高翠珠，楊紅玲，黃夏宇騏，黃俊斌，李國慶，鄭露

（華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院湖北省作物病害監(jiān)測與安全控制重點實驗室，武漢 430070）

湖北省設施草莓灰霉病發(fā)生規(guī)律及流行因子分析

高翠珠，楊紅玲，黃夏宇騏，黃俊斌，李國慶，鄭露

（華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院湖北省作物病害監(jiān)測與安全控制重點實驗室，武漢 430070）

【目的】草莓灰霉病是一種世界范圍分布的真菌病害，研究旨在探索湖北省設施草莓灰霉病的發(fā)生規(guī)律，分析不同流行因子與灰霉病發(fā)生的相關性，選擇與果實發(fā)病率具有顯著相關性因子建立模型，揭示不同因子與草莓灰霉病發(fā)生的關系，為湖北省設施草莓灰霉病防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā坑?013—2015年在湖北省農(nóng)業(yè)科學院草莓種植基地選取3個代表性草莓大棚，用5點取樣法采集無癥花、葉、果實，結合特異性PCR和保濕培養(yǎng)法檢測組織上灰霉菌帶菌率；選取其中兩個大棚數(shù)據(jù)對草莓果實發(fā)病率與花朵發(fā)病率、葉片發(fā)病率、溫度、相對濕度、果實帶菌率、花朵帶菌率、葉片帶菌率7個流行因子進行Pearson相關性分析。選擇與果實發(fā)病率具有顯著相關性的3個因子（果實帶菌率x5、葉片發(fā)病率x2、溫度x3），以草莓果實發(fā)病率作因變量（y），因子x2、x3、x5為自變量，采用線性回歸法建立線性回歸方程，分別建立兩個大棚中變量x2、x3、x5與草莓果實發(fā)病率（y）的回歸模型，通過回歸模型計算未參加建模的另一個大棚的草莓果實發(fā)病率預測值，并將預測值與實際值進行回歸分析?！窘Y果】2013—2015年研究結果表明，草莓花、葉、果實帶菌率變化起伏較大，花和果實帶菌率相對較高，帶菌率分別為0—53.33%和0—86.00%；不同組織草莓灰霉病的發(fā)病時間不同，果實從12月上旬開始發(fā)病，花從12月中下旬開始發(fā)病，葉片從1月上旬或2月上旬開始發(fā)病。草莓花和葉發(fā)病較輕，發(fā)生較為平穩(wěn)，果實在3月之后發(fā)病逐漸加重，發(fā)病率可達 80.07%。草莓葉片發(fā)病率、溫度和果實帶菌率均與果實發(fā)病率呈顯著相關（P＜0.01）。草莓果實發(fā)病率與不同流行因子的回歸模型分別為 y=0.55x5+5.76（R2=0.645，P＜0.01）（模型一）、y=8.18x2+9.25（R2=0.498，P＜0.01）（模型二）、y=2.49x3-13.62（R2=0.446，P＜0.01）（模型三）；并將果實發(fā)病率預測值與實際值進行回歸分析，模型一中實際果實發(fā)病率與預測發(fā)病率擬合效果最好。【結論】在湖北省設施草莓大棚中，果實帶菌率、葉片發(fā)病率、溫度對草莓果實發(fā)病影響最為顯著，在防治過程中應及時摘除發(fā)病組織，降低果實帶菌率，預防灰霉病發(fā)生。

