陸霞娟 周 敏 瞿春瑩 葛文松 陳穎偉#

上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院消化內(nèi)科1(200093) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科2

炎癥性腸病患者血清膽汁酸譜的研究*

陸霞娟1周 敏2瞿春瑩2葛文松2陳穎偉2#

上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院消化內(nèi)科1(200093) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：炎癥性腸病(IBD)發(fā)病率不斷升高，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸代謝紊亂在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的病理進(jìn)程中起重要作用，但其與IBD發(fā)病的相關(guān)性尚未見報道。目的：探討IBD患者血清膽汁酸譜的變化。方法：選取上海新華醫(yī)院7名健康對照、15例潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和16例克羅恩病(CD)，采用高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測血清膽汁酸譜。結(jié)果：與對照組相比，UC和CD患者血清初級膽汁酸膽酸(CA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、甘氨膽酸(GCA)、?；悄懰?TCA)、甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)含量無明顯差異(P>0.05)；UC患者次級膽汁酸去氧膽酸(DCA)含量顯著降低(P<0.05)，CD患者甘氨去氧膽酸(GDCA)和牛磺去氧膽酸(TDCA)含量顯著降低(P<0.05)，UC和CD患者血清石膽酸(LCA)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：IBD患者血清膽汁酸譜發(fā)生顯著改變，提示其可能參與IBD病理進(jìn)程。

膽汁酸類和鹽類； 炎癥性腸??； 結(jié)腸炎,潰瘍性； Crohn病

近年青少年和青壯年炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的發(fā)病率不斷升高，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。IBD主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，目前尚缺乏有效的治療手段。IBD進(jìn)展過程中伴隨營養(yǎng)不良、腸梗阻、穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，疾病后期易誘發(fā)結(jié)腸癌的發(fā)生。既往研究報道表明，膽汁酸代謝紊亂在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的病理進(jìn)程中起有重要作用，然而其與IBD發(fā)病進(jìn)程的相關(guān)性未見報道。本研究通過檢測IBD患者血清膽汁酸譜的改變，旨在初步探討膽汁酸譜改變在IBD病理進(jìn)程中的可能作用和意義。

對象與方法

一、研究對象

選取2011年7月—2013年9月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院31例IBD患者(15例UC患者和16例CD患者)，診斷經(jīng)內(nèi)鏡和病理檢查證實(shí)。15例UC患者中，男9例，女6例，年齡13～39歲，平均24.9歲。16例CD患者中，男11例，女5例，年齡0～37歲，平均20.8歲。同時選取2013年1月—2013年6月7名健康志愿者作為對照，其中男3名，女4名，年齡12～33歲，平均21.2歲。本研究方案通過上海新華醫(yī)院倫理委員會審批同意，并均取得受試者的知情同意。

二、研究方法

1.主要材料：均購自Waters公司，包括流動相水相(0.1%甲酸)、有機(jī)相(95% ACN、5% MeOH、0.1%甲酸)；色譜柱：BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；膽酸內(nèi)標(biāo)：1.5 μmol/L CA-D4、1.5 μmol/L CDCA-D4和1.5 μmol/L LCA-D4；實(shí)驗(yàn)使用的膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品包括膽酸(CA)、甘氨膽酸(GCA)、?；悄懰?TCA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)、去氧膽酸(DCA)、甘氨去氧膽酸(GDCA)、?；侨パ跄懰?TDCA)、熊去氧膽酸(UDCA)、甘氨熊去氧膽酸(GUDCA)、?；切苋パ跄懰?TUDCA)、石膽酸(LCA)、葡糖石膽酸(GLCA)、?；鞘懰?TLCA)、豬膽酸(HCA)、葡糖豬膽酸(GHCA)、?；秦i膽酸(THCA)、α-鼠膽酸(α-MCA)、?；铅?鼠膽酸(T-α-MCA)、β-鼠膽酸(β-MCA)、?；铅?鼠膽酸(T-β-MCA)、ω-鼠膽酸(ω-MCA)、?；铅?鼠膽酸(T-ω-MCA)、豬去氧膽酸(HDCA)、葡糖豬去氧膽酸(GHDCA)、?；秦i去氧膽酸(THDCA)、鼠膽酸(muroCA)、去氫膽酸(DHCA)、葡糖去氫膽酸(GDHCA)、?；侨淠懰?TDHCA)、3-去氫膽酸(3-DHCA)、7-去氫膽酸(7-DHCA)、異去氧膽酸(isoDCA)、原膽酸(apoCA)、6-酮基石膽酸(6-KLCA)、7-酮基石膽酸(7-KLCA)、12-酮基石膽酸(12-KLCA)、23-去甲脫氧膽酸 (23norDCA)、去氫石膽酸(DHLCA)。含重氫的膽酸內(nèi)標(biāo)石膽酸-2,2,4,4-D4(LCA-D4)和膽酸-2,2,4,4-D4(CA-D4)購自Steraloid公司。

