于思慧 宋慧鵬 高 雯* 張 慧*

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2. 中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009

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紅花中黃酮類成分對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性的研究

于思慧1宋慧鵬2高 雯2*張 慧1*

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2. 中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009

目的：對(duì)紅花中黃酮類化合物的黃嘌呤氧化酶抑制活性進(jìn)行研究，并對(duì)活性成分的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行初步探討，為紅花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供依據(jù)。方法：運(yùn)用基于紫外分光光度原理的高通量微孔板篩選的方法，對(duì)從紅花分離出的12個(gè)黃酮類成分進(jìn)行黃嘌呤氧化酶抑制活性的篩選和測(cè)定。結(jié)果：從紅花所含的黃酮類成分中篩選出7個(gè)對(duì)黃嘌呤氧化酶具有較好抑制活性的化合物，其中槲皮素、楊梅素和木犀草素抑制活性明顯，其IC50分別為4.89，3.03和 7.72 μmol/L。結(jié)論：紅花中部分黃酮類成分對(duì)黃嘌呤氧化酶具有抑制作用，可為紅花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的闡明提供依據(jù)。

紅花；黃酮類；黃嘌呤氧化酶抑制作用；構(gòu)效關(guān)系

黃嘌呤氧化酶是一種人體核酸代謝的重要酶，與高尿酸血癥、糖尿病及缺血再灌注損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。黃嘌呤氧化酶抑制劑在臨床被廣泛用于治療和緩解痛風(fēng)患者的高尿酸血癥，也常用于保護(hù)心功能衰竭的患者，但部分臨床常用黃嘌呤氧化酶抑制劑(如別嘌醇)有較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)[1-2]。紅花(CarthamiFlos)為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的管狀花，其化學(xué)成分主要包括黃酮類、生物堿類、色素類、亞精胺類、腺苷類、木脂素類、有機(jī)酸類及多炔類等化合物[3]。紅花是活血散瘀的傳統(tǒng)良藥，被認(rèn)為可以促進(jìn)血液循環(huán)、清除血瘀并減輕疼痛，在痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)痛的血瘀綜合征等臨床治療中被廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，紅花具有改善心肌缺氧、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗凝、抗血栓、抗氧化、抗疲勞等作用，對(duì)臟器的缺血再灌注損傷也有一定的保護(hù)作用等[4-8]。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力降低、氧化與抗氧化失衡，均會(huì)導(dǎo)致自由基和活性氧產(chǎn)生過多，而自由基和活性氧具有損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)、氧化抗凝血酶、脂質(zhì)過氧化等作用，因此抑制自由基反應(yīng)和活性氧生成是緩解許多心血管疾病的重要途徑[9]。黃嘌呤是嘌呤降解途徑的產(chǎn)物，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤氧化生成尿酸, 并產(chǎn)生過氧化物自由基。故抑制黃嘌呤氧化酶很可能可以起到抗氧化的作用。為了闡明紅花抗氧化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者從黃嘌呤氧化酶入手[11-17]，通過基于紫外分光光度原理的微孔板篩選的方法，對(duì)紅花中的黃酮類化合物的黃嘌呤氧化酶抑制活性進(jìn)行研究，以期為今后闡明紅花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1 儀器與材料

