王燁，韓蕾，董捷，黃家興，吳杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京100093）

蘭州熊蜂氣味受體家族鑒定及分析

王燁，韓蕾，董捷，黃家興，吳杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京100093）

【目的】了解蘭州熊蜂（Bombus lantschouensis）基因組中氣味受體基因（odorant receptors, Ors）情況，為進(jìn)一步分析氣味受體功能提供信息，從而為研究該基因家族在熊蜂覓食、交尾、通訊等行為中的重要功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā刻崛√m州熊蜂胸部基因組DNA，進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序所得原始序列進(jìn)行質(zhì)控并拼接獲得基因組序列，然后使用本地 blast 2.2.28+對(duì)構(gòu)建蘭州熊蜂基因組本地?cái)?shù)據(jù)庫，使用已知的地熊蜂（Bombus terrestris）和意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）的氣味受體蛋白序列作為種子序列搜索數(shù)據(jù)庫獲得蘭州熊蜂的氣味受體序列；使用EMBOSS1.5對(duì)氣味受體蛋白序列進(jìn)行基本理化分析，利用GSDS2.0對(duì)家族序列的內(nèi)含子與外顯子位置進(jìn)行分析，然后使用MEME 4.11.2對(duì)氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析，最后利用ClustaW 2.1、TrimAl 1.2、PhyML3.0對(duì)蘭州熊蜂、地熊蜂和意大利蜜蜂氣味受體家族序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。【結(jié)果】共獲得165個(gè)蘭州熊蜂氣味受體基因，包括1個(gè)非典型氣味受體（olfactory receptor co-receptor，Orco）、5個(gè)假基因和159個(gè)氣味受體?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，氣味受體家族外顯子數(shù)目從4個(gè)到9個(gè)不等。其中Or 47—57的序列中外顯子數(shù)量最少，為4個(gè)；Or 128—161中外顯子的數(shù)量最多，為9個(gè)。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的不同，將氣味受體分為10大類型，每個(gè)類型中的序列都有相似的外顯子長(zhǎng)度與數(shù)量。Or 1—38、Or 69—85、Or 128—164這3大類所包含成員數(shù)較多（分別為38、17、37），其他7類包含成員個(gè)數(shù)都約10個(gè)，且每個(gè)類型中序列在染色體上都呈串聯(lián)排布，其中Or 1—38中都包含一個(gè)較長(zhǎng)的第一外顯子。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，在檢索的10個(gè)保守基序中，除基序5為未知基序外，其他9個(gè)基序均包含在其保守結(jié)構(gòu)域（7tm_6 domain）中。 Or 1—38與Or 39—46多數(shù)成員包含全部10個(gè)保守基序，基序2、3、4、9廣泛存在于該家族成員序列中，這4個(gè)基序可能為該家族關(guān)鍵的功能區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育分析將Ors分為5個(gè)亞家族（I—V），其中亞家族 II包含 2種基因結(jié)構(gòu)類型序列（BlOr 97—100與BlOr 69—85），亞家族V包含4種（BlOr 1—46、47—57、86—95和101—107）。BlOr 150—155與AmOr 122—139分別聚為兩個(gè)分支，BlOr 47—57與AmOr 63—65也發(fā)現(xiàn)類似的聚類，這表明在進(jìn)化中，蜜蜂與熊蜂的Ors出現(xiàn)了特異性的擴(kuò)張與缺失。在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)Or 115較早與其他成員分離，位于樹的基部，推測(cè)該序列可能更接近氣味受體家族的祖先序列?！窘Y(jié)論】探明了蘭州熊蜂的Or基因數(shù)量、基因結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化關(guān)系；該基因家族在進(jìn)化過程中部分成員保守基序丟失，這些結(jié)果為進(jìn)一步了解 Or基因功能打下了基礎(chǔ)。