2.血清膽汁酸譜檢測方法[1-2]：取50 μL血清，加入150 μL甲醇和含重氫的膽酸內(nèi)標(biāo)(100 nmol/L CA-D4、LCA-D4)，混勻室溫放置10 min；20 000×g離心10 min，取160 μL上清置于離心管中，真空離心干燥90 min；加入40 μL有機(jī)相，1 000×g震蕩復(fù)溶10 min；加入40 μL水相，1 000×g震蕩復(fù)溶10 min；18 000×g離心10 min；取70 μL上清，上高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀(Waters公司)進(jìn)行檢測。采用MassLynx 4.1軟件(Waters公司)進(jìn)行膽汁酸譜分析和定量。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清初級膽汁酸譜改變

與對照組相比，UC和CD患者血清非結(jié)合型初級膽汁酸CA、CDCA和結(jié)合型初級膽汁酸GCA、TCA、GCDCA水平均無明顯差異(P>0.05)(表1)。

二、血清次級膽汁酸譜改變

與對照組相比，UC患者血清DCA含量顯著降低(P<0.05)，而CD患者無明顯差異(P>0.05)；CD患者GDCA和TDCA顯著降低(P<0.05)，而UC患者無明顯差異(P>0.05)；UC和CD患者血清LCA含量均顯著降低(P<0.05)；UC和CD患者血清TUDCA、GUDCA、UDCA和TLCA含量均無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表1 各組初級膽汁酸譜

表2 各組次級膽汁酸譜

*與對照組比較，P<0.05

討 論

近年發(fā)現(xiàn)，25%～30%的IBD患者為兒童和青少年，嚴(yán)重影響患者的身心發(fā)育和生活質(zhì)量。IBD重要的病理特征之一為持續(xù)不斷和反復(fù)發(fā)作的慢性腸道炎癥，不斷累積的病理變化最終發(fā)展為結(jié)腸癌等相關(guān)惡性病變，但目前尚缺乏行之有效的治愈手段。腸道與肝臟有著共同的胚胎起源，兩者并非為兩個相互獨(dú)立的器官，在各種解剖和生物學(xué)功能上存在很多內(nèi)在的聯(lián)系。腸肝循環(huán)是負(fù)責(zé)膽汁酸從肝臟運(yùn)送到小腸并重新回到肝臟的重要機(jī)制。膽汁酸的腸肝循環(huán)依賴于回腸末端和結(jié)腸對膽汁酸的重吸收。

最新研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸代謝紊亂在腸道炎癥發(fā)展中起有重要作用[3]。膽汁酸不僅參與了膽汁的形成、膽固醇消除、腸道吸收脂類和脂溶性分子等生理過程，還可作為信號分子在調(diào)控能量平衡、炎癥和肝臟再生中起重要作用[4-7]。研究證實(shí)過氧化物酶體增殖物激活受體α-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(PPARα-UGTs)信號通路是膽汁酸平衡的重要決定因素。在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中，腸道PPARα-UGTs信號通路被激活，導(dǎo)致膽汁酸在炎癥結(jié)腸組織中積聚。UGTs加速代謝消除膽汁酸，由此降低其在小腸細(xì)胞中的水平。細(xì)胞內(nèi)膽汁酸下降使法尼酯衍生物X受體-成纖維細(xì)胞生長因子15(FXR-FGF15)信號受到抑制，導(dǎo)致肝臟膽固醇7α羥化酶(cholesterol 7α hydroxylase,CYP7A1)上調(diào)，促進(jìn)新膽汁的合成。

