汪宇，李錫鋒，張小峰，王文超，別雅琴，施樂華

(第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

·臨床研究·

術(shù)前外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌微血管侵犯的預(yù)測(cè)價(jià)值

汪宇，李錫鋒，張小峰，王文超，別雅琴，施樂華

(第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

目的 探討術(shù)前外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測(cè)對(duì)肝細(xì)胞肝癌(HCC)微血管侵犯(MVI)的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法 收集首次手術(shù)切除治療的HCC患者108例，術(shù)前未行抗腫瘤治療；術(shù)前取外周靜脈血檢測(cè)CTCs，術(shù)中取病理HE染色判斷是否發(fā)生MVI；收集患者臨床資料，進(jìn)行發(fā)生MVI的單因素及多因素分析，以受試者工作曲線(ROC)判斷各獨(dú)立因素術(shù)前預(yù)測(cè)肝癌MVI的價(jià)值。結(jié)果 108例肝癌患者術(shù)前外周血檢出CTC 51例，術(shù)后病理證實(shí)發(fā)生MVI 44例，且發(fā)生MVI者外周血檢CTC 陽(yáng)性檢出率高于未發(fā)生MVI者(P<0.05)。多因素分析顯示,CTC陽(yáng)性(OR=5.218,95%CI1.700～16.011,P=0.004)、AFP>400 μg/L(OR=4.803,95%CI1.714～13.568,P=0.003)、DCP>40 mAU/mL(OR=3.046,95%CI1.055～8.797,P=0.040)和腫瘤直徑(OR=4.332,95%CI1.544～12.1521,P=0.005)是MVI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ROC 分析顯示，CTC陽(yáng)性的曲線下面積及靈敏性、特異性均高于其他3種危險(xiǎn)因素。結(jié)論 HCC患者術(shù)前外周血CTC檢測(cè)能較好地預(yù)測(cè)MVI的發(fā)生，可為后續(xù)個(gè)體化治療提供參考。

肝細(xì)胞肝癌；微血管侵犯；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；預(yù)測(cè)價(jià)值；術(shù)前檢測(cè)

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是全球最常見的惡性腫瘤之一[1]，其高復(fù)發(fā)率和病死率仍是制約患者總體療效的重要因素[2]。近年來，脫離了原發(fā)病灶侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)[3]被認(rèn)為是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要因素[4]，在腫瘤診斷、治療、檢測(cè)等方面具有極其顯著的臨床價(jià)值。Li等[5]發(fā)現(xiàn),CTC與大血管侵犯(肝癌門靜脈癌栓)的發(fā)生相關(guān)，且影響患者的預(yù)后。但關(guān)于CTC與微血管侵犯(MVI)之間是否具有相關(guān)性，目前尚無相關(guān)報(bào)道。研究[6,7]表明，MVI是影響HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)及生存期的危險(xiǎn)因素之一。目前臨床上對(duì)于MVI的診斷仍通過術(shù)后組織病理檢查，這極大影響了MVI對(duì)患者治療決策的選擇，也限制了其術(shù)前評(píng)估預(yù)后的作用。因此，需要尋找能夠在術(shù)前有效預(yù)測(cè)MVI的特異性細(xì)胞標(biāo)志物。本研究探討了肝癌術(shù)前外周血CTC檢測(cè)對(duì)MVI的預(yù)測(cè)價(jià)值，為提高M(jìn)VI診斷準(zhǔn)確率及個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)B超、CT 和(或)MRI診斷為肝癌，無肝外轉(zhuǎn)移灶，術(shù)后病理證實(shí)為肝癌；②首次行手術(shù)切除治療，術(shù)前未接受任何化療、放療和其他治療；③術(shù)中切緣距腫瘤邊緣至少1 cm以上，邊緣陰性；④術(shù)前影像學(xué)檢查未見大血管侵犯；⑤排除全身情況差，肝功能Child-Pugh C級(jí)。收集2015年10月～2016年3月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院收治符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者108例，男71例、女37例，年齡(54.56±9.26)歲，總膽紅素(TBIL)>17.1 mmol/L 26例，白蛋白(ALB)<35 g/L 6例，前白蛋白<170 mg/L 53例，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)>44 U/L 39例，天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)>38 U/L 29例，堿性磷酸酶(ALP)>129 U/L 16例；HBsAg陽(yáng)性71例，異常凝血酶原(DCP)>40 mAU/mL 54例，甲胎蛋白(AFP)>400 μg/L 49例；腫瘤直徑(4.72±1.95)cm，腫瘤單發(fā)51例、多發(fā)57例。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 術(shù)前外周血CTC檢測(cè)方法 術(shù)前采集患者外周血5 mL，置于含EDTA的抗凝管中，采用Ficoll-Paque PLUS分離液進(jìn)行密度梯度離心；根據(jù)說明書以磁性標(biāo)記的抗CD45單克隆抗體提取表達(dá)CD45的白細(xì)胞來富集CTC，用離心涂片機(jī)將富集到的細(xì)胞分在多聚賴氨酸玻片上制成細(xì)胞涂片。將載玻片與針對(duì)人去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)小鼠單克隆抗體和大鼠抗人CD45單克隆抗體的混合物共孵育，再用兔抗小鼠-Alexa Fluor647 IgG、兔抗大鼠-Alexa Fluor 488作為二抗孵育，隨后用DAPI染色。通過熒光顯微鏡(IX71；Olympus)評(píng)估染色的載玻片，調(diào)整檢測(cè)器靈敏度和曝光時(shí)間從標(biāo)本捕獲陽(yáng)性染色圖像。體積比較大，細(xì)胞核染呈陽(yáng)性表達(dá)(藍(lán)色)，CPS1和ASGPR呈陽(yáng)性表達(dá)(紅色)且CD45呈陰性表達(dá)(黃色未染)的細(xì)胞即為CTC[8]。

