田 康，王 鎮(zhèn)，趙煥云，楊 東，李國云，段博芳，張應(yīng)國，范泉水，李蓮軍，張文東，張富強

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650223；2.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 650201；3.迪慶州動物疫病預(yù)防控制中心，云南香格里拉 674400；4. 香格里拉市動物疫病預(yù)防控制中心，云南香格里拉 674400；5.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，云南昆明 650118）

云南省部分活禽零售市場休市前后禽流感病毒動態(tài)監(jiān)測

田 康1，2，王 鎮(zhèn)3，趙煥云2，楊 東4，李國云4，段博芳2，張應(yīng)國2，范泉水5，李蓮軍1，張文東2，張富強5

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650223；2.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 650201；3.迪慶州動物疫病預(yù)防控制中心，云南香格里拉 674400；4. 香格里拉市動物疫病預(yù)防控制中心，云南香格里拉 674400；5.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，云南昆明 650118）

[目的]監(jiān)測活禽零售市場休市前后家禽和環(huán)境中禽流感病毒的分布和波動狀況，評估定期休市干預(yù)效果。[方法] 在2015年9月28日至11月11日的3輪休市期間，從云南省選取4個有代表性的活禽零售市場，于休市的前1天、休市當(dāng)日及休市后1天（復(fù)市當(dāng)日）、3天、5天、10天，采集家禽喉氣管、咽喉/泄殖腔棉拭子和環(huán)境樣品，連續(xù)進行3輪采樣，采用甲型流感病毒通用型RT-PCR方法，檢測樣品中的病毒核酸，開展禽流感病毒分布動態(tài)監(jiān)測和休市干預(yù)效果評估。[結(jié)果]不同市場、不同休市輪次的休市干預(yù)效果參差不齊；禽流感病毒在雞鴨混雜銷售的市場中呈現(xiàn)持續(xù)分布，而在僅有雞銷售的市場中呈間斷或零星分布；鴨群樣品陽性率高于環(huán)境樣品和雞群樣品陽性率。[結(jié)論]研究結(jié)果提示：鴨群對活禽零售市場的禽流感病毒傳入、擴散和持續(xù)分布發(fā)揮著極其重要的作用；活禽零售市場的休市干預(yù)效果受多種因素影響，只有科學(xué)規(guī)范實施休市制度和嚴(yán)格執(zhí)行監(jiān)管措施，才能獲得良好的休市干預(yù)效果。

禽流感病毒；活禽市場；休市；監(jiān)測

禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類傳染性疾病綜合征，部分H5、H7亞型病毒可感染人，甚至可導(dǎo)致多人死亡[1-2]，其不僅給家禽產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重威脅人類身體健康和公共衛(wèi)生安全。鑒于活禽交易市場中的家禽及其他動物來源復(fù)雜，人員往來及動物流動頻繁，陸禽、水禽高密度混雜聚集，衛(wèi)生條件差，以及病原種類或病毒血清（亞）型、基因型眾多，動物長期處于應(yīng)激狀態(tài)等原因，病原極易大量復(fù)制增殖并在動物群體及環(huán)境中持續(xù)分布、擴散，再加上動物與動物、人與動物之間的近距離密切接觸，活禽交易市場已成為禽流感病毒持續(xù)存在的重要場所[1-5]。因此，對活禽交易市場的有效管控，包括實施定期休市消毒制度，有利于降低動物群體及市場環(huán)境中的禽流感病毒載量，防止病毒在動物與動物、動物與人之間傳播。但由于受多種因素影響，其實施效果存在不確定性[3-5]。2015年9月云南省在部分地區(qū)實施了活禽交易市場休市干預(yù)措施。為評估休市干預(yù)效果，分析可能存在的干擾因素，從云南省選取4個每半月休市1次（天）的，有代表性的活禽零售市場，在3個休市期間，連續(xù)采集家禽及環(huán)境樣品進行禽流感病毒檢測，基于休市前后病毒分布和波動動態(tài)，進行評估分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及病毒對照

病毒R N A/D N A提取試劑盒（Ta K a R a MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、Premix Taq酶、DL2000 DAN Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；氯仿、異丙醇為分析純試劑；滅活的H5N1、H9N2亞型病毒，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，作為檢測病毒的陽性對照。