草莓灰霉病菌；帶菌率；發(fā)病率；相關性

0 引言

【研究意義】由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的草莓灰霉病是一種常見的設施果蔬病害[1]。該病主要危害果實、花瓣和葉片，病原以菌核、菌絲體和分生孢子形態(tài)存在于土壤或者病殘體中，翌年通過氣流、農(nóng)事操作等多種途徑進行傳播，可通過表皮或傷口侵入植物組織造成危害[2-5]。近些年，設施草莓面積迅速增加，但是由于大棚設施簡陋和長期連作等原因，灰霉病發(fā)生逐年加重，一般輕者減產(chǎn)10%—20%，嚴重可減產(chǎn)50%以上[6]。由于環(huán)境的特殊性，灰霉病一旦發(fā)生，往往導致毀滅性損失[7-8]。因此，深入了解設施草莓灰霉病的發(fā)生規(guī)律可為科學合理地使用殺菌劑[9-10]、制定生態(tài)調(diào)控措施提供決策依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】國內(nèi)外對草莓灰霉病流行規(guī)律已有一些研究。WAKEHAM等[11]在田間不同高度安裝孢子捕捉器監(jiān)測灰霉菌分生孢子數(shù)量，并分析了溫度、相對濕度以及風速與分生孢子數(shù)量的關系，發(fā)現(xiàn)高度與分生孢子的數(shù)量成反比，溫度和相對濕度與孢子數(shù)量沒有顯著性，風速與孢子數(shù)量呈顯著相關性。草莓灰霉病的發(fā)生受地形、氣候、種植方式和管理水平等多種因素的影響[12]。張亞等[13-15]對湖南省設施草莓灰霉病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)、草莓品種、大棚類型以及輪作和連作棚等栽培方式下的草莓大棚中灰霉病發(fā)生嚴重程度存在差異；羅軍等[16]對浙江金華地區(qū)大棚草莓灰霉病的發(fā)病特點進行研究，發(fā)現(xiàn)大棚連作田塊發(fā)病嚴重，且灰霉病初現(xiàn)比新建大棚提前30 d左右。在溫室里氣候條件是嚴重影響灰霉病的發(fā)生和流行的主要因素，平均溫度與相對濕度與病害發(fā)病率呈顯著相關性[17-18]；花期長時間保持高濕條件灰霉病發(fā)生嚴重[19-20]。韓永超等[21]研究發(fā)現(xiàn)草莓果實易從與花瓣接觸的地方開始發(fā)病，灰霉菌侵染草莓的花和果實引起花枯和果腐；死亡的草莓葉片上分生孢子易感染草莓果實發(fā)病[5]?！颈狙芯壳腥朦c】湖北省是中國重要的草莓產(chǎn)區(qū)，但迄今為止，在湖北省還未系統(tǒng)開展設施草莓灰霉病流行規(guī)律研究。【擬解決的關鍵問題】于2013—2015年對湖北省草莓灰霉病的發(fā)生動態(tài)進行系統(tǒng)調(diào)查，同時對無癥組織帶菌率進行檢測，分析大棚溫濕度、組織帶菌率與灰霉病發(fā)生的相關性，明確設施草莓灰霉病的發(fā)生因素，為湖北省設施草莓灰霉病的監(jiān)測和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：2013—2015年在湖北省農(nóng)業(yè)科學院草莓種植基地選取3個代表性草莓大棚，種植品種為主栽品種“法蘭地”。每個草莓大棚間隔大于100 m，大棚高 3 m，寬 6 m，長100—170 m。從9月初定植草莓，12月、翌年3月和5月分別為3輪草莓果實盛期。棚內(nèi)草莓采用常規(guī)種植管理方法。

供試菌株：PCR檢測用對照灰霉菌菌株B05.10，由華中農(nóng)業(yè)大學植病生防實驗室李國慶教授惠贈，在4℃條件保存于PDA斜面中。

試劑：電泳緩沖液0.5×TBE、分別稱取Tris 107.8 g，硼酸鹽55.1 g，EDTA 7.5 g，溶解于蒸餾水中，使終體積達到1 L，工作濃度0.5×TBE，由筆者實驗室自行配置；分子生物學試劑如10×PCR buffer、dNTPs、MgCl2均購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR StarMix（GenStar）購自康潤生物；其他常規(guī)化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：低溫冷凍干燥儀（LGJ-10，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；研磨儀（MM400，Retsch）；溫濕度自動記錄儀（ZDR-20，杭州澤大儀器有限公司）；凝膠成像儀（1708195，Bio-Rad伯樂），PCR儀（Bio-Rad Laboratories，USA），以及其他常規(guī)實驗設備。