膽汁酸從來源上可分為初級膽汁酸和次級膽汁酸。肝細(xì)胞內(nèi)以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸稱為初級膽汁酸，可分為非結(jié)合型和結(jié)合型兩種。初級膽汁酸在腸道中受細(xì)菌的作用，進(jìn)行脫羥作用生成的膽汁酸，稱為次級膽汁酸。膽固醇首先在CYP7A1的催化下生成中間產(chǎn)物，然后經(jīng)還原、羥化和加輔酶A等多步反應(yīng)生成初級游離膽汁酸，最后與甘氨酸或?；撬嵝揎椛沙跫壗Y(jié)合膽汁酸[8-9]。部分膽汁酸由膽鹽輸出泵和多藥耐藥蛋白排入膽管，另一部分通過多藥耐藥相關(guān)蛋白和組織相容性轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入門靜脈[10-11]。膽管中的膽汁酸匯集到膽囊，膽囊收縮將其排入腸道，在腸內(nèi)被腸道細(xì)菌代謝成為次級膽汁酸。游離的次級膽汁酸在小腸和結(jié)直腸通過擴(kuò)散作用被動運(yùn)輸和被重吸收。結(jié)合次級膽汁酸在回腸通過鈉離子依賴的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體主動吸收進(jìn)入小腸黏膜細(xì)胞并與回腸膽汁酸結(jié)合蛋白結(jié)合，由基側(cè)膜的終末腔面鈉鹽依賴的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體重吸收至門靜脈中，然后經(jīng)?；撬徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被肝細(xì)胞重新攝取[12]。通過腸肝循環(huán)，約95%的膽汁酸被重吸收入肝臟后再利用，5%由糞便排出丟失。因此，腸黏膜疾病可影響膽汁酸的重吸收，通過檢測血清膽汁酸可反映腸黏膜功能。IBD可導(dǎo)致發(fā)作與緩解交替的腸道黏膜屏障損傷，目前尚未見關(guān)于IBD患者膽汁酸代謝情況的報道。

本研究通過血清膽汁酸譜檢測發(fā)現(xiàn)IBD患者血清初級膽汁酸含量有所升高，但與對照者相比并無明顯差異；IBD患者次級膽汁酸明顯降低。在CD患者中，GDCA和TDCA顯著下降，可能與CD的主要病變好發(fā)部位為回腸末端有關(guān)。GDCA和TDCA屬結(jié)合型膽汁酸，主要在回腸主動重吸收。在UC患者中，DCA顯著下降，其屬游離膽汁酸，在結(jié)直腸以被動重吸收為主，其下降與UC的病變部位有關(guān)。血清LCA在UC和CD患者中均顯著下降，提示LCA在IBD病理進(jìn)程中可能起有重要作用。LCA可與維生素D受體結(jié)合，動物實(shí)驗(yàn)[13]發(fā)現(xiàn)，在維生素D缺乏大鼠中，補(bǔ)充LCA可替代維生素D在體內(nèi)的活性功能。研究顯示IBD患者普遍缺乏維生素D[14]，推測IBD患者膽汁酸LCA降低可能會加重維生素D的缺乏。FXR是維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控因子，具有抗炎的作用[3,15]。膽汁酸LCA是FXR有效激動劑，IBD患者LCA減少可能會加重腸炎和膽汁酸代謝的失衡。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)IBD患者血清膽汁酸譜發(fā)生顯著改變，提示膽汁酸代謝紊亂在IBD病理進(jìn)程中起有重要作用，可能為現(xiàn)有結(jié)腸炎的治療提供了新的視角。

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(2016-12-27收稿；2017-02-05修回)

Serum Bile Acid Profile in Patients with Inflammatory Bowel Disease

LUXiajuan1,ZHOUMin2,QUChunying2,GEWensong2,CHENYingwei2.

1DepartmentofGastroenterology,KongjiangHospitalofShanghaiYangpuDistrict,Shanghai(200093);2DepartmentofGastroenterology,XinHuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai

CHEN Yingwei,Email:way-01chen@163.com

Bile Acids and Salts; Inflammatory Bowel Disease; Colitis,Ulcerative; Crohn Disease

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.05.009

*本課題由國家自然基金項(xiàng)目(批準(zhǔn)號81370485)資助

#本文通信作者，Email:way-01chen@163.com

Background:The incidence of inflammatory bowel disease (IBD) is increasing in recent years,and the etiology and pathogenesis of IBD remain unclear.Studies showed that disorder of bile acid metabolism plays an important role in the pathological process of experimental colitis.However,serum bile acid profile in IBD patients has not been reported.Aims:To investigate the changes of serum bile acid profile in patients with IBD.Methods:Seven healthy controls,15 patients with ulcerative colitis (UC) and 16 patients with Crohn’s disease (CD) at Shanghai Xin Hua Hospital were enrolled.High-performance liquid chromatography-mass spectrometry was used to determine serum bile acid profile.Results:No significant differences in serum concentrations of primary bile acid cholic acid (CA),chenodeoxycholic acid (CDCA),glycocholic acid (GCA),taurocholic acid (TCA),glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were found between UC or CD and controls (P>0.05).Compared with controls,serum concentration of secondary bile acid deoxycholic acid (DCA) in UC patients was significantly decreased (P<0.05),glycodeoxycholic acid (GDCA),taurodeoxycholic acid (TDCA) in CD patients were significantly decreased (P<0.05),serum concentration of lithocholic acid (LCA) in UC and CD patients was significantly decreased (P<0.05).Conclusions:The serum bile acid profile in IBD patients is significantly changed,which suggests that it may be involved in the pathological process of IBD.