蘭州熊蜂；氣味受體；基因結(jié)構(gòu)；保守基序；進(jìn)化分析

0 引言

【研究意義】熊蜂屬于膜翅目蜜蜂科昆蟲，是蜜蜂的近緣物種，在維持自然生態(tài)系統(tǒng)平衡和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用[1-2]。蘭州熊蜂（Bombus lantschouensis）是中國(guó)近年篩選出的優(yōu)良蜂種，由于其易于人工飼養(yǎng)、蜂群群勢(shì)大、溫馴等優(yōu)勢(shì)，在設(shè)施作物授粉方面有較大的應(yīng)用潛力[3]。嗅覺在昆蟲感知外界環(huán)境、群內(nèi)成員信息交流以及社會(huì)行為等方面都起到十分重要作用[4]。氣味受體在嗅覺反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，其介導(dǎo)的氣味分子與嗅覺神經(jīng)元的專一性結(jié)合是昆蟲嗅覺識(shí)別的重要基礎(chǔ)[5-6]。因此，研究熊蜂中氣味受體基因，對(duì)進(jìn)一步了解氣味受體在嗅覺反應(yīng)中的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲擁有復(fù)雜的嗅覺系統(tǒng)使其能夠?qū)ν饨绛h(huán)境進(jìn)行識(shí)別，從而影響覓食、繁殖、群集及躲避敵害等行為[7]。在昆蟲嗅覺識(shí)別的過程中有多種蛋白參與，主要包括氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、氣味受體（odorant receptors，Ors）、化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）以及感覺神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuronmembrane proteins，SNMPs）等[8]，這些嗅覺蛋白中Ors是嗅覺識(shí)別過程中關(guān)鍵成分。當(dāng)環(huán)境中氣味分子通過昆蟲嗅覺感受器表皮上的微孔進(jìn)入感受器腔中，與OBP或是CSPs形成復(fù)合體，然后被運(yùn)送到嗅覺神經(jīng)元樹突膜上與SNMPs和Ors相互作用，引起動(dòng)作電位，從而傳入中樞神經(jīng)控制昆蟲產(chǎn)生特定的生理與行為反應(yīng)[9]。昆蟲的氣味受體為7次跨膜蛋白，其N端位于細(xì)胞膜內(nèi)而C端位于膜外[6,10]，嗅覺傳導(dǎo)信號(hào)過程與傳統(tǒng)G蛋白偶聯(lián)受體不同，是一種獨(dú)特的離子門控傳遞方式[11-12]。昆蟲的嗅覺神經(jīng)元一般表達(dá)兩類氣味受體：一類是傳統(tǒng)氣味受體，可以識(shí)別氣味分子和信息素，在不同昆蟲中同源性很低，具有高度的多樣性；另一類受體在不同昆蟲之間保守，不感受氣味，與大多數(shù)傳統(tǒng)氣味受體共表達(dá)，稱為非典型氣味受體 Orco （olfactory receptor co-receptor）[4,13]。由于嗅覺在參與昆蟲取食、繁殖以及個(gè)體之間信息交流中都發(fā)揮著重要作用，因此了解嗅覺在昆蟲活動(dòng)中發(fā)揮的作用以及調(diào)控機(jī)制尤為重要。自BUCK等[14]在褐家鼠（Rattus norvegicus）中發(fā)現(xiàn)嗅覺受體蛋白家族之后，在多種生物中都發(fā)現(xiàn)了氣味受體，昆蟲中氣味受體家族的鑒定，直到1999年黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）基因組測(cè)序后，在其基因組中鑒定出62個(gè)Ors基因[15]。隨后在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）中鑒定到79 個(gè)Ors[16]，家蠶（Bombyx mori）中有60個(gè)[17-19]。在膜翅目昆蟲中，Or家族相對(duì)于果蠅與蚊類發(fā)生了擴(kuò)展，目前在金小峰（Nasonia wasps）中發(fā)現(xiàn)300個(gè)Ors[20]，在螞蟻（Linepithema humile等）中甚至達(dá)到400個(gè)[21-24]，在與熊蜂親緣關(guān)系較近的意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）中共發(fā)現(xiàn)170個(gè)Ors，其中7個(gè)為假基因，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這170個(gè)Ors分為5個(gè)亞家族，包含4個(gè)小亞家族和1個(gè)大亞家族（包含157個(gè)Ors）[25]。研究表明AmOr 151與AmOr 152在雌性蜂中具有較高的表達(dá)量，而且已被鑒定與花香氣味分子靶定，AmOr 151主要靶標(biāo)為大多數(shù)植物釋放的芳香醇?xì)馕斗肿覽26]。最近在小蜜蜂（Apis florea）的基因組中鑒定獲得180個(gè)Ors，與意大利蜜蜂中的Ors序列十分相似，在小蜜蜂中還發(fā)現(xiàn)了一些與蜜蜂非同源的Ors和獨(dú)立的假基因，說明在這兩個(gè)物種的Ors進(jìn)化中發(fā)生了分離[27]。目前對(duì)熊蜂中氣味受體的研究很少，僅在B. terrestris全基因組測(cè)序后，鑒定獲得165個(gè)Ors[28]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著測(cè)序技術(shù)的日漸成熟，許多昆蟲的基因組都已被測(cè)序，其氣味受體也相繼被發(fā)覺，而且對(duì)氣味受體越來越深入的研究發(fā)現(xiàn)，氣味受體對(duì)昆蟲的社會(huì)活動(dòng)起到十分重要的作用，但目前在熊蜂上氣味受體相關(guān)的研究很少，對(duì)蘭州熊蜂氣味受體的研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)蘭州熊蜂基因組測(cè)序挖掘氣味受體家族，并利用生物信息學(xué)的方法對(duì)其特性、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，鑒定蘭州熊蜂的氣味受體家族，為克隆蘭州熊蜂氣味受體基因提供信息，并為研究氣味受體家族在熊蜂中的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2016年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所昆蟲授粉與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