1.2 方法

1.2.1 設施草莓灰霉病不同組織帶菌檢測 在湖北省農(nóng)業(yè)科學院草莓大棚中，2013年從3月初到生產(chǎn)期結束每7 d調(diào)查一次，2014和2015年從12月底到生產(chǎn)期結束每14 d調(diào)查一次，在3個大棚內(nèi)5點取樣，每點采集未顯癥的花、葉、果實各10個?；ê腿~采用特異性PCR法檢測灰霉菌帶菌率，果實采用室內(nèi)保濕培養(yǎng)法檢測帶菌率。

無癥組織PCR擴增檢測：采用CTAB法提取草莓花朵和葉片DNA[22]。以灰葡萄孢特異性檢測SCAR標記片段為靶標基因[23]，正向引物 BC-F1序列：5′-AATGATCGCCTACACAGC-3′，反向引物BC-R1序列：5′-AGCTACCACCGAGAACAA-3′。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

PCR反應體系25.0 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR StarMix，1.0 μL BC-F1（10 μmol·L-1），1.0 μL BC-R1（10 μmol·L-1），1.0 μL模板DNA，9.5 μL ddH2O。

PCR擴增條件：94℃ 5 min預熱，中間34個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min，72℃ 5 min，16℃ 2 min。

利用上述反應體系和反應條件進行PCR擴增，以灰霉菌菌株B05.10的菌絲DNA為陽性對照，以無菌ddH2O為陰性對照。反應終止后，取5 μL擴增產(chǎn)物，用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

無癥組織保濕培養(yǎng)檢測：果實用75%酒精表面消毒，再用無菌水沖洗干凈。將果實置于鋪有吸水紙的100 mL燒杯內(nèi)，每只燒杯放置一個果實，封口膜封口后，置于20℃溫室內(nèi)培養(yǎng)。5 d后檢查帶菌情況，果實上長出灰色霉層則認為是帶菌[7]。

1.2.2 設施草莓灰霉病發(fā)生動態(tài) 2013年從3月初到拆棚每7 d調(diào)查一次，2014和2015年從12月底到拆棚每14 d調(diào)查一次，在大棚內(nèi)5點取樣，每點30株，記錄和統(tǒng)計花、葉片和果實的發(fā)病率。

1.2.3 不同流行因子與果實發(fā)病率的相關性分析在3個草莓大棚中安裝溫濕度自動記錄儀，設置每1 h記錄一次大棚內(nèi)溫度和空氣相對濕度數(shù)據(jù)。每月采集一次數(shù)據(jù)，計算每次調(diào)查前10 d的溫濕度平均值。利用IBM SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，將2013—2015年影響草莓灰霉病發(fā)生的7個相關因子（花朵發(fā)病率、葉片發(fā)病率、溫度、相對濕度、果實帶菌率、花朵帶菌率、葉片帶菌率）與草莓果實發(fā)病率進行 Pearson相關性分析。其中花朵發(fā)病率是指每年兩個大棚分別調(diào)查數(shù)據(jù)，葉發(fā)病率是指每年兩個大棚分別調(diào)查數(shù)據(jù)，溫度和相對濕度均選取每次調(diào)查前10 d的平均值，果實帶菌率是指每年兩個大棚分別經(jīng)保濕培養(yǎng)統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，花朵帶菌率是指每年兩個大棚分別經(jīng)PCR檢測的數(shù)據(jù)，葉片帶菌率是指每年兩個大棚分別經(jīng)PCR檢測的數(shù)據(jù)，果實發(fā)病率是指每年兩個大棚分別調(diào)查數(shù)據(jù)；而花朵發(fā)病率、葉片發(fā)病率、果實帶菌率、花朵帶菌率和葉片帶菌率為果實發(fā)病率數(shù)據(jù)的前一期數(shù)據(jù)。

