鄭書(shū)賢，孫雪梅，王瑞鴿，史立宏，張寶剛

miR-31通過(guò)結(jié)合Dock180抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲

鄭書(shū)賢1，孫雪梅1，王瑞鴿1，史立宏2，張寶剛1

目的 探討miR-31表達(dá)與Dock180表達(dá)的相關(guān)性，以及miR-31通過(guò)結(jié)合Dock180對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。方法 通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-31轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系過(guò)表達(dá)miR-31；采用熒光酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-31與Dock180的結(jié)合方式；應(yīng)用Western blot法檢測(cè)miR-31表達(dá)不同的乳腺癌細(xì)胞中Dock180和其他相關(guān)蛋白的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)miR-31與Dock180 mRNA的關(guān)系；基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-31過(guò)表達(dá)時(shí)，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果 在乳腺癌細(xì)胞中，miR-31靶向結(jié)合Dock180，且Dock180蛋白表達(dá)與miR-31表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Dock180下調(diào)和miR-31上調(diào)削弱了乳腺癌的侵襲能力。結(jié)論 miR-31可通過(guò)結(jié)合Dock180抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲。

乳腺腫瘤；miR-31；Dock180；侵襲

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率逐年上升，侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。Dock180是作為信號(hào)銜接蛋白(Crk)下游因子為人們熟知，相對(duì)分子質(zhì)量約1.80×105。Dock180作為小GTP酶Rho家族的鳥(niǎo)嘌呤核苷交換因子(guanine-nucleotide exchange factor, GEF)，是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及細(xì)胞形態(tài)的重要分子[2]。Li等[3]的研究表明，Dock180參與乳腺癌的侵襲。作者推測(cè)有microRNA(miRNA)參與調(diào)節(jié)Dock180的表達(dá)，通過(guò)Target Scan靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具(http://www.targetscan.org/)搜索，發(fā)現(xiàn)Dock180基因?yàn)閙iR-31潛在的靶基因。近來(lái)，大量研究表明[4-8]，miR-31可以抑制乳腺癌的侵襲[5]和轉(zhuǎn)移[6]，促進(jìn)凋亡[7]。因此，miR-31在乳腺癌中異常低表達(dá)，有望成為乳腺癌篩查、診斷乃至治療中的新靶點(diǎn)。因此，為進(jìn)一步明確miR-31和Dock180的關(guān)系，需對(duì)兩者進(jìn)行深入分析。本文旨在探討miR-31是否參與調(diào)節(jié)Dock180的表達(dá)，且miR-31和Dock180結(jié)合對(duì)乳腺癌侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC)公司；培養(yǎng)基及相關(guān)試劑購(gòu)自Hyclone公司；細(xì)胞裂解液、胰酶等購(gòu)自北京碧云天公司；兔抗人Dock180單抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；侵襲實(shí)驗(yàn)所用的Transwell小室購(gòu)自Corning公司；Matrigel購(gòu)自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7細(xì)胞置于37 ℃ 5%CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。MDA-MB-231(2×105個(gè))細(xì)胞種植于4個(gè)35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)將miR-31陰性對(duì)照、miR-31、miR-31抑制劑、miR-31抑制劑陰性對(duì)照的Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))轉(zhuǎn)染MDA-MB-231。轉(zhuǎn)染后分別命名為MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/miR-31、miR-31 inhibitor、inhibitor NC，于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 體外癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染成功的MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC分別用胰蛋白酶消化，1×105個(gè)細(xì)胞種于Transwell小室的上室，預(yù)涂層為20 μg Matrigel(基質(zhì)膠)，下室為10%胎牛血清作為化學(xué)引誘物。37℃、5%CO2溫箱孵育24 h后取出培養(yǎng)板，棄去Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽擦掉上室的基質(zhì)膠和非侵襲細(xì)胞，下室用甲醇固定10 min后，常規(guī)HE染色，400倍光鏡下觀察5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)即為穿透人工基膜的細(xì)胞數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 Western blot法 使用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的Dock180蛋白表達(dá)量，β-actin作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/mR-31、miR-31 inhibitor、inhibitor NC細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h提取總蛋白，蛋白變性后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過(guò)夜、二抗孵育后顯影得到Dock180的蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用Image J軟件處理，以第一個(gè)數(shù)值作為基數(shù)，其他數(shù)值與第一個(gè)數(shù)值的比值為相對(duì)密度。