蘭州熊蜂為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所昆蟲授粉與生態(tài)研究室繁育，飼養(yǎng)溫度（28±0.5）℃，相對(duì)濕度為 50%±5%，無光照。取蜂群中雄性蜂，使用基因組 DNA提取試劑盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit）提取其胸部基因組DNA，交由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行 Illumina高通量測(cè)序，將測(cè)序所得原始序列進(jìn)行質(zhì)控，拼接獲得蘭州熊蜂的基因組。使用本地blast 2.2.28+對(duì)基因組進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及序列搜索。

1.2 序列鑒定與理化特性

使用地熊蜂與意大利蜜蜂的Ors序列作為參考序列進(jìn)行tblastn搜索，搜索條件設(shè)定e值為 1×10-6。選取序列相似度最高部分進(jìn)行拼接（相似度最低閾值50%）。然后，將拼接獲得的編碼區(qū)序列翻譯獲得對(duì)應(yīng)氨基酸序列，最后，將氨基酸序列提交到 SMART （http://smart.embl–heidelberg .de/）數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證其保守結(jié)構(gòu)區(qū)域7tm_6（PF02949）。

使用TMHMM對(duì)序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用EMBOSS1.5[29]中PEPSTATS程序?qū)λ@得的氨基酸序列進(jìn)行分子量與等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.3 氣味受體基因結(jié)構(gòu)分析

將氣味受體家族的每個(gè)成員的基因序列與編碼區(qū)序列提交到在線基因結(jié)構(gòu)分析工具 GSDS 2.0[30]（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）中，獲得基因序列的內(nèi)含子與外顯子位置信息。

1.4 基序分析

使用在線工具M(jìn)EME 4.11.2[31]對(duì)Or序列的基序進(jìn)行分析，設(shè)定motif長(zhǎng)度在15—30，每個(gè)motif包含的位點(diǎn)最少7個(gè)，每個(gè)序列都進(jìn)行10個(gè)motif的檢索，其他參數(shù)均為默認(rèn)參數(shù)。

1.5 多序列比對(duì)及進(jìn)化分析

使用clustalW 2.1[32]進(jìn)行多序列比對(duì)，利用TrimAl 1.2[33]去除冗余的片段（參數(shù)-resoverlap 0.8 -seqoverlap 80-gt 0.7），使用phyML 3.0[34]進(jìn)行建樹，替代模型為JTT，bootstrap為1 000次。

2 結(jié)果

2.1 蘭州熊蜂氣味受體序列鑒定

利用地熊蜂與意大利蜜蜂氣味受體蛋白序列作為參考序列，通過tblastn搜索蘭州熊蜂基因組獲得氣味受體，共獲得165個(gè)氣味受體蛋白序列，其中包括1個(gè)非典型氣味受體Orco、4個(gè)假基因和159個(gè)氣味受體。氣味受體家族序列長(zhǎng)度平均為392 bp，分子量為4.5 kD，等電點(diǎn)為7.97。共有41個(gè)序列預(yù)測(cè)到存在7個(gè)跨膜螺旋，81個(gè)序列預(yù)測(cè)到6個(gè)跨膜螺旋，且大部分序列都是缺少最后一個(gè)跨膜螺旋。從定位信息中發(fā)現(xiàn)Or 1—46、Or 58—68、Or 86—95、Or 128—139、Or 150—160分別串聯(lián)排布在染色體2、13、9、11和4上，Or 47—57與Or 70—84都串聯(lián)排布在15號(hào)染色體上（附表 1）。對(duì)序列分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)序列在兩種熊蜂中出現(xiàn)明顯的長(zhǎng)度差異（表 1）以及氨基酸位點(diǎn)的改變（圖1）。