1.2.4 模型建立及檢驗 經(jīng)Pearson相關性分析，選取與果實發(fā)病率呈顯著相關性的因子分別建立線性回歸預測模型。建模未使用的另一個大棚數(shù)據(jù)對模型進行驗證，其中此大棚數(shù)據(jù)與另外兩個大棚數(shù)據(jù)處理一致。根據(jù)回歸方程計算預測值，比較實際值與預測值之間的擬合度評價回歸方程的驗證效果。上述數(shù)據(jù)運用Excel進行錄入，統(tǒng)計分析則采用SPSS 20.0軟件完成。

2 結果

2.1 設施草莓灰霉病不同組織帶菌檢測

2013—2015年對湖北省設施草莓無癥花朵、葉片、果實帶菌情況進行檢測，結果表明（圖 1），從12月下旬開始草莓花朵、葉片和果實均有帶菌，花朵帶菌率在1月初、2月中旬和4月中上旬是高峰期，平均帶菌率為 15.5%，高峰期帶菌率可達 53.3%；葉片帶菌率在1月中上旬和3月中旬是高峰期，平均帶菌率為8.2%，高峰期帶菌率為36.7%；果實帶菌率在3月中下旬和4月下旬是高峰期，平均帶菌率33.3%，高峰期帶菌率達 79.3%?？傮w來說，草莓花、葉、果帶菌率變化起伏較大，花和果實帶菌率相對較高。

圖1 設施草莓花朵、葉片和果實帶菌率（2013—2015年）Fig. 1 Disease infection rates of strawberry flowers, leaves and fruits in greenhouse (2013-2015)

2.2 設施草莓灰霉病發(fā)生動態(tài)

2013—2015年對湖北省設施草莓灰霉病發(fā)生動態(tài)進行調(diào)查，結果表明花從12月中下旬開始發(fā)病，無明顯高峰期，發(fā)病較為平緩，平均發(fā)病率為8.7%；葉片從1月上旬或2月上旬開始發(fā)病，沒有明顯高峰期，平均發(fā)病率僅為1.4%；果實從12月上旬開始發(fā)病，高峰期為3月份到采收結束，平均發(fā)病率19.8%，高峰期發(fā)病率可達 80.1%（圖 2）。總體來說，草莓花和葉發(fā)病較輕，發(fā)生較為平穩(wěn)，果實在3月之后發(fā)病逐漸加重。

2.3 不同流行因子與果實發(fā)病率的相關性分析

2013—2015年湖北省設施兩個大棚草莓灰霉病果實發(fā)病率（y）與7個流行因子——花朵發(fā)病率（x1）、葉片發(fā)病率（x2）、溫度（x3）、相對濕度（x4）、果實帶菌率（x5）、花帶菌率（x6）、葉片帶菌率（x7）進行Pearson相關性分析。由表1可知，草莓葉片發(fā)病率（r=0.706，P＜0.01）、溫度（r=0.668，P＜0.01）和果實帶菌率（r=0.803，P＜0.01）均與果實發(fā)病率存在顯著相關性，且葉片發(fā)病率、溫度、果實帶菌率之間也存在顯著自相關性。

圖2 設施草莓葉片、花朵和果實上灰霉病發(fā)病率（2013—2015年）Fig. 2 Disease incidences of strawberry flowers, leaves and fruits in greenhouse (2013-2015)

2.4 模型建立

經(jīng)相關性分析發(fā)現(xiàn)，果實帶菌率、葉片發(fā)病率和溫度與果實發(fā)病率呈顯著相關性，但由于果實帶菌率、葉片發(fā)病率和溫度之間存在自相關性，故分別用果實帶菌率、葉片發(fā)病率和溫度建立3個果實發(fā)病率的預測模型：模型一：y=0.55x5+5.76（R2=0.645，P＜0.01）；模型二：y=8.18x2+9.25（R2=0.498，P＜0.01）；模型三：y=2.49x3-13.62（R2=0.446，P＜0.01）。其中，y為2013—2015年草莓灰霉病果實發(fā)病率、x5果實帶菌率、x2為葉片發(fā)病率、x3為溫度。

