to observe the effects of biological activity by TMZ combined with VPA on human glioma cells.Methods Cultured cells were divided into 4 groups:Control,VPA,TMZ and VPA-TMZ.MTT assay were used to detect the cell proliferation,and the cell proliferation rate were calculated;cell apoptosis was assayed using flow cytometry with Annexin V-FLUOS staining;morphological changes of apoptotic cells was observed by DAPI staining;invasionability of cells was detected with Transwell chamber.Results VPA combined with TMZ caused a more significant inhibition of SHG-44 and U251cells.The combination of these two drugs enhanced the apoptotic cell death,as well as suppressed the invasive abilities in glioma cells compared with the monotherapy groups.Conclusion VPA could enhance the sensitivity of human glioma cells to TMZ.The clinical efficacy of TMZ in malignant glioma may be improved by combination with VPA.

Temozolomide;Valproic acid;human glioma cell

吉林省衛(wèi)生廳重點實驗室項目(2012Z114)和吉林省科技廳自然科學(xué)基金項目(20130101173JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0885-05

R739

A

藺勇，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病臨床和基礎(chǔ)研究。

2016-08-20)