于暢游 田冬梅 婁志紅

（黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，哈爾濱 150088）

UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁的含量

于暢游 田冬梅 婁志紅*

（黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，哈爾濱 150088）

建立了超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）法同時(shí)測(cè)定藥用植物皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁含量的分析方法。優(yōu)化的分析條件為：流動(dòng)相：甲醇-水溶液（42∶58，V/V）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。采用電噴霧離子源進(jìn)行電離，多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行信號(hào)采集，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，結(jié)果表明，在不同檢測(cè)范圍內(nèi)各目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好（R2>0.9997）。同時(shí)，應(yīng)用建立的方法對(duì)比分析了4種目標(biāo)化合物在皂角果莢和皂角刺兩個(gè)部位的含量水平。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)；皂角；槲皮苷；槲皮素；山柰酚；蘆丁

皂角（Gleditsia sinensis）為豆科皂莢屬落葉喬木，是我國(guó)特有的樹種之一[1]。皂角的種子和皂角刺等諸多部位均可入藥，具有抗菌抗炎、免疫調(diào)節(jié)與抗過敏、抗腫瘤等作用[2-6]。研究表明，皂角含有的槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁是皂角中常見的活性成分[7-8]。為更加快速高效檢測(cè)分析皂角活性成分的水平，本研究應(yīng)用超高速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS）建立了同時(shí)測(cè)定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁含量的分析方法，同時(shí)應(yīng)用所建立的方法對(duì)比分析了上述4種目標(biāo)化合物在皂角果莢和皂角刺兩個(gè)部位的含量水平，為進(jìn)一步開發(fā)利用皂角的藥用價(jià)值提供了理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皂角刺及皂角果莢于2017年1月采自于黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)(45°73′N, 126°56′E)，實(shí)驗(yàn)前將皂角刺及果莢分別用粉碎機(jī)粉碎，粉末過20目篩備用；槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁（純度均≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；色譜甲醇、乙腈購(gòu)于北京百靈威公司；色譜甲酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；去離子水使用超純水儀自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Qtrap 5500質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；色譜儀選用日本沃特斯的超高效液相色譜儀，使用LC-20AD泵，溫度控制器，柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器；FZ-06中藥粉碎機(jī)（浙江溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠）；250DC型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；BS124S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Millipore超純水儀（法國(guó)Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 供試樣品溶液的制備

稱取皂角刺及果莢粉末各0.5g，加入甲醇20mL超聲提取（100 kHz，40℃）30 min，過濾后將殘?jiān)偌尤?0 mL溶劑超聲提取30 min，過濾后將兩次濾液合并，測(cè)定前用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品用色譜甲醇溶解、定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，存于4℃冰箱中備用，使用前根據(jù)需要用流動(dòng)相配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 UPLC-MS/MS方法

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 Column (1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（42:58，V/V）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(electrosprayionization，ESI)，正離子掃描模式，多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)掃描方式[9]；錐孔電壓是3 kV；離子源霧化溫度5000℃；霧化氣25psi，氣簾氣15psi。

1.4 精密度及準(zhǔn)確性考察

準(zhǔn)確量取含槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度及準(zhǔn)確性[10]。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將4種標(biāo)準(zhǔn)品溶液用流動(dòng)相稀釋成不同濃度的工作液，按上述UPLC-MS/MS方法分別進(jìn)行檢測(cè)，將標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度（x）與峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），確定線性范圍。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

相同提取條件下，每個(gè)樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，采用SPSS 18.0對(duì)其做方差，SigmaPlot 10.0用于繪制數(shù)據(jù)圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS分析條件的優(yōu)化

對(duì)比電噴霧離子源正、負(fù)離子掃描模式下槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在正離子掃描模式下電離信號(hào)高于負(fù)離子掃描模式，因此采用正離子掃描模式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過對(duì)質(zhì)譜條件的優(yōu)化得出最優(yōu)的質(zhì)譜條件為：錐孔電壓是3 kV；離子源霧化溫度5 000℃；霧化氣25 psi，氣簾氣15 psi；4種具有藥用活性的化合物碎裂離子、去簇電壓、碰撞電壓、碰撞室射出電壓見表1。對(duì)超高效液相的流動(dòng)相的組成和比例進(jìn)行考察的結(jié)果表明，使用甲醇-水溶液作為流動(dòng)相的組成時(shí)，靈敏度高且分離效果顯著，其中甲醇與水的比例為42∶58時(shí)，所測(cè)物質(zhì)的出峰時(shí)間適中，分離效果好，峰形對(duì)稱。因此選擇甲醇-水溶液（42∶58，V/V）作為分離槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的流動(dòng)相。