1.2 市場選取和采樣時間點設(shè)置

在2015年9月28日到11月11日3輪休市期間，從云南省選取雞鴨同攤位出售（市場1），僅有雞出售（市場2、市場4），以雞出售為主、零星有鴨出售（市場3）的4個有代表性的活禽零售市場進行休市效果評估。分別于每輪休市的前1天、休市當(dāng)天，以及休市后1天（復(fù)市當(dāng)天）、3天、5天、10天（共6個時間點）連續(xù)采集樣品。

1.3 抽樣策略、樣品數(shù)量及樣品采集

采取兩段分層隨機抽樣。第一階段，按照市場內(nèi)不同家禽種類的攤位數(shù)量，按照50%的攤位預(yù)期流行率、30%的可接受絕對誤差和95%的置信水平，隨機至少選取10個攤位（后兩輪的采樣攤位與其一致）；第二階段，根據(jù)每個攤位內(nèi)活禽的存欄量，以發(fā)現(xiàn)疫病方式計算樣本量，按照每個攤位50%的個體流行率、90%的試驗敏感性和95%的置信水平，采集家禽喉氣管（優(yōu)先采集）、咽喉/泄殖腔棉拭子樣品（休市當(dāng)天除外）和環(huán)境樣品（地面、籠具、食槽、運輸工具）10～25份。將喉氣管樣品直接置于2 mL EP管中，將棉拭子放入預(yù)先裝有500 μL無菌PBS的EP管中，-20 ℃或更低溫度凍存。在3輪休市期間，共采集樣品2 500份，其中雞喉/氣管樣品1 157份、鴨喉氣管樣品93份、雞咽喉/泄殖腔棉拭子142份、鴨咽喉/泄殖腔棉拭子102份、環(huán)境樣品1 006份。

1.4 樣品檢測及數(shù)據(jù)分析

按試劑盒提供的操作手冊，從家禽喉氣管組織研磨離心上清液、咽喉/泄殖腔或環(huán)境棉拭子浸出液中，提取總RNA；參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RT-PCR檢測方法》（NY/T 772—2013）及本課題組建立的方法[6]檢測禽流感病毒核酸。采用Excel和JMTJFX 10.34軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 休市前后禽流感病毒核酸的檢測結(jié)果及休市干預(yù)效果

不同市場、同一市場不同輪次的休市干預(yù)效果參差不齊。如：對市場1第2輪雞群、市場4第1輪環(huán)境及第2輪雞群（P<0.01）的休市效果明顯；對市場1的3個輪次環(huán)境、市場2第1、3輪休市前后雞群（P<0.05）有一定的休市效果；對市場1第1、3輪休市前后雞群（P>0.05）的休市效果不明顯或無效果；對市場2和市場3第2輪雞群及市場2第1～2輪環(huán)境，無法統(tǒng)計分析干預(yù)效果（表1）。

存在休市當(dāng)天對環(huán)境消毒不徹底的情況，如在市場1和市場3的第1輪休市當(dāng)天采集的環(huán)境樣品中，仍可檢測到禽流感病毒核酸和活病毒。

2.2 不同活禽零售市場雞群中禽流感病毒核酸檢測結(jié)果及干預(yù)效果比較

綜合4個市場3輪休市中不同活禽零售市場雞群樣品總體檢測結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)：禽流感病毒在市場1雞群中呈現(xiàn)持續(xù)分布，在其余市場雞群中呈現(xiàn)間斷或零星分布；休市對市場2和市場4雞群中的禽流感病毒分布和擴散有一定的干預(yù)效果（P<0.05），對其余2個市場的休市干預(yù)效果不明顯或無效果（P>0.05）。

圖1不同市場休市前后雞群中禽流感病毒核酸檢測結(jié)果

2.3 不同活禽零售市場環(huán)境中禽流感病毒核酸的檢測結(jié)果及干預(yù)效果比較

綜合4個市場3輪休市中不同活禽零售市場環(huán)境樣品總體檢測結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)：市場1和市場3環(huán)境中禽流感病毒呈現(xiàn)持續(xù)分布，而市場2和市場4環(huán)境中禽流感病毒呈現(xiàn)間斷或零星分布；休市對市場1和市場3（第3輪次除外）環(huán)境中禽流感病毒感染、分布或擴散有一定的干預(yù)效果（P<0.05）或干預(yù)效果明顯（P<0.01），而對市場2和市場4環(huán)境的休市干預(yù)效果不明顯或無效果（P>0.05）。