酶標(biāo)儀Synergy2(美國(guó) Bio-Tek公司)，Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國(guó) Millipore公司)，多道移液器(RAININ)，96孔板(無錫NEST生物科技公司)，KH-500DB型超聲波提取器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，渦旋混合器(上海比朗儀器制造公司)。陽性藥別嘌醇(上海阿拉丁試劑公司)，黃嘌呤氧化酶和黃嘌呤(美國(guó) Sigma 公司)，二甲基亞砜(DMSO，分析純)；實(shí)驗(yàn)用樣品：羥基紅花黃色素A(1)，山柰素(2)，圣草酚(3)，芹菜素(4)，楊梅素(5)，槲皮素(6)，蘆丁(7)，木犀草素(8)，木犀草苷(9)，野黃芩苷(10)，山奈酚-3-O-蕓香糖苷(11)，槲皮素-7-O-葡萄糖苷(12)，結(jié)構(gòu)式如圖1。以上實(shí)驗(yàn)樣品均為本課題組從紅花藥材中分離制備，并經(jīng) MS、1H NMR、13C NMR 等波譜手段確證結(jié)構(gòu)，純度均大于95%；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 溶液配制 磷酸鹽緩沖液的配制：精密稱取磷酸二氫鉀0.9560 g，三水合磷酸氫二鉀6.9460 g以及乙二胺四乙酸(EDTA)18.62 mg于500mL的燒杯中，倒入適量超純水超聲片刻，取出，置于500 mL的容量瓶中并定容，即得濃度為75 mmol/L PO43-、200 μmol/L EDTA且pH 為7.4的磷酸鹽緩沖液；分裝并保存于-20℃的冰箱中。

黃嘌呤氧化酶液的配制：原黃嘌呤氧化酶(10U/mL)保存在-70℃的冰箱中以備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)在超凈臺(tái)用磷酸鹽緩沖液稀釋酶至0.08U/mL，置于冰盒中并盡快實(shí)驗(yàn)，并避免酶反復(fù)凍融而降低活性。

底物的配制：精密稱取底物黃嘌呤3.65 mg放置于燒杯中，加入磷酸鹽緩沖液適量超聲促溶，取出，定容至50 mL，搖勻；置于水浴鍋里逐漸加熱至澄清透明，得0.48 mmol/L底物溶液。底物溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配制。

2.2 樣品的配制 精密稱取各樣品適量，用DMSO分別配制成10 mmol/L 儲(chǔ)備液，保存在-20℃的冰箱中并用錫箔紙包好避光。實(shí)驗(yàn)時(shí)用磷酸鹽緩沖液對(duì)半稀釋至6～8個(gè)濃度并渦旋混勻。

2.3 測(cè)定方法與數(shù)據(jù)處理 底物黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的催化下生成產(chǎn)物尿酸，其最大吸收波長(zhǎng)為295nm。根據(jù)此原理建立的紫外分光光度-高通量微孔板篩選的方法[18]可用于黃嘌呤氧化酶抑制活性的快速測(cè)定，黃嘌呤氧化酶抑制率用樣品組和空白組吸光度值(A)的變化速率(dA/dt)進(jìn)行計(jì)算。具體方法如下：吸取待測(cè)樣品100μL置于96孔板相應(yīng)孔中，向其加入黃嘌呤氧化酶液50μL，混勻后在酶標(biāo)儀上于37℃孵育3min；加入配制好的黃嘌呤底物溶液50μL，立即在295nm波長(zhǎng)下測(cè)定，每隔15s讀數(shù)一次，記錄5min內(nèi)吸光度值A(chǔ)的變化；空白組以100μL磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液，與樣品組平行操作。每個(gè)樣品平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。抑制率按照下列公式計(jì)算：

抑制率( % ) =[(dA/dt)空白-(dA/dt)樣品]/(dA/dt)空白×100。

其中dA為反應(yīng)終了與反應(yīng)起始時(shí)吸光度的差值，dt為反應(yīng)時(shí)間，該時(shí)間根據(jù)吸光度變化斜率選擇。每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)以別嘌醇作為陽性對(duì)照藥。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 首先在100μmol /L濃度下進(jìn)行活性篩選，將篩選得到的具有較好的化合物(4個(gè)復(fù)孔的平均抑制率大于50%)分別對(duì)半稀釋至8個(gè)濃度，再次進(jìn)行梯度篩選。數(shù)據(jù)采集采用Gen5軟件，IC50值通過酶抑制劑的濃度和平均抑制率利用軟件GraphPad Prism 6.0進(jìn)行計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 紅花中的12種成分抑制酶活性測(cè)定 對(duì)紅花中12個(gè)黃酮類化合物(100μmol /L)進(jìn)行了黃嘌呤氧化酶抑制活性測(cè)定，結(jié)果顯示，化合物2～化合物10均具有一定的黃嘌呤氧化酶抑制作用，化合物2、4、5、6、7、8、9等7種化合物抑制率均超過50%，其中化合物5、6、8，即楊梅素、槲皮素和木犀草素抑制活性最強(qiáng)，約90%，化合物11、12抑制活性不明顯。結(jié)果見表1。