2.5 預測模型的檢驗

采用建模未使用的數(shù)據(jù)對模型進行檢驗，3個模型的預測值和實際值得回歸模型見圖3，3個回歸模型的決定系數(shù)分別為 0.6435（P＜0.01）、0.4439（P＜0.01）和0.4753（P＜0.01），結果表明所建模型預測值和實際值符合程度好。

表1 草莓灰霉病流行因子與果實發(fā)病率的相關性分析（2013—2015年）Table 1 Correlation analysis between epidemic factors and fruit disease incidence of grey mould of strawberry in 2013-2015

圖 3 設施草莓灰霉病果實發(fā)病率實際值與模型預測值的回歸分析（2013—2015年）Fig. 3 Correlation analysis between actual and predicted values of fruit disease incidence of grey mould of strawberry (2013-2015)

3 討論

本研究分析不同流行因子與草莓果實發(fā)病率的相關性，經(jīng)相關性分析表明，草莓果實發(fā)病率與調(diào)查取樣前3、5、10 d的平均溫濕度值的線性回歸R2值區(qū)間分別為0.787—0.828、0.795—0.851和0.862—0.902，草莓果實發(fā)病率與不同天數(shù)平均溫濕度的相關性分析中前10 d的R2值明顯高于前5 d和前3 d的R2值，因此，取前10 d的溫濕度值進行相關性分析。

本研究采用相關分析法，發(fā)現(xiàn)草莓葉片發(fā)病率、溫度和果實帶菌率均與果實發(fā)病率存在顯著相關性，其相關性大小依次為果實帶菌率（r=0.803，P＜0.01）、草莓葉片發(fā)病率（r=0.706，P＜0.01）、溫度（r=0.668，P＜0.01）。根據(jù)本文檢測結果，雖然田間果實帶菌率很高，但在果實成熟期和儲藏期時，成熟的果實也易受到其他組織上的分生孢子侵染[24]，這一點可說明其他組織發(fā)病與果實帶菌對果實發(fā)病都有顯著影響。相對濕度越大發(fā)病情況越嚴重，爛果上會出現(xiàn)灰色霉狀物[25]。中國不同地區(qū)氣候條件差異很大，湖北省地處長江中下游地區(qū)，空氣濕度大，加上現(xiàn)有栽培模式下草莓大棚中濕度已滿足灰霉病發(fā)生所需條件，因此，推測一定范圍內(nèi)的濕度變化在湖北省草莓大棚中對灰霉病的發(fā)生影響較小。本文分析發(fā)現(xiàn)果實帶菌是草莓果實發(fā)病最重要的影響因子，進一步驗證了分析結果的可靠性。草莓生長周期跨度較長，在湖北省一般從9月開始到次年的5月采收完畢；2013—2015年監(jiān)測了大棚內(nèi)溫度變化情況，發(fā)現(xiàn)3個大棚內(nèi)日平均氣溫保持在 6—23℃，棚內(nèi)溫度變化顯著。隨著高溫時間和低濕時間的不斷增加，草莓灰霉病病菌的菌絲對葉片的侵染發(fā)病程度和侵染速率均不斷降低，每天保持空氣相對濕度在81%以下的時間達6 h，就可以明顯抑制灰霉病的發(fā)生。在棚溫控制方面，可采取大棚溫差變溫管理，對灰霉病的防治效果較為理想[26]。李寶聚等[27]從群體的角度研究灰霉病菌對溫度的適應性，結果表明灰霉病菌孢子的萌發(fā)適溫在15—25℃，最適溫度為20℃。

本研究根據(jù)相關性分析的結果建立了分別基于草莓葉片發(fā)病率、溫度和果實帶菌率的預測模型，可以在不同的數(shù)據(jù)源的情況下使用，簡單實用。目前尚未發(fā)現(xiàn)對灰霉菌高抗的草莓品種[28]，在草莓種植過程中應注重監(jiān)測影響果實發(fā)病的重要因子，以便為后期藥劑防治提供參考；同時，控溫控濕應作為大棚中草莓灰霉病防控的重要措施；但如何協(xié)調(diào)病害控制與草莓正常發(fā)育的關系，還需進一步研究。