2.2 基因結(jié)構(gòu)

對(duì)所有嗅覺受體基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Or 101序列最長(zhǎng)，超過13 kb，其第二內(nèi)含子長(zhǎng)度最長(zhǎng)（圖2-A）。在Or 102、127、148中均包含一個(gè)長(zhǎng)內(nèi)含子，導(dǎo)致這些基因序列的長(zhǎng)度都超過了10 kb。氣味受體家族基因序列外顯子個(gè)數(shù)為4—9個(gè)，其中Or 47—57的序列中外顯子數(shù)量最少，為4個(gè)；Or 128—161中外顯子的數(shù)量最多，為9個(gè)。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)不同，可將所有序列分為10個(gè)類型，分別為Or 1—38、39—46、47—57、58—68、69—85、86—96、97—100、101—107、116—127、128—164，每個(gè)類型中的序列都有相似的外顯子長(zhǎng)度與數(shù)量。其中，Or 1—38、69—85、128—164這3個(gè)類型所包含成員數(shù)較多（分別為38、17、37），其他7類包含成員個(gè)數(shù)都約10個(gè)，Or 1 —38所有成員都具有較長(zhǎng)的第一外顯子。

圖1 蘭州熊蜂與地熊蜂氣味受體序列氨基酸差異位點(diǎn)Fig. 1 Different amino acid site of Or sequences of B. lantschouensis and B. terrestris

2.3 保守基序分析

對(duì)所有蛋白序列進(jìn)行保守基序分析（圖 2-B），在檢索的10個(gè)保守基序中（圖3），除基序5為未知基序外，其他9個(gè)基序均包含在其保守結(jié)構(gòu)域（7tm_6 domain）中。10種基因結(jié)構(gòu)類型序列中Or 1—38與39—46、47—57與86—95、89—85與97—100具有相似的保守基序。在Or 1—46中大部分序列包含全部10個(gè)基序，其他序列中均缺失基序10；在Or 47—57與86—95中，除序列89序列長(zhǎng)度缺失外，其他序列中僅缺少基序10；Or 58—68中主要缺少基序6與7；Or 69—85與Or 97—100中主要缺少基序6；Or 115 —127中除了缺失基序6之外，還缺少普遍存在基序1 與5；Or 128—164的序列中都缺少了基序7。在大部分序列中都包含了基序2、3、4、9，這4個(gè)基序可能為該家族關(guān)鍵的功能區(qū)域。

表1 蘭州熊蜂與地熊蜂中Or序列長(zhǎng)度差異Table 1 Difference of Or sequence length between B. lantschouensis and B. terrestris

圖2 蘭州熊蜂氣味受體基因結(jié)構(gòu)與保守基序Fig. 2 Gene structure and conserved motif of Ors in B. lantschouensis

圖3 氣味受體家族蛋白序列中的保守基序及其序列LogoFig. 3 Sequences Logo of the MEME defined conserved motifs observed among odorant receptors proteins

2.4 氣味受體家族進(jìn)化樹

以O(shè)rco作為外群，利用地熊蜂、蘭州熊蜂、意大利蜜蜂的全部氣味受體蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，Or家族明顯被分為5個(gè)亞家族（I—V）。所有BlOr 58—68成員都聚為亞家族I，BlOr 97—100與BlOr 69—85聚為亞家族II，BlOr 128—164聚為亞家族III，BlOr 86—95、101—107、47—57、1—46聚為亞家族IV，BlOr 110—127聚為亞家族 V。在亞家族 III中，BlOr 150—155與AmOr 122—139分別聚為兩個(gè)分支，在亞家族IV的中，BlOr 47—57與AmOr 63—65也發(fā)現(xiàn)類似的聚類，這表明在進(jìn)化中，蜜蜂與熊蜂的Ors出現(xiàn)了特異性的擴(kuò)張與缺失。在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)BlOr 115較早與其他成員分離，位于樹的基部，而且在結(jié)構(gòu)域分析中 Or115中包含的保守基序較少，說明該序列更為接近氣味受體家族的祖先序列。

圖4 意大利蜜蜂、地熊蜂、蘭州熊蜂Ors 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of odorant receptors from A. m. ligustica, B. terrestris and B. lantschouensis