在各項(xiàng)質(zhì)譜條件及參數(shù)優(yōu)化完成后，應(yīng)用最優(yōu)的UPLC-MS/MS方法同時(shí)定量檢測(cè)目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖（圖1），其中蘆丁的出峰時(shí)間為2.85 min、槲皮苷的出峰時(shí)間為4.01 min、槲皮素的出峰時(shí)間為5.05 min、山柰酚的出峰時(shí)間為5.75 min。

表1 4種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析條件參數(shù)(正離子模式)

圖1 目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-MS/MS色譜

2.2 分析方法的考察

準(zhǔn)確量取含槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算精密度及準(zhǔn)確性的結(jié)果（表2）表明，儀器的精密度及準(zhǔn)確性良好。

表2 精密度、準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照上述分析方法的條件，取4種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，將濃度和峰面積（3次平均值）進(jìn)行線性回歸，并得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。由表3可知，槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁分別在10～100 000、100～100 000、10～100 000、100～1 000 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均>0.999 7，充分證明了所建立方法的靈敏度較高。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍(n=3)

2.4 皂角刺與果莢中目標(biāo)化合物的含量

取1.3.1項(xiàng)所配制的樣品溶液，按照上述的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)皂角刺及皂角果莢進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積，并由2.3中所得的回歸方程計(jì)算槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的含量。測(cè)定結(jié)果表明，皂角刺中，槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的含量分別為75.983、4.435、11.336、412.409 μ g/g；皂角果莢中4種目標(biāo)化合物的含量分別為0.391、18.415、10.014、292.265 μ g/g。槲皮苷和蘆丁在皂角刺中的含量高于果莢中的含量，具有顯著性差異（p<0.05）；槲皮素在皂角刺中的含量低于果莢中的含量，具有顯著性差異（p<0.05）；山奈酚在皂角刺和果莢中的含量相近，無顯著差異。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定皂角槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁含量的方法，經(jīng)過方法學(xué)考察證明，此方法可以快速、靈敏地實(shí)現(xiàn)皂角中4種目標(biāo)化合物的同步定量分析。同時(shí)，應(yīng)用建立的方法對(duì)比分析了皂角刺及皂角果莢兩個(gè)部位4種目標(biāo)化合物的含量水平，為皂角的綜合開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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第1作者簡(jiǎn)介：于暢游（1983-），女，主管藥師，研究生，研究方向：食品、藥品、醫(yī)療器械等微生物檢驗(yàn)。

Determination of Quercetin-3-O-rhamnoside、Quercetin、Kaempferol and Rutin of Gleditsia sinensis Harms by UPLC-MS/MS

YUChangyou
（Heilongjiang Institute for Food and Drug Control,Harbin150088）

In this study,we established an UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of quercetin,quercetin,kaempferol and rutin in Gleditsia sinensis.By investigation of chromatography and mass spectrometry methods,the optimum analytical conditions:Mobile phase of methanol-water solution (42∶58,V/V);flow rate,0.25 mL/min;column temperature,25℃;sample size,10 μL.Using electrospray ionization(ESI)ionization,multiple reaction monitoring(MRM)mode for signal acquisition,quantified using the external standard method.The result showed that the test at different concentration range was a great linear relationship(R2>0.9997).Using this method,we assayed and tested the contents of the involved four compounds in thorn and pod,showing high sensitivity,good selectivity and shorter analysis time.

UPLC-MS/MS;Gleditsia sinensis;Quercetin-3-O-rhamnoside;Quercetin;Kaempferol;Rutin

Q946.83+3,TH 843

A

婁志紅（1971-），女，主任藥師。

2017-01-20

（責(zé)任編輯：王岳）

1001-9499（2017）03-0049-03