1.3 MVI判斷方法 術(shù)中病理取材部位及數(shù)量參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015版)》[9]，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定硬化，切成薄片，制成病理切片并行HE染色封片，顯微鏡下觀察有無MVI。MVI：微小靜脈(中央靜脈、門靜脈分支或包膜外小靜脈)內(nèi)漂浮有成團(tuán)癌細(xì)胞，且周邊有明確的血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)；對(duì)單因素分析有意義的臨床指標(biāo)，進(jìn)行多因素logistic回歸分析發(fā)生MVI的危險(xiǎn)因素；繪制ROC曲線，分析各危險(xiǎn)因素的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者外周血CTC檢測(cè)結(jié)果和MVI發(fā)生情況 108例肝癌患者中術(shù)前外周血檢出CTC 51例，CTC陽(yáng)性檢出率為47.2%；術(shù)后病理證實(shí)發(fā)生MVI 44例，且發(fā)生MVI者外周血CTC 陽(yáng)性檢出率(75.0%)高于未發(fā)生MVI者(28.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 術(shù)前CTC對(duì)肝癌發(fā)生MVI的預(yù)測(cè)價(jià)值 單因素分析顯示，CTC陽(yáng)性、AFP>400 μg/L、DCP>40 mAU/mL、腫瘤直徑和腫瘤數(shù)目與MVI發(fā)生有關(guān),見表1；多因素Logistic回歸分析結(jié)果提示,CTC陽(yáng)性(OR=5.218,95%CI1.700～16.011,P=0.004)、AFP>400 μg/L(OR=4.803,95%CI1.714～13.568,P=0.003)、DCP>40 mAU/mL(OR=3.046,95%CI1.055～8.797,P=0.040)和腫瘤直徑(OR=4.332,95%CI1.544～12.152,P=0.005)是MVI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CTC陽(yáng)性的ROC曲線下面積(AUC)及靈敏性、特異性均高于AFP>400 μg/L、DCP>40 mAU/mL、腫瘤直徑。見表2。

3 討論

近年來，CTC被認(rèn)為是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要根源，已成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程和機(jī)制的一個(gè)重要切入點(diǎn)[10]。Kim等[11]曾提出過CTC相關(guān)的“種子”理論，認(rèn)為從腫瘤原發(fā)灶脫落進(jìn)入血液中的CTC能在血液相關(guān)趨化因子的作用下歸巢到腫瘤原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位。目前的研究結(jié)果已證實(shí)，肝臟腫瘤衍生的細(xì)胞因子或經(jīng)感染并發(fā)癥治療產(chǎn)生的炎性刺激物可上調(diào)細(xì)胞黏附分子，進(jìn)而促進(jìn)肝癌CTC附著于肝臟的門靜脈、肝靜脈血管內(nèi)皮，在血小板、組織因子及各種免疫細(xì)胞等的作用下形成CTC細(xì)胞簇，有利于血管癌栓的形成[12]。由此可見，CTC可能直接參與MVI的發(fā)生、發(fā)展，在肝癌患者術(shù)前預(yù)測(cè)MVI方面具有重要的診斷價(jià)值。研究[13]已證實(shí),MVI是引起肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的重要原因之一，也是肝癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估的一項(xiàng)危險(xiǎn)因素。MVI被認(rèn)為是反映腫瘤侵襲性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，而血管侵犯是腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶進(jìn)入血液循環(huán)形成CTC最重要的途徑[14];MVI作為血管侵犯的主要環(huán)節(jié)，在CTC形成的過程中也可能起到一定的促進(jìn)作用。此外，與單個(gè)腫瘤病灶進(jìn)行活檢相比，CTC不僅創(chuàng)傷小，而且能夠更好地反映整個(gè)腫瘤的特性，因此被稱為“液體活檢”[15]。