1.2.4 RT-PCR法 用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，5 ng總RNA為模板，在引物的指引下以dNTP為原料經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性、延伸35個(gè)循環(huán)合成cDNA，Dock180的表達(dá)水平應(yīng)用Quantity One 4.62定量分析。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC細(xì)胞各3.5×104個(gè)接種于48孔板。設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段Dock180-3′UTR，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因腺病毒中構(gòu)成pGL-Dock180-3′UTR。培養(yǎng)24 h后，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)工具箱依據(jù)公司給與的說(shuō)明檢測(cè)pGL-Dock180-3′UTR的相對(duì)熒光酶素活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)方法采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-31與Dock180的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合 通過(guò)Target Scan靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具搜索，結(jié)果顯示miR-31與Dock180的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合(圖1)。

2.2 miR-31在3種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)選擇3種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435(侵襲力依次增強(qiáng))，RT-PCR檢測(cè)顯示，miR-31在3種乳腺癌中表達(dá)不同，侵襲力較弱的MCF-7高表達(dá)miR-31，侵襲力強(qiáng)的MDA-MB-435低表達(dá)miR-31，MDA-MB-231表達(dá)居中。提示miR-31的表達(dá)量與乳腺癌細(xì)胞系的侵襲能力呈反比(圖2)。

圖1 miR-31與Dock180的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合

圖2 miR-31在3種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 Dock180的表達(dá)與miR-31呈負(fù)相關(guān) miR-31可以結(jié)合Dock180，但miR-31對(duì)Dock180表達(dá)量的影響未知。采用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Dock180的表達(dá), MDA-MB-231/miR-31中Dock180低表達(dá)，miR-31 inhibitor中Dock180高表達(dá)；Dock180的表達(dá)與miR-31呈負(fù)相關(guān)(圖3)。

圖3 Dock180的表達(dá)與miR-31呈負(fù)相關(guān)

2.4 miR-31與Dock180的3′UTR結(jié)合抑制其翻譯 miRNA通過(guò)兩種方式對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行反向調(diào)節(jié)，一種是與mRNA結(jié)合，使其降解；另一種是結(jié)合在mRNA的3′UTR，抑制翻譯。為了證明miR-31與Dock180作用方式，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR分別檢測(cè)MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中Dock180 mRNA的表達(dá)。MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中，Dock180 mRNA表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示miR-31不是結(jié)合在Dock180 mRNA上使其降解，而是結(jié)合在Dock180的3′UTR上抑制翻譯(圖4)。

2.5 miR-31通過(guò)與Dock180的3′UTR靶向結(jié)合降低Dock180的翻譯 本組采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的pGL-Dock180-3′UTR的相關(guān)熒光素酶活性，MDA-MB-231/NC的活性明顯高于MDA-MB-231/miR-31，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-31結(jié)合Dock180的3′UTR(圖5)。

圖4 RT-PCR檢測(cè)MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中 Dock180 mRNA表達(dá)差異

圖5 MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/miR-31的 pGL-Dock180-3′UTR的相關(guān)熒光素酶活性

2.6 miR-31對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性的影響 采用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的侵襲能力。與MDA-MB-231/NC相比，MDA-MB-231/miR-31穿過(guò)人工基膜的細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