4 結論

利用常規(guī)PCR法結合多種病害影響因子預測設施草莓灰霉病的發(fā)生，明確了果實帶菌率、葉片發(fā)病率、溫度與草莓灰霉病發(fā)生的關系；在防治過程中應及時摘除發(fā)病組織，降低果實帶菌率，預防灰霉病發(fā)生。

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（責任編輯 岳梅）

Occurrence of Grey Mould Disease in Greenhouse-Grown Strawberry and Its Correlations with Epidemic Factors in Hubei Province

GAO CuiZhu, YANG HongLing, HUANGXIA YuQi, HUANG JunBin, LI GuoQing, ZHENG Lu
(Key Laboratory of Plant Pathology of Hubei Province, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

【Objective】Strawberry grey mould is an important fungus disease worldwide. The objectives of this study are to explore the development of Botrytis cinerea in greenhouse in Hubei Province, analyze the relationship between different epidemic factors and disease rates of grey mould. Significant correlation factors were selected and used to build a model, and to provide a theoretical foundation for prevention and control of strawberry grey mould in greenhouse in Hubei Province. 【Method】 From 2013to 2015, three representative strawberry greenhouse in strawberry planting base of Hubei Province Academy of Agricultural Sciences were selected in this study. A method of five sampling points was used for collecting leaves, flowers and fruits, and infection rates of B. cinerea on plant tissues were detected by specific PCR and moisture culture methods. The data of two greenhouses were selected to analyze the relationships between disease rate of strawberry fruits and disease rates of flowers and leaves, temperature, relative humidity, infection rates of fruits, flowers and leaves by Pearson correlation analysis. Disease rates of leaves (x2), temperature (x3), infection rates of fruits (x5) were significantly related to the incidence of disease on strawberry fruit and were used as the dependent variables (y). And the factor x2, x3or x5was used as independent variable to multiple linear regression equation by linear regression method to establish the regression models for the greenhouse variables (x2, x3, x5) and strawberry fruit incidence (y), respectively. The predicted values of strawberry fruit incidence were calculated by the regression model, and the predicted values were compared with the actual values in the third greenhouse. 【Result】In 2013-2015, the changes of infection rates of flowers, leaves and fruits were significantly different. Infection rates of flowers and fruits were relatively high and the infection rates were 0-53.33% and 0-86.00%, respectively. The beginning time of disease on different tissues were not the same. The strawberry grey mould was found on fruits, flowers and leaves from early December, mid-late December and early January or February, separately. The occurrences of disease on flowers and leaves were light and stable, and the fruit disease gradually increased after March with the highest disease rate of 80.07%. The disease rate of strawberry leaves, temperature and fruit infection rate were significantly correlated with disease rate of fruit (P＜0.01). Regression models for strawberry fruit incidence rate and different epidemic factors was established as y=0.55x5+5.76 (R2=0.645, P＜0.01) (model 1), y=8.18x2+9.25 (R2=0.498, P＜0.01) (model 2) and y=2.49x3-13.62 (R2=0.446, P＜0.01) (model 3), respectively. The predicted values and the actual values were analyzed by regression analysis. The results showed that the correlation between the actual fruit incidence and the predicted incidence in model 1 was the best. 【Conclusion】 In strawberry greenhouses in Hubei Province, fruit disease rate was affected significantly by the fruit infection rate, disease rate of leaf, and temperature. Removal of diseased tissues and reduction of disease infection on fruits are useful methods for control of grey mould.

Botrytis cinerea; disease infection rate; disease incidence; correlation

2016-12-08；接受日期：2017-02-23

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303025）

聯(lián)系方式：高翠珠，E-mail：807292742@qq.com。通信作者鄭露，E-mail：luzheng@mail.hzau.edu.cn