3 討論

氣味受體家族是昆蟲化學(xué)感受器家族中一類重要的蛋白家族，在昆蟲的生存及繁衍生息中都發(fā)揮十分重要的作用[12]。目前在許多昆蟲中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣味受體家族的存在，例如在果蠅中發(fā)現(xiàn)存在62個(gè)氣味受體[15]，家蠶中存在60個(gè)[19]，金小峰中發(fā)現(xiàn)300個(gè)[20]，螞蟻中多達(dá)400個(gè)[21]。在不同的昆蟲中，Or家族的成員數(shù)量差異很大，這可能是由于在長(zhǎng)期進(jìn)化中，不同物種對(duì)嗅覺的依賴程度不同而造成。熊蜂與蜜蜂中假基因的個(gè)數(shù)比果蠅與蚊類中要多，但是遠(yuǎn)少于哺乳動(dòng)物中的假基因（比例高達(dá)25%—100%）[35]。在鑒定的所有氣味受體中，包括一個(gè)非典型氣味受體Orco，這個(gè)蛋白與果蠅中的 DmOr83b同源，序列相似度為61.41%，與蜜蜂中的AmOr2相似度為76.88%，與地熊蜂中的Orco相似度為99.17%[36]，這表明該蛋白在不同物種之間高度保守，可以作為判斷昆蟲進(jìn)化參數(shù)。在蘭州熊蜂中，Or家族的成員共有165個(gè)基因，其中包括5個(gè)假基因，與地熊蜂中氣味受體家族成員數(shù)目相同，在聚類分析中也出現(xiàn)一一對(duì)應(yīng)的現(xiàn)象，這可能是由于它們具有較近的親緣關(guān)系，導(dǎo)致氣味受體序列之間相似度很高，同時(shí)這說明這兩種熊蜂中對(duì)各種化學(xué)氣味識(shí)別機(jī)制有可能相近。但是通過對(duì)序列的分析發(fā)現(xiàn)，兩種熊蜂的某些氣味受體在序列長(zhǎng)度與氨基酸的變異程度上有十分明顯的差異（表1、圖1），這說明在蘭州熊蜂中氣味受體序列可能開始出現(xiàn)特異性改變。

BlOr家族成員存在串聯(lián)分布于某條染色體上的現(xiàn)象，這些串聯(lián)序列具有相似的基因結(jié)構(gòu)，表明 Or家族的起源可能是通過祖先序列的多重復(fù)制產(chǎn)生。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)Or家族包含5個(gè)亞家族，10種類型的基因結(jié)構(gòu)，在亞家族IV的BlOr 1—46分支中，所有成員的序列中包含一個(gè)特有的保守基序10，該基序可能使它們具有特有的功能，而且該分支與蜜蜂中AmOr 1 —61聚在一起，AmOr 1—61是已知的昆蟲化學(xué)感受器中最大的串聯(lián)重復(fù)，其中包含一個(gè)已經(jīng)明確功能的成員AmOr 11，該成員只對(duì)蜂王信息素中9-氧代-癸二烯酸（9-ODA）產(chǎn)生特異反應(yīng)[37]。在另一個(gè)成員較多的亞家族IV中，成員序列都含有9個(gè)外顯子，與蜜蜂中一個(gè)同樣包含 9個(gè)外顯子的亞家族 AmOr 97— 113、122—140、159、162聚在一起，該亞家族在螞蟻中也存在，而且被鑒定為一類參與認(rèn)巢及同伴識(shí)別的表皮烴類受體[31-32,34]。

在序列拼接中發(fā)現(xiàn)，BlOr 162—164的第一外顯子與其他外顯子的編碼方向相反，其位置處于其他外顯子的下游，這種反式剪切的現(xiàn)象在蜜蜂的氣味受體AmOr 140中首次被發(fā)現(xiàn)[36]，本文的結(jié)果也證實(shí)了這種現(xiàn)象的存在。

在蜜蜂中這些氣味受體與蜜蜂觸角葉神經(jīng)小球的數(shù)目相似，而且具有一個(gè)近似一對(duì)一的關(guān)系，這說明一個(gè)嗅覺神經(jīng)元可能僅表達(dá)一個(gè)氣味受體蛋白，而且觸角葉神經(jīng)的軸突突觸為單個(gè)小球[36]，果蠅中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[4,8,38]。在蜜蜂中發(fā)現(xiàn)Ors數(shù)量遠(yuǎn)超于果蠅，這可能是由于蜜蜂主要食物為花蜜和花粉，長(zhǎng)期進(jìn)化使得其需要更多Ors識(shí)別不同的花香及其復(fù)雜社會(huì)行為[36]。熊蜂進(jìn)化程度低于蜜蜂，雖在社會(huì)性及采集能力上不及蜜蜂，但是對(duì)于一些特定作物如茄科植物的授粉能力卻高于蜜蜂，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)樾芊渑c蜜蜂中Ors差異所致。關(guān)于熊蜂與蜜蜂之間Ors差異研究較少，故對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析有助于揭示其重要功能進(jìn)化，進(jìn)一步幫助揭示蜜蜂中復(fù)雜的社會(huì)行為。