表1云南省活禽零售市場休市前后禽流感病毒核酸檢測陽性率及干預(yù)效果（單位：%）

圖2不同市場休市前后環(huán)境中禽流感病毒核酸檢測結(jié)果

2.4 活禽零售市場家禽及環(huán)境樣品中禽流感病毒的核酸檢測結(jié)果及干預(yù)效果比較

綜合活禽零售市場1的3輪休市總體檢測結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)：禽流感病毒在市場1呈現(xiàn)持續(xù)分布；鴨群樣品陽性率高于環(huán)境樣品和雞群樣品陽性率；休市干預(yù)除對環(huán)境中的病毒感染、分布或擴散有一定抑制效果外（P<0.05），對雞群和鴨群的效果不明顯（P>0.05）。

圖3市場1休市前后家禽及環(huán)境中禽流感病毒核酸檢測結(jié)果

綜合市場2、市場4的3輪休市結(jié)果發(fā)現(xiàn)：禽流感病毒在市場2和市場4呈現(xiàn)間斷或零星分布；雞群樣品陽性率與環(huán)境樣品陽性率無相關(guān)性和可比性?？傮w而言，休市干預(yù)對雞群中禽流感病毒感染、分布或擴散有一定或明顯的抑制或阻斷效果（P<0.05或P<0.01），但對環(huán)境中的病毒抑制效果不明顯（P>0.05）。

綜合市場3的3輪休市結(jié)果發(fā)現(xiàn)：禽流感病毒在市場3呈現(xiàn)混合分布，在雞群中以間斷或零星分布為主，而在環(huán)境中以持續(xù)分布為主；雞群樣品陽性率與環(huán)境樣品陽性率無相關(guān)性和可比性。總體而言，干預(yù)效果與市場2、市場4相反，而與市場1相似，休市干預(yù)對雞群中禽流感病毒感染、分布或擴散的抑制或阻斷效果不明顯（P>0.05），但對環(huán)境中病毒抑制效果明顯（P<0.01）。

3 討論

3.1 發(fā)病家禽和健康帶毒家禽及污染的飼料、飲水、飼料槽、運輸工具和空氣等均可傳播禽流感病毒

活禽交易市場，尤其是活禽零售市場，是不同來源、批次和種類活禽的聚集地，加之其場地狹小、衛(wèi)生條件差，雞鴨等在此高密度混雜、長時間滯留，人員、車輛往來及家禽流動、交易頻繁，因此病毒極易大量復(fù)制增殖并在家禽群體及環(huán)境中持續(xù)傳播和擴散，導(dǎo)致活禽零售市場成為禽流感病毒持續(xù)存在的高風(fēng)險區(qū)域。此外，病毒的持續(xù)分布和擴散加劇了病毒變異（基因突變和基因重配）[7-10]。因此，開展科學(xué)有效的活禽交易市場管控，對減少家禽群體和環(huán)境中禽流感病毒載量和污染面積，減緩病毒變異速率，控制和阻斷病毒在家禽間的傳播和擴散，消除和降低人感染禽流感病毒的風(fēng)險具有重要意義。

3.2 活禽零售市場休市干預(yù)的效果受多種因素影響[7-10]

休市前1天，在閉市前，應(yīng)宰殺市場內(nèi)未售出的所有活禽，禁止活禽流出市場，并對所有用具和環(huán)境進行徹底清洗和消毒。但在市場1、市場3第1輪休市的當(dāng)天采集的環(huán)境樣品中仍可檢測到病毒核酸，陽性結(jié)果已經(jīng)接種雞胚分離病毒確認(rèn)（另文報道），因此存在對環(huán)境消毒不徹底的情況。