表1 肝癌發(fā)生MVI的單因素分析結(jié)果

表2CTC、AFP、DCP、腫瘤直徑預(yù)測(cè)肝癌發(fā)生 MVI的敏感性、特異性及AUC

本研究就CTC在HCC術(shù)前預(yù)測(cè)MVI中的作用進(jìn)行更深入的探索，除了應(yīng)用單因素和多因素分析來篩選預(yù)測(cè)指標(biāo)外，還應(yīng)用ROC曲線來評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床應(yīng)用價(jià)值。本組資料顯示，108例肝癌患者M(jìn)VI發(fā)生率為40.7%，與之前的報(bào)道相符[16,17]；并且，發(fā)生MVI患者外周血檢CTC 陽(yáng)性檢出率高于未發(fā)生MVI者。這表明存在MVI的HCC患者腫瘤細(xì)胞更易侵犯血管并脫落進(jìn)入血液循環(huán)形成CTC，進(jìn)一步造成HCC的復(fù)發(fā)及術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，影響HCC患者的預(yù)后質(zhì)量。此外，本研究Logistic多因素回歸分析表明AFP>400 μg/L、DCP>40 mAU/mL、CTC陽(yáng)性及腫瘤直徑是MVI發(fā)生的獨(dú)立相關(guān)因素，與之前報(bào)道的結(jié)果相一致[18]。但是，ROC分析結(jié)果顯示AFP、DCP在預(yù)測(cè)MVI方面的靈敏性及特異性均低于CTC，腫瘤直徑的靈敏度和AUC均低于CTC，因此CTC具有更高的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值。

綜上所述，CTC在MVI預(yù)測(cè)方面具有較高的臨床價(jià)值，通過早期檢測(cè)CTC能夠在MVI發(fā)生的早期對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)診斷進(jìn)而干預(yù)治療。然而，本研究?jī)H揭示了CTC與MVI之間的相關(guān)性，研究結(jié)果尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來證實(shí)。我們后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)CTC在MVI形成中發(fā)揮的作用進(jìn)行深入探究，推測(cè)CTC與微血管癌栓中的腫瘤細(xì)胞可能具有同源性，也許在基因水平同時(shí)檢測(cè)CTC與MVI中腫瘤細(xì)胞的表達(dá)能夠更深層次地揭示MVI的起源。未來能否將CTC的檢測(cè)運(yùn)用至臨床，提高M(jìn)VI的檢出率，仍是該領(lǐng)域需努力研究的方向。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[2] Maluccio M, Covey A. Recent progress in understanding, diagnosing, and treating hepatocellular carcinoma[J]. CA Cancer J Clin, 2012,62(6):394-399.

[3] Dive C, Brady G. Snapshot: circulating tumor cells[J]. Cell, 2017,168(4):742.

[4] Nel I, David P, Gerken GG, Schlaak JF, et al. Role of circulating tumor cells and cancer stem cells in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatol Int, 2014,8(3):321-329.

[5] Li J, Chen L, Zhang X, et al. Detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma using antibodies against asialoglycoprotein receptor, carbamoyl phosphate synthetase 1 and pan-cytokeratin[J]. PLoS One, 2014,9(4):e96185.

[6] Dhir M, Melin AA, Douaiher J, et al. A review and update of treatment options and controversies in the management of hepatocellular carcinoma[J]. Ann Surg, 2016,263(6):1112-1125.

[7] Hirokawa F, Hayashi M, Asakuma M, et al. Risk factors and patterns of early recurrence after curative hepatectomy for hepatocellular carcinoma[J]. Surg Oncol, 2016,25(1):24-29.

[8] Liu HY, Qian HH, Zhang XF, et al. Improved method increases sensitivity for circulating hepatocellular carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(10):2918-2925.

[9] 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)肝癌學(xué)組,中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)病理專業(yè)委員會(huì),等.原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)[J].中華肝臟病雜志,2015,23(5):321-327.

[10] Zhang Y, Li J, Cao L, et al. Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma: detection techniques, clinical implications, and future perspectives[J]. Semin Oncol, 2012,39(4):449-460.

[11] Kim MY, Oskarsson T, Acharyya S, et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells[J]. Cell, 2009,139(7):1315-1326.

[12] Spicer JD, McDonald B, Cools-Lartigue JJ, et al. Neutrophils promote liver metastasis via Mac-1-mediated interactions with circulating tumor cells[J]. Cancer Res, 2012,72(16):3919-3927.

[13] Hirokawa F, Hayashi M, Asakuma M, et al. Risk factors and patterns of early recurrence after curative hepatectomy for hepatocellular carcinoma[J]. Surg Oncol, 2016,25(1):24-29.

[14] Zhang Y, Zhang X, Zhang J, et al. Microfluidic chip for isolation of viable circulating tumor cells of hepatocellular carcinoma for their culture and drug sensitivity assay[J]. Cancer Biol Ther, 2016,17(11):1177-1187.

[15] Sun YF, Xu Y, Yang XR, et al. Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection[J]. Hepatology, 2013,57(4):1458-1468.

[16] Rodríguez-Perálvarez M, Luong TV, Andreana L, et al. A systematic review of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma: diagnostic and prognostic variability[J]. Ann Surg Oncol, 2013,20(1):325-339.

[17] Liu HY, Qian HH, Zhang XF,et al. Improved method increases sensitivity for circulating hepatocellular carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(10):2918-2925.

[18] Hwang S, Song GW, Lee YJ, et al. Multiplication of tumor volume by two tumor markers is a post-resection prognostic predictor for solitary hepatocellular carcinoma[J]. J Gastrointest Surg, 2016,20(11):1807-1820.

施樂華(E-mail： slhehbh@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.011

R735.7

B

1002-266X(2017)18-0033-03

2017-01-12)