表1 紅花中12種黃酮類成分的黃嘌呤氧化酶抑制活性測(cè)定結(jié)果

3.2 紅花中7種成分抑制酶活性量效關(guān)系測(cè)定 上述試驗(yàn)表明，化合物2、4、5、6、7、8、9等7種化合物(100μmol /L)對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性超過50%，為此設(shè)置了100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5625μmol/L、0.78125μmol/L 8個(gè)濃度，對(duì)其量效關(guān)系進(jìn)行研究，并計(jì)算IC50。結(jié)果顯示，7個(gè)化合物均呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系(圖2)，7個(gè)化合物IC50值排序由低到高分別是楊梅素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、木犀草苷、蘆丁、山柰素(圖3)。

3.3 紅花中黃酮類成分與抑制酶活性的構(gòu)效關(guān)系分析 黃酮類成分根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為兩大類，即苷類和苷元類。通過上述研究發(fā)現(xiàn)，苷元的黃嘌呤氧化酶抑制活性普遍都大于苷的活性，例如木犀草素的IC50為7.72μmol/L，而木犀草苷的IC50為40.56μmol/L；槲皮素在100μmol/L濃度下抑制率為93.83%，而槲皮素-7-O-葡萄糖苷抑制率僅為13.55%；山柰素在100μmol/L濃度下抑制率為51.12%，而山奈酚-3-O-蕓香糖苷抑制率僅為2.16%。苷元類化合物活性也與結(jié)構(gòu)相關(guān)，如芹菜素、楊梅素、槲皮素和木犀草素這四種苷元成分活性均較強(qiáng)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上有相似之處，即C-5和C-7均有羥基存在，山柰素則因結(jié)構(gòu)中(4’位)含有一個(gè)甲基活性明顯降低；圣草酚與木犀草素相比，結(jié)構(gòu)中僅少了C-2和C-3位的一個(gè)雙鍵，抑制率卻大大降低，在100 μmol/L濃度時(shí)抑制率分別為47.52%和89.34%；另外，蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷相比，只是在3’位多一個(gè)羥基，活性卻大大增強(qiáng)，由此可見在紅花的黃酮類成分中3’位上的羥基對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性起到了一定的作用，因此紅花中的黃酮類成分的結(jié)構(gòu)與黃嘌呤氧化酶抑制活性存在一定的構(gòu)效關(guān)系。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)抑制率(%)=[(dA/dt)空白-(dA/dt)樣品]/(dA/dt)空白×100，該公式是利用黃嘌呤氧化酶催化反應(yīng)的速率差異來計(jì)算抑制率，初速度在相同體系里是相對(duì)穩(wěn)定的，只需控制時(shí)間的長(zhǎng)短，選擇合適的反應(yīng)時(shí)間(酶催化反應(yīng)的平臺(tái)期之前)，計(jì)算所得抑制率相對(duì)較穩(wěn)定。

在實(shí)驗(yàn)過程中，樣品與酶和底物接觸后立即反應(yīng)，而酶標(biāo)儀對(duì)96孔板每一行復(fù)孔數(shù)據(jù)的讀取有微弱的差異，故每一行均要設(shè)有空白參比，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