圖6 MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的侵襲能力比較

3 討論

乳腺癌在演進(jìn)過(guò)程中以侵襲力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移早、化療多重耐藥為特點(diǎn)[9]。其中，乳腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散是患者病情急劇惡化的重要原因，其中對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的侵襲是乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。進(jìn)一步探討乳腺癌演進(jìn)的機(jī)制，抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移是提高患者生存質(zhì)量，延緩患者病情甚至治愈乳腺癌的關(guān)鍵。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，Iorio等[11]表明miRNA參與乳腺癌的發(fā)生，且miRNA的表達(dá)與ER狀態(tài)相關(guān)，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。miRNA在不同部位腫瘤組織中的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)兩個(gè)方向變化。一方面，miR-31在乳腺癌[4-8]、胃癌[12]及卵巢癌[13]中的表達(dá)水平均明顯降低，可抑制DNA復(fù)制及細(xì)胞周期或侵襲。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與MDA-MB-231/NC相比，MDA-MB-231/miR-31中miR-31過(guò)表達(dá)削弱乳腺癌細(xì)胞系的侵襲能力，提示本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相符。然而，在有些癌癥中miR-31的過(guò)表達(dá)反而會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，在Cottonham等[14]報(bào)道中，miR-31過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)直腸癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。Xu等[15]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中miR-31可能通過(guò)靶基因RhoBTB1促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-31可以與Dock180的3′UTR特異性的靶向結(jié)合，每個(gè)miRNA可以結(jié)合多個(gè)靶基因[6,8]，而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因[14]。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以由一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA的組合來(lái)共同調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。miRNA通過(guò)兩種方式對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行反向調(diào)節(jié)，一種方式為依賴miRNA誘導(dǎo)的基因沉默，miRNA與編碼蛋白質(zhì)的mRNA近乎完全互補(bǔ)，其沉默復(fù)合體被相關(guān)酶切斷致使靶基因降解；另一種方式通過(guò)與靶基因mRNA的部分堿基互補(bǔ)(通常發(fā)生在 3′非翻譯端)，降低蛋白質(zhì)翻譯水平。為了證明miR-31通過(guò)哪種方式結(jié)合Dock180，本實(shí)驗(yàn)采用熒光酶報(bào)告基因分析證明miR-31特異性作用于Dock180的3′UTR。通過(guò)Western blot法檢測(cè)MDA-MB-231/miR-31組的Dock180蛋白表達(dá)與MDA-MB-231/NC相比下降，miR-31 inhibitor的Dock180的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)Dock180是miR-31的靶基因。Li等[3]的實(shí)驗(yàn)證明，在乳腺癌中趨化因子CXCL12與其受體CXCR4結(jié)合促進(jìn)Dock180與ELMO穩(wěn)定結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而激活Rac促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合反應(yīng)；為miR-31通過(guò)結(jié)合Dock180抑制乳腺癌的侵襲提供了理論依據(jù)。

綜上所述，miR-31可通過(guò)結(jié)合Dock180抑制乳腺癌侵襲，有望成為通過(guò)Dock180逆轉(zhuǎn)乳腺癌侵襲的新靶點(diǎn)，提高患者的生存質(zhì)量。但是，miR-31通過(guò)結(jié)合Dock180抑制乳腺癌的具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探討。

(本文獲得國(guó)家留學(xué)生基金管理委員會(huì)資助，特此鳴謝！)

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MiR-31 inhibit the invasion of breast cancer by Dock180

ZHENG Shu-xian1, SUN Xue-mei1, WANG Rui-ge1, SHI Li-hong2, ZHANG Bao-gang1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofPharmacology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

Purpose To investigate the correlation of Dock180 and miR-31 expression in breast cancer cells, and to observe the effect of miR-31 on the invasion of breast cancer cells by Dock180. Methods MiR-31 was transfected into breast cancer cells by liposome transfection technique. The actual binding site of miR-31 to the 3′-untranslated region of Dock180 was confirmed through luciferase assay. Western blot was performed to detect the expression of Dock180 and other related proteins. Real-time PCR was used to measure the expression of Dock180. Matrigel invasion were performed to detect the invasion of breast cancer cell lines with miR-31 increased. Results The protein levels of Dock180 in breast cancer cell lines negatively correlated with miR-31 expression, and Dock180 was directly targeted by miR-31. Dock180 downregulation and miR-31 overexpression reduced breast cancer cells invasion. Conclusion Dock180 modulated by miR-31 plays an important function in breast cancer cell lines invasion.

breast neoplasm； miR-31； Dock180； invasion

時(shí)間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.002.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(81072068、81672631)、山東省自然科學(xué)基金中青年科學(xué)家獎(jiǎng)勵(lì)基金(2010BSB14051)、山東省教育廳課題(J14LK13)

濰坊醫(yī)學(xué)院1病理學(xué)教研室、2藥理學(xué)教研室，濰坊 261053

鄭書(shū)賢，女，碩士研究生。Tel:(0536)8462034，E-mail: shuxianzheng@126.com 張寶剛，男，教授，通訊作者。E-mail: zbg0903@hotmail.com

R 737.9

A

1001-7399(2017)03-0241-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.002

接受日期：2017-01-23