4 結(jié)論

通過對(duì)蘭州基因組的鑒定獲得165個(gè)氣味受體家族成員，包含1個(gè)非典型氣味受體Orco，5個(gè)假基因，159個(gè)氣味受體。該家族中包含有多個(gè)亞家族，家族內(nèi)成員之間具有相似的基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)化中由于蜜蜂與熊蜂物種的分化，導(dǎo)致氣味受體在進(jìn)化中發(fā)生了物種特異性的擴(kuò)展與缺失。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification and Characteristics of Odorant Receptors in Bumblebee, Bombus lantschouensis

WANG Ye, HAN Lei, DONG Jie, HUANG JiaXing, WU Jie
(Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology of the Ministry of Agriculture, Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093)

Bombus lantschouensis; odorant receptors; gene structure; conservative motif; phylogenetic analysis

2016-11-01；接受日期：2016-12-16

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-45）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新中心工程項(xiàng)目（CAASASTIP-2016-IAR）

聯(lián)系方式：王燁，E-mail：wangye9276@foxmail.com。通信作者吳杰，Tel：010-62591543；E-mail：apis@vip.sina.com。通信作者黃家興，E-mail：huangjiaxing@caas.cn

Abstract:【Objective】Bumblebee Bombus lantschouensis is one of the most important pollinators for wild plants and crops in North China. Odorant receptors (Ors) gene family from the genome of B. lantschouensis was identified and characterized. Result of this study will help to explore the function of this gene family in foraging, mating and other social behaviors in bumblebee.【Method】Genomic DNA of thorax of B. lantschouensis was extracted and sequenced by the high-output of next generation sequencing. The original sequence of the sequencing was quality controlled and assembled to the genomic sequence. The contigs and scaffolds were used to build local sequence database. Gene sequences of Bombus terresters and Apis mellifera ligustica were used to query the local database. The characteristics and gene structure of Ors were analyzed by EMBOSS1.5 and GSDS2.0 software, respectively. Conservative motif analysis of amino acid sequences was performed using MEME 4.11.2. The phylogenetic analysis of Ors of B. lantschouensis, B. terresters and A. mellifera was studied by ClustaW 2.1, TrimAl 1.2 and PhyML3.0.【Result】One hundred and sixty-five Ors were identified from the genome of B. lantschouensis, including an Orco, 5 pseudogenes and 159 Ors. Gene structure analysis showed that the number of exons of these Ors are varies from 4 to 9. The least number of exons found in Or 47-57 was 4 and the largest number of exons found in Or 128-161 was 9. According to gene structure, Or was classified into 10 groups. Similarity in exon lengths and numbers was identified in the sequence of each group. The numbers of subgroup members were about 10, except in Or 1-38, Or 69-85 and Or 128-164 (which has 38, 17 and 37 members, respectively). The members of each subgroup are arranged in tandem on chromosomes and Or 1-38 have a longer first exon. Conserved motif analysis revealed that 9 motifs are present in Ors conserved domains (7tm_6 domain) except for motif 5 in all 10 motifs. While Or 1-38 and Or 39-46 have all predicted motifs and motifs 2, 3, 4, and 9 are widely present in sequences, which may be the key functional regions of the family. Phylogenetic analysis showed the 5 subfamilies of Ors family. Whereas the subfamily II contains 2 groups (BlOr 97-100 and BlOr 69-85) and subfamily V contains 4 groups (BlOr 1-46, 47-57, 86-95 and 101-107). BlOr 150-155 and AmOr 122-139 were clustered into two branches, and similar phenomena were also found in BlOr 47-57 and AmOr 63-65. It indicates that Ors has species-specific loss or expansion in evolution of Apis and Bombus. Or 115 is located at the base of the tree, suggesting that the sequence may be closer to the ancestor sequence of the odor receptor family.【Conclusion】Numbers, gene structure and phylogenetic relationships of Ors from the genome of B. lantschouensis were clarified in current study. Conserved motif analysis indicated that motif has been missed during the evolution of Ors family among bees. These results would provide an important information for exploring the gene evolution and function of Ors in future.