從實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果看，紅花中分離出的12個(gè)黃酮類化合物中對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用比較明顯的主要為楊梅素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、木犀草苷、蘆丁和山柰素這7個(gè)成分；分析這7個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)與其對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用的構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)，苷元普遍比苷抑制黃嘌呤氧化酶的活性高，苷元連上糖鏈后活性明顯下降；另外通過分析苷元類化合物的結(jié)構(gòu)與活性，其中活性較好的芹菜素、楊梅素、槲皮素和木犀草素結(jié)構(gòu)相似，推測(cè)黃酮結(jié)構(gòu)中C-5和C-7上的羥基可以大大增強(qiáng)黃嘌呤氧化酶的抑制活性；蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷相比，只是在3’位多一個(gè)羥基，推測(cè)3’位上的羥基對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性起到了一定的作用；圣草酚與木犀草素的結(jié)構(gòu)相比僅少了C-2和C-3的一個(gè)雙鍵，抑制率卻大幅度降低，可見C-2和C-3上的雙鍵可以保證其平面結(jié)構(gòu)，該平面結(jié)構(gòu)是一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，對(duì)于黃嘌呤氧化酶抑制活性的作用非常關(guān)鍵。

基于紫外分光光度法的微孔篩選測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、快捷、取樣量小，可同時(shí)進(jìn)行多樣品平行檢測(cè)，為從中草藥中尋找高效安全的黃嘌呤氧化酶抑制劑提供了一種科研理念和思路，也為中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)提供了一種高通量篩選途徑。

在藥典中，羥基紅花黃色素A在紅花中的含量較高，要求不得少于1%，但在本實(shí)驗(yàn)中抗黃嘌呤氧化酶的作用并不強(qiáng)，可見在紅花中的羥基紅花黃色素A并不是起抑制黃嘌呤氧化酶活性的藥效成分；孫沂[19]在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得槲皮素在紅花中含量為0.2%左右；韓煒[20]在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得木犀草素在紅花的平均含量為0.05%；但楊梅素目前無含量方面的報(bào)道，但本實(shí)驗(yàn)可為中藥材紅花的抗氧化的藥效成分研究提供一定的基礎(chǔ)，為其今后的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

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Study on the Inhibitory Activity of Flavonoids in Carthami Flos on Xanthine Oxidase

YU Sihui1SONG Huipeng2GAO Wen2*ZHANG Hui1*

1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600，China 2. China Pharmaceutical University, Nanjing 210009,China

Objective To supplement the pharmacology and efficacy research of Carthami Flos, the bioactive components of Carthami Flos on the xanthine oxidase inhibitory activity was screened, and the structure-activity relationship was discussed. Methods An in vitro high-throughput screening method based on microplate and spectrophotometer was developed. Then the method was used to evaluate the xanthine oxidase inhibitory activity of flavonoidsisolated from Carthami Flos. Results Among 12 flavonoids, 7 components exhibited more than 50% inhibition at 100 μmol /L, and the most active components werequercetin, myricetinand luteolin with the IC50 value of 4.89,3.03 and 7.72 μmol/L, respectively. Conclusion The results demonstrated that some flavonoids components in Carthami Flos has possessed inhibitory effect on xanthine oxidase, which provided a supplement to clarify the material basis and therapeutic mechanism of Carthami Flos.

Carthami Flos; Flavonoids; Xanthine Oxidase Inhibitors; Structure-activity Relationships

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81503241)。

于思慧(1992-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評(píng)價(jià)與創(chuàng)新藥物研究。E-mail:yusihui0123@163.com

張慧(1970-)，女，漢族，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評(píng)價(jià)與創(chuàng)新藥物研究，E-mail:syyycs@163.com；高雯(1986-)，女，漢族，博士，講師，研究方向?yàn)橹兴幓钚园l(fā)現(xiàn)與質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail:gw_cpu@126.com

R284

A

1007-8517(2017)09-0023-04

2017-03-23 編輯：陶希睿)