休市后1天或復(fù)市當(dāng)天，所有進入市場的家禽應(yīng)來源于經(jīng)H5、H7、H9亞型流感檢疫合格的養(yǎng)殖場或批發(fā)市場，因此在其體內(nèi)檢出H5、H7、H9亞型流感活病毒，尤其是H5亞型活病毒的概率應(yīng)該非常低。但在市場1第1輪、第3輪休市的雞樣品，市場1各輪休市的鴨樣品，市場2、市場4第3輪休市和市場4第1輪休市的雞樣品中，均于休市后1天（復(fù)市當(dāng)天）檢出禽流感病毒核酸陽性，雞、鴨陽性率分別為5.00%～32.00%、18.75%～36.36%。對陽性樣品經(jīng)雞胚接種、病毒分離，確認(rèn)存在H5、H9亞型活病毒，表明當(dāng)天進入市場的家禽就已攜帶病毒。因此，應(yīng)加強對流入市場家禽的監(jiān)管和檢疫，盡量避免外表健康的隱性感染帶毒家禽或免疫帶毒家禽進入市場。

每天閉市前，應(yīng)宰殺市場內(nèi)未售出的所有活禽，禁止活禽在市場過夜或流出市場，但目前對此缺乏強制性監(jiān)管。

雞、鴨等應(yīng)分離或分市銷售[9，11]，但市場1一直存在雞鴨鵝混雜銷售的攤位，市場3零星存在雞鴨混雜銷售，說明對該措施缺乏強制性監(jiān)管。

優(yōu)先采集喉氣管樣品，考慮到與咽喉拭子、泄殖腔拭子樣品相比，組織樣品中的病毒滴度更高，離體后病毒存活時間更長，有利于提高檢測結(jié)果的敏感性，但需要宰殺動物，采樣成本高。

3.3 水禽對活禽零售市場禽流感病毒的傳入、擴散和持續(xù)分布發(fā)揮著重要作用

檢測發(fā)現(xiàn)，僅有雞銷售的市場2、市場4，以雞銷售為主、零星有鴨銷售的市場3的家禽和環(huán)境中，禽流感病毒均呈現(xiàn)間斷或零星分布；而在雞鴨混雜銷售的市場1，禽流感病毒在家禽和環(huán)境中卻呈現(xiàn)持續(xù)分布。

在3輪休市樣品采集的15個時間點（休市當(dāng)天除外），市場2、市場3和市場4雞群樣品中，分別有9個（60.00%）、9個（60.00%）和12個（80.00%）時間點，環(huán)境樣品中分別有13個（86.67%）、7個（46.67%）和12個（80.00%）時間點，未檢出禽流感病毒核酸，而在市場1的雞群、環(huán)境中，僅分別在3個（20.00%）、1個（6.67%）時間點，未檢出禽流感病毒核酸。監(jiān)測發(fā)現(xiàn)：市場1（有雞鴨混雜銷售）較市場2、市場4（僅有雞銷售）和市場3（以雞銷售為主、零星有鴨銷售）的禽流感病毒陽性率高，且病毒呈現(xiàn)持續(xù)分布；市場2和市場4對雞群休市的干預(yù)效果較市場1和市場3明顯；市場1鴨群樣品禽流感病毒陽性率明顯高于雞群樣品和環(huán)境樣品。加之已有研究報道，鴨等水禽感染禽流感病毒后，臨床癥狀不明顯但可長時間持續(xù)排出活病毒[11-12]。這些均提示鴨群可能對活禽零售市場中禽流感病毒的傳入、擴散和持續(xù)分布發(fā)揮著極其重要的作用。因此，應(yīng)加強對市場鴨群的檢疫，避免鴨群和雞群混雜聚集，嚴(yán)格實施分離或分市銷售。

[1] ARIOLA C S，NELSON D I，DELIBERTO T J. Infection for persons exposed to highly pathogenic avian influenza A H5 virus-infected birds，United States[J]. Emerg infect Dis，2015，21（12）：2135-2140.

[2] HEIDAR I，MANCIN M，NILI H. Serological evidence of H9N2 avian inf l uenza virus exposure among poultry workers from Fars province of Iran[J]. Viro J，2016，13（1）：1-9.

[3] ZHOU P，MA J，LAI A. Avian influenza A（H7N9）virus and mixed live poultry-animal markets in Guangdong province：a perfect storm in the making[J]. Emerg microbes infect，2015，4（10）：e63.

[4] KANG M，HE J，SONG T. Environmental Sampling for Avian Influenza A（H7N9）in Live-Poultry Markets in Guangdong，China[J]. PLoS One，2015，10（5）：e0126335.

[5] YU H，WU J T，COWLING B J. Effect of closure of live poultry markets on poultry-to-person transmission of avian influenza A H7N9 virus：an ecological study[J]. Lancet，2014，383：541-548.

[6] 張應(yīng)國，宋建領(lǐng)，胡媛媛，等. 禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR檢測技術(shù)的建立[J]. 中國獸醫(yī)科技，2005，35（8）：600-604.

[7] 鄒麗容，毛小曉，武婕，等. 2012—2015年廣東省活禽市場外環(huán)境禽流感病毒污染狀況研究[J]. 激光生物學(xué)報，2016，25（3）：276-282.

[8] 劉偉，馬利君，顏丙新. 濟寧市2013—2014年活禽市場外環(huán)境禽流感監(jiān)測分析[J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，21：396-399.

[9] 彭聰，彭南秀，段曉冬，等. 廣州市活禽交易市場休市效果評估隊列研究[J]. 中國動物檢疫，2016，33（8）：3-7.

[10] 賈偉新，廖明. 從活禽交易的干預(yù)效果看我國禽流感的流行與防控[J]. 中國家禽，2015，37（25）：1-3.

[11] 王蛟，刁有祥，孫曉艷，等. H9N2亞型禽流感病毒對櫻桃谷肉鴨的致病性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2014，34（11）：1732-1737.

[12] CHEN H，DENG G，LI Z，et al. The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China[J]. The Proceedings of the National Academy of Science of the USA，2004，101：10452-10457.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Dynamic Monitoring of Avian Inf l uenza Virus before and after the Closure of Some Live Poultry Retail Markets in Yunnan Province

Tian Kang1，2，Wang Zhen3，Zhao Huanyun2，Yang Dong4，Li Guoyun4，Duan Bofang2，Zhang Yingguo2，F(xiàn)an Quanshui5，Li Lianjun1，Zhang Wendong2，Zhang Fuqiang5

（1. Yunnan Agriculture University，Kunming，Yunnan 650223；2. Centre for Animal Disease Control and Prevention of Yunnan Province，Kunming，Yunnan 650201；3. Centre for Animal Disease Control and Prevention of Diqing Municipality，Shangri-La，Yunnan 674400；4. Centre for Animal Disease Control and Prevention of Shangri-La City，Shangri-La，Yunnan 674400；5. Centre for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Region，Kunming，Yunnan 650118）

[Objective] To monitor the distribution and fl uctuation of avian inf l uenza virus in poultry and environment before and after the closure of live poultry markets，and to evaluate the effect of regular intervention. [Methods] Samples including poultry larynx and trachea tissues，throat/cloaca and environmental cotton swabs were collected from four representative markets on the fi rst day before closure，the closing day and the fi rst，the third，the fi fth and thetenth day after closure in three consecutive rounds during 28th September to 11th November in 2015. The viral nucleic acids of the samples were detected using inf l uenza type A virus universal RT-PCR for surveillance of avian inf l uenza virus dynamics and evaluation the intervention effect. [Results] The results showed that the effectiveness of closure intervention among the different markets and rounds were uneven or varied. The distribution of avian inf l uenza virus in the chickens and ducks mixed markets was persistent and continuous，but discontinuous or sporadic in the only chicken sales markets. The positive rate of viral nucleic acids in ducks was higher than in chickens or environment. [Conclusion] The results suggested that the duck played a very important role in introduction，transmission，spreading，and continuous distribution of avian inf l uenza virus in live poultry retail markets. The intervention effectiveness of market closure were inf l uenced or disturbed by many factors. To obtain good intervention effect，the regulations of market closure and supervision should be implemented scientif i cally，standardly and strictly.

avian inf l uenza virus；live poultry market；market closure；surveillance

S852.65+9.5

：A

：1005-944X（2017）06-0001-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.001

國家公益性行業(yè)專項（201103008）；軍隊科技計劃項目（BWS14J025）

并列第一作者：田 康、王 鎮(zhèn)

張文東、張富強